Abstract
Histologisk evaluering av muskelbiopsi har fungert som et uunnværlig verktøy i forståelsen av utvikling og progresjon av patologi av nevromuskulære sykdommer. Men for å gjøre det, trenger riktig omsorg for å bli tatt når excising og bevare vev for å oppnå optimal farging. En metode for vev bevaring innebærer fikse vev i formaldehyd og deretter bygge dem med parafinvoks. Denne metoden bevarer morfologi godt og tillater langtidslagring ved romtemperatur, men er tungvint og krever håndtering av giftige kjemikalier. Videre formaldehyd fiksering resulterer i antigen kryssbinding, noe som nødvendiggjør antigen hente protokoller for effektiv immunfarging. Tvert imot, ikke frosset snitte krever fiksering og beholder derfor biologisk antigen konformasjon. Denne metoden gir også en klar fordel i rask tur rundt tid, noe som gjør det spesielt nyttig i situasjoner som trenger rask histologisk evaluering som intraoperative kirurgiske biopsier. Her beskriver vi den mest effektive metoden for å forberede muskelbiopsi for visualisering med forskjellige histologiske og immunologiske flekker.
Introduction
Undersøkelse av muskel histologi spiller en avgjørende rolle i forståelsen av ulike typer nevromuskulære lidelser 1-4. Når det kombineres med andre teknikker, gjør det forskerne å få et bedre inntrykk av manifestasjon og progresjon av patologi og kan også være avgjørende for å evaluere effekten av en terapeutisk intervensjon 5-10. Imidlertid, for å være nøyaktig, vev må bli bevart på riktig måte for å bevare den fysiologiske tilstanden umiddelbart før fjerning. Dette krever stor forsiktighet ved fjerning, bevaring, seksjonering, og farging.
Vev kan være forberedt på to forskjellige måter for lys mikroskopisk undersøkelse. Den første metoden, formalinfiksert parafin innebygd (FFPE) seksjoner, krever vev å være løst i 10% naturlig bufret formaldehyd før de blir integrert med parafinvoks 11,12. Fiksering trinn bidrar til å bevare morfologi bedre, men også tverrforbindelser endogen proteins noe som nødvendiggjør komplisert antigen hentefremgangsmåter for farging og eliminerer muligheten for enzymatiske flekker på slike seksjoner 12. Frosne seksjoner, på den annen side, trenger ikke å være pre-fast eller prosessert; Derfor proteiner er i stand til å beholde innfødte biologiske konformasjoner 13,14. Videre frosne seksjoner også gir mulighet for rask behandlingstid, som til tider er nødvendig, for eksempel i intraoperativ diagnostisering av sarkomer og andre kirurgiske biopsier 15. Imidlertid, hvis det ikke gjøres ordentlig, er denne metoden utsatt for frostskade, som innfører endringer i muskelen arkitektur gjør seksjonene uegnet for histologisk undersøkelse. Denne oppgaven vil skissere den mest effektive metoden for å forberede muskelbiopsi for å oppnå optimal farging for skikkelig undersøkelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tissue Harvest og frysing av muskelvev
- Avlive musen med en overdose av isofluran (2-klor-2- (difluormetoksy) -1,1,1-trifluor-etan). Utfør dette trinnet i et avtrekksskap og bruke en sekundær containment metode som eksikkator eller en glassklokke med en bomullsdott dynket i isofluran.
- Bekreft død ved å ta godt klemme footpad. Bruk en sekundær metode for aktiv dødshjelp som halsdislokasjon.
- Fukt pelsen med 70% alkohol for å redusere stikker av løse hårstrå på musklene. Skrelle den greinen bruke en fin pinsett som # 5.
- Skille nøye muskel av interesse (tibialis anterior (TA) i dette tilfellet) fra beina under, fra senen og fjerne.
- Eksisere muskel, dekke det i OCT (Optimal Cutting Temperature compound), og legg den flatt på en merket engangs frysing mold. Sørg for at muskelen er på sitt normale fysiologiske orientering (hodet til tail) uten å strekke. Alternativt fryse muskelen på små styrofoam firkanter og pin den med insekt pinner for å sikre riktig lengde på musklene.
- Chill 2-metylbutan (isopentan) i et stålbegerglass ved hjelp av flytende nitrogen. Dette tar på gjennomsnittlig 3 - 5 min. Rør intermitterende inntil hvite utfellinger begynner å dannes på bunnen og veggene av begeret.
MERK: Når dette skjer, har isopentan nådd optimal frysetemperatur (-150 ° C) - Dypp formene inneholder muskler i kjølt 2-methylbutane. Fryse små muskler som membranen og extensor digitorum longus (EDL) for 6 - 12 s og større muskler som gastrocnemius soleus (GS) og triceps for 15 - 20 sek. Ikke frys musklene for lenge, da dette kan føre til sprekkdannelser.
- Overfør de frosne vev på tørris og la isopentan fordampe (merk at denne prosessen tar i gjennomsnitt rundt 15 - 20 min). Pakk vevet inn i aluminiumsfolie og lagre dem på ultra lav temperatur (-70 ° C til -80 ° C) inntil seksjonering.
2. Inkludering vev i oktober klargjør Tissue Block
- Transport vev på tørris til cyrostat å hindre tining. Overføring vev til kryostaten kammer (satt ved -20 til -24 ° C for å unngå fullstendig tining av vev), og la dem ekvilibrere i 30 min.
- Snu Peltier bay kjøling på. Hvis kryostat ikke har denne kjøling, bruker aerosol kjølespray for å raskt fryse oktober Ikke la muskelen tine på noe tidspunkt i løpet av innebygging, da dette kan føre til frostskader.
- Legg et jevnt tynt lag av oktober på prøveplaten og la den avkjøles. Når det meste av oktober er frosset på bunnen mens de fortsatt flytende på toppen, setter vevet i riktig retning (vinkelrett oktober for tverrgående seksjoner og parallell til oktober for lengdesnitt). Bruk aerosol kjølespray for raskt å fryse oktober Berør unembeded del av vevet med varme extractor og vente i 45 sek.
- Legg til en annen tynt lag av oktober rundt muskelen, spray med aerosol kjølespray og trekke ut varmen som i forrige trinn.
- Hold legge oktober i små trinn og raskt fryse OCT ved hjelp av en kombinasjon av aerosol kjølespray og varmevifte til hele muskelen er dekket.
- Sett varmeavlednings på toppen av vevet blokken og vente på 5 min.
3. Klar Seksjoner og Identifisere seksjoner fra Midt-magen-regionen av musklene
- Monter prøven på prøvehodet. Stram knotten for å feste platen. Sørg for at prøveplaten er i god kontakt med prøvehodet.
- Juster kammertemperaturen til mellom -21 og -24 ° C, og vent til den innstilte temperaturen er oppnådd.
- Justere tykkelsen innstillingene (7 mikrometer); trimme blokken ved å fremme eller trekke blokken ved hjelp av grove og fine innstillinger.
- Samle seksjonenepå forvarmet positivt ladede objektglass ved å trykke på toppen av lysbildet på seksjonene, ved hjelp av tiltrekning mellom motsatte ladninger for å lette etterlevelse av kuttet deler til raset.
- Identifiser mellom magen seksjoner ved å måle tverrsnittsareal (CSA) av seksjonene. Gjør dette ved å bruke bildebehandlingsprogrammer på datamaskinen som er koblet til mikroskopet.
MERK: bilder fase kontrast er tatt og omkrets av hele muskelen blir målt via en tracing funksjonen på programmet. Dette vil gi både CSA samt minimum ilderen diameter (måling av fiber tverrsnittsstørrelse som er uttrykt som den minste avstand mellom to parallelle tangenter på motsatte sider av en partikkel) målinger. Merk: Når CSA og minimum ilder diameter målinger begynner å platå, har mid magen er nådd. - Inventar og arkivere lysbilder ved -80 ° C for fremtidig misfarging.
MERK: oktober ikke trenger å fjernes før staining prosedyrer. Når lysbildene er coverslipped, er de klare til å bli farget umiddelbart.
4. Farging
MERK: Mens detaljerte trinn-for-trinn prosedyrer kan bli funnet på produktdatablad og bør følges for fargingsprosedyrer, kan personlig optimalisering være nødvendig for å oppnå optimal farging.
- Fordi festematerialet (se tabell) ikke er blandbart med vann, tørke glir gjennom økende grader av alkohol (2 minutter hver i 70%, 95% og 100% etanol) og fjerne dem med xylen (100% i 5 min) for å sikre slides ikke blir ugjennomsiktig over tid.
- Dekkseksjoner og la dem tørke. Bilde med mikroskop utstyrt med bildebehandlingsprogrammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oppsettet for høsting og frysing av vev kan sees i figur 1. Skåret vev må lagres på et gasbind fuktet med PBS for å unngå tørking (figur 1A). Når vev er valgt for å brukes for histologisk analyse bør de dyppet i oktober og lagt ut på cryo formen i riktig orientering og så nær fysiologisk lengde som mulig for å sikre nøyaktig morfologi (figur 1B). Slurry av isopentan egnet for frysing vev kan oppnås ved avkjøling av isopentan i flytende nitrogen og omrøring inntil små hvite utfellinger nederst. På dette punktet, er media egnet for frysing (figur 1C). Vev skal fryses 6-15 sekunder i kaldt isopentan, avhengig av størrelsen / tykkelsen av vev (figur 1D). Etter frysing, vil muskelen vises kritthvite, på hvilket tidspunkt den skal lagres på tørris og senere overført til -80 <strong> ° C fryser.
Kryostat innstilling og ingredienser som er nødvendig for fremstilling av muskelen blokken ved gradvis å bygge vevet i oktober er vist i figur 2. Kryostaten bør settes mellom -20 og -24 ° C (figur 2A). Oktober og Freeze-Det bør være lett tilgjengelig for å lage blokk passer for seksjonering. Innsiden av kryostat bør ha små børster til å manipulere og flate kutt seksjoner for lysbilde lage samt pinsett for håndtering av vevsblokk fordi det aldri skal berøres med hendene for å sikre vevet forblir frosset (figur 2B). Oktober bør tilsettes vev for å skape snitting blokken, men bør umiddelbart frosset med Freeze-It spray og deretter ytterligere avkjølt med varmevifte på bildet (figur 2C). For tverrgående partier, bør vev plasseres på prøvehodet, slik at det er orientert vinkelrett i forhold til bladet (figur 2D). Settings bør justeres for å oppnå ønsket snittykkelse (5-10 mikrometer avhengig av vev).
Hvis frosset riktig vevet i ansiktet bør være kritthvite mens en vev som var frosset feil eller tint under monteringsprosessen vises rød / rosa. Figur 3 viser representative vev for feilaktig håndtert prøver (figur 3A) og riktig håndtert prøver (Figur 3B) .
Midten av buk-regionen blir bestemt ved å måle CSA og minimum ilder diameter ved hjelp av et mikroskop utstyrt med fasekontrastoptikk og programvare for bildeanalyse. En representant skjermbilde av analyse programvare er vist i Figur 4. Hematoxylin og eosin farget bilder av en skikkelig frosset og seksjonert biopsi sammen med en fryse skadet biopsi av tibialis anterior (TA) muskler er vist i figur 5. Seksjoner som er riktig behandlet vil ha konsekvent morphology og selv flekker hele (figur 5A). Feilaktig behandlet muskler som er fryse skadet eller for tidlig tint vil synes å ha flere brudd i morfologi og har utseende av "strimlet hvete" (figur 5B). Figur 6 viser fuktet kammer for optimal immunfarging. Lysbilder skal være dekket med parafilm, holdt på et vått papirhåndkle, og forseglet i en liten boks for å unngå uttørking av seksjonene under farging. Figur 7 viser et eksempel immunhistokjemi lysbilde som er skikkelig forberedt og farget.
Figur 1. Forberedelse og satt opp for riktig vev frysing. (A) skåret vev bør lagres på gasbind dynket i PBS. (B) vev selectedfor histologiskeanalyse dyppet i oktober og lagt ut på cryo mold i riktig retning (fra magen til sene) og så nær fysiologisk lengde som mulig. (C) oppslemming av isopentan egnet for vev. Merk: små hvite utfellinger vises nederst. (D) Frozen vev etter å dyppe i isopentan. Merk:. Kritthvite utseendet Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Kryostat innstillinger og ingredienser som er nødvendige for seksjonering. (A) Cryostat ligger mellom -20 og -24 ° C med oktober og aerosol kjølespray lett tilgjengelig. (B) Inne oppsett av kryostat komplett med små børster til å manipulere og flate kutt delen elons for lysbilde lage samt pinsett for håndtering av vev blokken. (C) Frosset vev blokk klar til å bli avkjølt ved varmeavlednings (hvit pil). (D) Vevsblokk satt på montering hodet klar til å bli kuttet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Representative vev av riktig og feil bevarte muskler. (A) Feilaktig frossen eller håndteres (B) Riktig frosset og håndteres muskel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Fastsettelse av tverrsnittsarealet av TA muskel bruker Nikon bildebehandlingsprogrammer. Skjermbilde av fase kontrast bilde av muskel del som har blitt sirklet bruker forestille programvare for måling av CSA og min ilder diameter. Klikk her for å se en større versjon av denne figur.
Figur 5. Representative bilder av riktig og feil forberedt H & E farget muskler. (A) Riktig behandlet delen. (B) Feilaktig behandlet fryse skadet muskel delen. Vennligst click her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. fuktet kammer egnet til farging. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Eksempel på immunhistokjemi lysbilde av skikkelig forberedt og farget lysbilde. Slide har blitt farget med Fibronectin (grønn) og DAPI (blå). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Histologi og immunhistokjemi har blitt brukt som viktige verktøy for å forstå manifestasjon og progresjon av patologi i ulike nevromuskulære sykdommer. Klassisk, ble muskelbiopsi først løst i formaldehyd og deretter embedded med parafinvoks. Mens formaldehyd fiksering bevarer vevet arkitektur og lar vev lagring og transport ved RT, også inaktiverer det enzymer og tverrbindinger proteiner nødvendig ytterligere skritt for å oppnå nøyaktig farging. Dette problemet er eliminert ved bruk av frossen seksjoner men denne metoden gir unike tekniske utfordringer i å skaffe optimale fargeresultater og nøyaktig tolkning 14,15.
For det første er det vesentlig at prøvene fryses umiddelbart etter kirurgisk inngrep som autolyse og nedbrytning begynner kort tid etter fjerning fra kroppen. Vev må også fryses hurtig og grundig for riktig mengde tid som varierer avhengig av størrelsen/ Tykkelse av vevet. Dersom dette ikke blir gjort riktig, fryse skader vil oppstå rende vevet ubrukelig for histologisk evaluering. Etter frysing, må vev umiddelbart lagret på tørris og deretter overført til en ultra lav temperatur (-80 ° C) fryser inntil seksjonering. Det er viktig å merke seg at vevet ikke bør fjernes fra fryseren uten å være på tørris fordi frysing og tining vil også skade vevet arkitektur.
Et annet merke av betydning når du utfører histologisk analyse er å passe på å alltid analysere den samme delen av vevet av interesse å sikre ensartethet blant analyse. Dette kan gjøres for muskel seksjoner ved å utføre analyse av midbelly. Dette er den del av den muskel som er den tykkeste og derfor vil ha den største tverrsnittsareal. For å sikre at du faktisk seksjonering den midbelly, bør CSA av påfølgende seksjonene måles ved hjelp histologisk bildebehandlingsprogrammer. Måling utenentene bør fortsette å bli gjort før tverrsnittsarealet begynner å flate ut. Når dette skjer, har på midten buk er nådd; bare denne delen av vevet som skal brukes for histologisk analyse for å sikre ensartethet blant sammenligninger.
Etter seksjonering er gjennomført og lysbilder er utarbeidet, bør de få lov til å tørke ved romtemperatur i 1 - 2 timer. Tørking åpner for riktig etterlevelse av seksjonen til raset og hindrer også overflødig vann å krystallisere følgende overføring til -80 ° C fryser. Det er viktig å merke seg at slides bør også bare håndteres på tørris ved valg av lysbilder for analyse for å hindre fryse-tine-sykluser. Når lysbildene er valgt til farging, protokoller følger med flekken bør følges først på en prøveordning frem til optimale resultater er oppnådd. Når du utfører farging, er det viktig å sørge for at skred ikke tørke gjennom hele prosedyren. Tørking av skred kan føre til forbigående samhandlings å være intakt etter inkubasjon. Disse interaksjonene kan ikke fjernes ved vaskinger og føre til ikke-spesifikk farging. Tørking kan unngås ved å holde glir i en fuktig atmosfære. Utføre inkuberinger med deler dekket med parafilm og lysbilder på en fuktig tørkepapir forseglet i en liten lysbilde boks er tilstrekkelig for å sikre lysbilder vil ikke tørke på noe tidspunkt under prosedyren.
Histologi er et viktig verktøy i å visualisere morfologi og ulike aspekter av patologi. Mens noe trivielt, er det av største viktighet å ta stor forsiktighet i utarbeidelsen av vev som skal brukes til histologi. Fra excision til frysing, seksjonering og flekker, bør vev håndteres på en måte som vil unngå frostskader og gi de mest nøyaktige bilder mulig. Uten riktig bevaring, vil fargingen ikke nøyaktig gjenspeile fysiologi og dermed føre til feiltolking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat | Leica CM 1850 | Leica Microsystems Inc. | Buffalo Grove, IL 60089 U.S.A., office phone 1-800-248-0123 Alternative: Richard Allen Scientific |
| Microscope | Nikon Eclipse 50i | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternative: Olympus |
| Image analysis software | Nikon Imaging Software Basic Research | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternatives: Image J, Metamorph |
| Isoflurane | 14043-220-05 | JD Medical Dist. Co., Inc. | 1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 U.S.A. |
| OCT | 4583 | Sakura Inc. | Torrence, CA 90501 U.S.A. Alternative source: Leica Microsystem |
| Freeze It | 23-022524 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Disposable tissue mold | 22-363-554 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Colorfrost plus slides | 9991001 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Acetone | 650501-4L | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Ethyl alcohol | HC-1300-1GL | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| 2-methyl butane | M 32631-SL | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Xylene | HC-7001GA | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Cytoseal 280 | 8311-4 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Hematoxylin Gill #3 | CS402-1D | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Eosin | 6766007 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
References
- Bonnemann, C. G., et al. Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies. Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).
- Caughey, J. E., Pachomov, N. The diaphragm in dystrophia myotonica. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 22, 311-313 (1959).
- Fetterman, G. H., Wratney, M. J., Donaldson, J. S., Danowski, T. S. Muscular dystrophy. I. History, clinical status, muscle strength, and biopsy findings. AMA J Dis Child. 91, 326-338 (1956).
- Platzer, A. C., Chase, W. H. Histologic Alterations in Preclinical Mouse Muscular Dystrophy. The American journal of pathology. 44, 931-946 (1964).
- Mercuri, E., et al. Muscle magnetic resonance imaging involvement in muscular dystrophies with rigidity of the spine. Ann Neurol. 67, 201-208 (2010).
- Tasca, G., et al. Different molecular signatures in magnetic resonance imaging-staged facioscapulohumeral muscular dystrophy muscles. PloS one. 7, e38779 (2012).
- Girgenrath, M., Dominov, J. A., Kostek, C. A., Miller, J. B. Inhibition of apoptosis improves outcome in a model of congenital muscular dystrophy. The Journal of clinical investigation. 114, 1635-1639 (2004).
- Kumar, A., Yamauchi, J., Girgenrath, T., Girgenrath, M. Muscle-specific expression of insulin-like growth factor 1 improves outcome in Lama2Dy-w mice, a model for congenital muscular dystrophy type 1A. Human molecular genetics. 20, 2333-2343 (2011).
- Mehuron, T., et al. Dysregulation of matricellular proteins is an early signature of pathology in laminin-deficient muscular dystrophy. Skeletal muscle. 4, 14 (2014).
- Yamauchi, J., Kumar, A., Duarte, L., Mehuron, T., Girgenrath, M. Triggering regeneration and tackling apoptosis: a combinatorial approach to treating congenital muscular dystrophy type 1 A. Human molecular genetics. 22, 4306-4317 (2013).
- Sheriffs, I. N., Rampling, D., Smith, V. V. Paraffin wax embedded muscle is suitable for the diagnosis of muscular dystrophy. Journal of clinical pathology. 54, 517-520 (2001).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33, 845-853 (1985).
- Maccarty, W. C. The Diagnostic Reliability of Frozen Sections. The American journal of pathology. 5, 377-380 (1929).
- Shi, S. R., et al. Evaluation of the value of frozen tissue section used as 'gold standard' for immunohistochemistry. Am J Clin Pathol. 129, 358-366 (2008).
- Turan, T., et al. Accuracy of frozen sections for intraoperative diagnosis of complex atypical endometrial hyperplasia. Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP. 13, 1953-1956 (2012).
