Abstract
肌肉活检组织学评价曾担任在神经肌肉疾病的病理发展过程的理解不可或缺的工具。然而，为了这样做，适当的照料需要切除并保存组织，以达到最佳的染色时，必须考虑。组织保存的一种方法包括固定在甲醛组织，然后用石蜡包埋它们。此方法保留形态良好，并且允许长期储存于RT但是麻烦的，并且需要处理的有毒化学品。此外，甲醛固定导致抗原的交联，这需要抗原修复协议有效免疫染色。与此相反，冷冻切片不需要固定，如此保留生物抗原的构象。此方法还提供了一个明显的优势在周围时间快转，使得它在情况需要像intraopera快速组织学评估特别有用略去手术活检。这里，我们描述制备肌肉活检用于可视化具有不同的组织学和免疫染色的最有效的方法。
Introduction
检查肌肉组织学中起着不同类型神经肌肉疾病1-4中的认识至关重要的作用。当与其他技术相结合，它使研究人员能够更好地了解病理的表现和进展的，也可以是必需评估治疗干预5-10的功效。然而，要准确，组织需要以适当的方式被保留以便切除之前立即保持生理状态。这种去除，保存，切片，和染色过程中需要非常小心。
组织可以以两种不同的方式进行光学显微镜研究来制备。第一种方法，福尔马林固定的石蜡包埋（FFPE）的部分，需要组织到被嵌入石蜡11,12之前被固定在10％的天然缓冲甲醛。固定步骤，有助于更好地保存形态，而且交联内源性PRoteins因而需要复杂的抗原修复程序用于免疫染色和消除酶染色对这些部分12的可能性。冰冻切片，另一方面，不需要进行预固定或处理;因此，蛋白质能保留原生生物构13,14。此外，冷冻切片也允许快速的周转时间，这有时是必要的，例如在肉瘤和其他外科活组织检查15的术中诊断。但是，如果没有正确完成，该方法是容易冻结损坏，它引入了改变肌肉结构使得部分不适宜用于组织学检查。本文将概述准备肌肉活检，以达到正确检查最佳染色最有效的方法。
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Protocol
1。组织收获和肌肉组织的冷冻
- 安乐死的小鼠用异氟烷（2-氯-2-（二氟甲氧基）-1,1,1-三氟乙烷）的过量。执行此步骤在通风橱中并利用一第二容器的方法，如干燥器或钟罩含有棉签浸泡在异氟醚。
- 用力挤压脚垫确认死亡。使用安乐死的辅助方法，如颈椎脱位。
- 湿用70％酒精的皮毛，以减少对肌肉松弛头发缕粘着。用细镊子，如＃5剥离皮肤脱落的肢体。
- 小心地从骨骼中分离的兴趣（）在这种情况下，胫骨前（TA）的肌肉的下面，从肌腱开始并移除。
- 切除的肌肉，它覆盖在华侨城（最佳切削温度化合物），并把它平放在一个标有一次性冻结模具。确保肌肉在其正常的生理方向（头至大l）在不拉伸。可替代地，冻结小发泡胶正方形肌肉和利用昆虫针以确保肌肉的正确长度针它。
- 寒意2-甲基丁烷（异戊烷）中采用液氮钢制烧杯中。这平均需要3 - 5分钟。不断搅拌间歇直至白色沉淀开始形成在烧杯的底部和壁上。
注意：当这种情况发生时，异戊烷已达到最佳冷冻温度（-150℃） - 浸含在冷冻2-甲基丁烷肌肉的模具。冷冻小肌肉，如隔膜和趾长伸肌（EDL）6 - 12秒，较大的肌肉如腓肠肌比目鱼（GS）和肱三头肌15 - 20秒。不要冷冻肌肉太久，因为这可能会导致开裂。
- 转让的冷冻组织干冰，让异戊烷蒸发（注意，此过程平均需要大约15 - 20分钟）。包裹组织中铝箔并将其存储在üLTRA低温（-70℃〜-80℃），直到切片。
2.嵌入组织在OCT准备组织块
- 干冰运输组织，以cyrostat防止解冻。转移组织到低温恒温室（设定为-20至-24℃，以避免组织的充分解冻），并让他们平衡30分钟。
- 打开珀耳帖冷却海湾上。如果低温恒温器不具备这种冷却，使用喷雾冷却喷雾快速冻结十月不要让肌肉解冻的任何一点的嵌入，因为这可能会导致冻害期间。
- 添加均匀的薄层华侨城在试样上盘，让它冷却。当大多数的OCT被冻结在底部，同时仍然液体在顶部，插入在正确的方向的组织（垂直华侨城为横截面和平行华侨城为纵向部分）。使用喷雾冷却喷雾迅速冷冻十月触摸组织unembeded部分热转ractor并等待45秒。
- 添加另一个薄层OCT的周围的肌肉，喷洒气溶胶冷却喷雾和提取的热量作为在上一步。
- 在保持小幅度增加OCT和快速使用气溶胶喷雾冷却和加热萃取的结合冻结华侨城，直到整个肌肉被覆盖。
- 放的热量提取的组织块的顶部，等待5分钟。
3.准备部分和肌肉半山区肚识别章节
- 安装试样到样品头。拧紧旋钮固定盘。确保在试样圆盘与所述样品头良好的接触。
- 调节室内温度°之间-21和-24℃，等到设定温度达到。
- 其厚度调节设置（7微米）;修剪通过推进或使用粗，细设置缩回块的块。
- 收集部分通过按滑动的顶部上的部分中，使用相反电荷之间的吸引力，以方便切割部分以滑动的粘附预热带正电的显微镜载玻片。
- 通过测定各部分的横截面面积（CSA）识别中期腹部分。连接到显微镜的计算机上执行此操作使用图像处理软件。
注：相衬图像的拍摄和整个肌肉的圆周经由上的软件程序跟踪功能测定。这将产生两个CSA以及最小鼬直径（测量纤维横截面尺寸的被表示为对一个粒子相反两侧的两个平行切线之间的最小距离）的测量。注意：当CSA和鼬最小直径测量开始高原，肚皮中旬已经达到。 - 库存和归档的幻灯片在-80℃的未来染色。
注意：OCT不需要之前被除去以stainin摹程序。一旦载玻片盖上盖玻片，他们准备立即染色。
4.染色
注：虽然详细的一步一步的程序，可以在产品数据表中找到，并应遵循染色程序，个人优化可能需要以获得最佳的染色。
- 因为安装介质（见表）是不与水混溶的，通过分级醇增加脱水载玻片（每次2分钟，70％，95％和100％的乙醇），并清除它们用二甲苯（100％，5分钟），以确保幻灯片不会成为不透明随着时间的推移。
- 盖玻片部分，并让他们干。图片显微镜配备图像处理软件。
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Representative Results
该组向上收获和组织冷冻可以看出，在图1中 。切下的组织应存储在浸泡在PBS中，以避免在干燥（ 图1A）纱布。当组织被选择以用于组织学分析，他们应该被浸入OCT和布置在低温模具的正确方向，并尽可能接近生理长度尽可能以确保准确的形态（ 图1B）。异戊烷适于组织冷冻的浆液可以通过冷却的异戊烷在液氮中，并搅拌，直到小白色沉淀出现在底部来实现。在这点上，媒体是适合冷冻（ 图1C）。组织应该从6-15秒中冷却的异戊烷被冻结取决于组织（ 图1D）的尺寸/厚度。冻结之后，肌肉会出现白垩色，在这一点上，应保存在干冰，后转入-80 <STRONG>°C冰箱。
需要制备由逐渐嵌入在OCT中组织的肌肉块低温恒温器的设置和成分示于图2中的低温恒温器应在-20至-24℃（ 图2A）来设置。华侨城和冷冻它应该是随时可以创造适合切片块。低温恒温器里面应该有小刷子来操纵和切变平的部分幻灯片制作以及因为它不应该用手摸，以确保组织镊子处理组织块保持冻结（ 图2B）。 OCT应添加到组织以创建切片块，但应立即冷冻与冷冻它喷然后进一步冷却热提取图为（ 图2C）。为横截面，组织应放在样品头，以便它被定向垂直于刀片（ 图2D）。硒设置应调整，以达到所希望的切片厚度（5-10微米取决于组织）。
如果冻结了正确面对组织应垩白而被在安装过程不当冻结或解冻的组织会出现红色/粉红色。 图3显示了处理不当，样本代表性的组织（ 图3A）和妥善处理的样品（ 图3B） 。
中间腹区域是通过使用装有相衬光学和图像分析软件的显微镜测量CSA和最小鼬直径来确定。分析软件的代表性屏幕快照示于图4。苏木精和随着冷冻损坏活检曙适当冷冻并切片活检染色图像胫骨前（TA）的肌肉被示于图5。被适当处理将具有第一致morpholo曲线gy和甚至整个染色（ 图5A）。不当处理被冻结损坏或过早解冻将出现在形态学多个场所及有“碎小麦”（ 图5B）的外观的肌肉。 图6示出了加湿室，用于最佳免疫染色。载玻片应覆盖用封口膜，保持在湿纸巾，并在一个小盒子，以避免免疫染色过程中的部分的干燥密封。 图7示出了已被适当的准备和染色的样品免疫幻灯片。
图1.准备并设置适当的组织冻结。（A）切下的组织应存放在纱布浸泡在PBS。 （ 二）组织selectedfor组织分析蘸华侨城和正确的方向奠定了冷冻模（从肚子到肌腱），并尽可能接近生理长度越好。异戊烷（C）浆料适用于组织。注：小的白色沉淀出现在底部。 （ 四）在浸渍后异戊烷冷冻组织。注：垩白的外观，请点击此处查看该图的放大版本。
图必要切片2.低温恒温器设置和配料 。 （A）低温恒温器设置-20和-24℃，华侨城和气溶胶喷雾冷却一应俱全之间。 （ 二）内部设置恒温器完成与小刷子来操纵和扁平切割secti附件幻灯片制作以及镊子处理的组织块。 （C）冷冻组织块准备与吸热器（白色箭头）冷却。 （ 四）组织块上安装头准备削减设定。 请点击此处查看该图的放大版本。
图的正确和不正确保存肌肉代表性的组织。（A）冷冻不当或操作（B）妥善冷冻和处理肌肉。 请点击此处查看该图的放大版本。
使用尼康映像软件图4.确定TA肌肉的横截面积。截图肌肉部分相衬图像已使用想象的软件CSA和鼬最小直径测量盘旋的。 请点击此处查看本一个更大的版本图。
妥善和制备不当H＆E染色肌肉图5代表性的图像。（一 ）正确处理部分。 （ 二）加工不当损坏冻结肌肉部分。 请CLICK此处查看该图的放大版本。
图6.适合免疫湿盒。 请点击此处查看该图的放大版本。
图7.免疫组化示例正确处理并染色幻灯片。幻灯片的幻灯片已经沾上纤维连接蛋白（绿色）和DAPI（蓝色）。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
组织学和免疫组化已被用作主要的工具在理解表现和病理的进展在各种神经肌肉疾病。经典地，肌肉活检第一固定在甲醛，然后用石蜡包埋蜡。虽然甲醛固定保持组织结构，并允许组织存储和运输，在RT，这也灭活酶和蛋白质交联迫使进一步措施，以实现精确的免疫染色。这个问题与使用冰冻切片消除，但这种方法提出了获得最佳的染色效果和准确的诠释14,15独特的技术挑战。
首先，它是必不可少的样品被手术切除后立即冻结自溶和分解从体内清除后不久开始。组织还必须为时间，该时间取决于大小适量迅速和彻底冷冻/组织的厚度。如果不正确，冻结损坏会发生使该组织无用用于组织学评价。以下冷冻，组织必须被立即存储在干冰上，然后转移到超低温（-80℃）冷冻直至切片。要注意的是组织不应从冷冻机而不在干冰因为冻融也会损伤组织架构除去是很重要的。
另一个重要的音符时进行组织学分析是照顾到总是分析的感兴趣的组织的同一部分，以确保在分析均匀性。这可以为肌肉部分通过执行midbelly的分析来进行。这是肌肉是最厚的，因此，将有最大的横截面面积的一部分。为了确保你确实切片的midbelly，后续章节CSA应使用组织成像软件进行测量。 Measurem需求测试应继续进行，直至横截面积开始高原。一旦发生这种情况，中间腹部已经达到;只有这部分的组织应该用于组织学分析，以确保比较之间的均匀性。
经过切片已经完成，幻灯片已准备，他们应该被允许干在室温1 - 2小时。烘干允许部在滑动的适当的附着，还可以防止过量的水以结晶以下转移到-80℃的冷冻机中。要注意的是幻灯片应该也只能在干冰进行分析，以防止冻融循环选择幻灯片时处理是很重要的。一旦幻灯片已被选定为染色，协议包括污渍，应遵循先上试，直到达到最佳效果已经实现。当执行免疫染色，重要的是要确保幻灯片不整个过程中干燥。幻灯片的干燥会导致瞬时相互作用s至孵育后保持不变。这些相互作用不能在洗涤去除，并导致非特异性染色。干燥，可避免保持载玻片在潮湿的大气中。执行孵化用在潮湿纸巾的小滑动箱密封覆盖用封口膜和滑动部分足以确保在手术过程中的幻灯片不会干在任何点。
组织学是在可视化的形态和病理的不同方面的一个基本工具。虽然有点微不足道，这是最大的重视，采取非常谨慎的组织编制用于组织学检查。从切除到冷冻，切片和染色，组织应的方式，将避免冻结损坏和产生最精确的图像可能被处理。如果没有妥善保存，染色将无法准确反映生理和因此而引发的误解。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat | Leica CM 1850 | Leica Microsystems Inc. | Buffalo Grove, IL 60089 U.S.A., office phone 1-800-248-0123 Alternative: Richard Allen Scientific |
| Microscope | Nikon Eclipse 50i | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternative: Olympus |
| Image analysis software | Nikon Imaging Software Basic Research | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternatives: Image J, Metamorph |
| Isoflurane | 14043-220-05 | JD Medical Dist. Co., Inc. | 1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 U.S.A. |
| OCT | 4583 | Sakura Inc. | Torrence, CA 90501 U.S.A. Alternative source: Leica Microsystem |
| Freeze It | 23-022524 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Disposable tissue mold | 22-363-554 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Colorfrost plus slides | 9991001 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Acetone | 650501-4L | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Ethyl alcohol | HC-1300-1GL | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| 2-methyl butane | M 32631-SL | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Xylene | HC-7001GA | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Cytoseal 280 | 8311-4 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Hematoxylin Gill #3 | CS402-1D | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Eosin | 6766007 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
References
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