Abstract
A avaliação histológica de biópsias do músculo tem servido como uma ferramenta indispensável para a compreensão do desenvolvimento e progressão da patologia de doenças neuromusculares. No entanto, a fim de fazê-lo, o cuidado apropriado deve ser tomado quando excisão e preservar tecidos para alcançar a coloração ideal. Um método de preservação de tecido envolve a fixação tecidos em formaldeído e, em seguida, incorporando-os com cera de parafina. Este método preserva morfologia bem e permite o armazenamento a longo prazo a temperatura ambiente, mas é difícil e requer a manipulação de produtos químicos tóxicos. Além disso, os resultados de fixação em formaldeído antígeno cross-linking, o que exige protocolos de recuperação antigênica para immunostaining eficaz. Pelo contrário, o seccionamento congelado não necessita de fixação e, assim, retém a conformação antigénio biológica. Este método também fornece uma vantagem distinta em volta rápida em torno do tempo, tornando-se especialmente útil em situações que necessitam de avaliação histológica rápido como intraoperativa biópsias cirúrgicas. Aqui nós descrevemos o método mais eficaz de preparação de biópsias musculares para visualização com diferentes colorações histológicas e imunológicas.
Introduction
O exame de histologia muscular desempenha um papel crítico na compreensão de diferentes tipos de distúrbios neuromusculares 1-4. Quando combinado com outras técnicas, permite que pesquisadores para ter uma idéia melhor da manifestação ea progressão da patologia e também pode ser essencial para avaliar a eficácia de uma intervenção terapêutica 5-10. No entanto, para ser exato, os tecidos precisam ser preservados de forma adequada, de modo a preservar o estado fisiológico imediatamente antes da excisão. Isso requer muito cuidado durante a remoção, preservação, seccionamento e coloração.
Os tecidos podem ser preparados de duas maneiras diferentes para estudo microscópico luz. O método primeiro, fixados em formalina embebidos em parafina (FFPE) seções, requer tecidos fixados em formol 10% tamponado naturais antes de ser incorporado com cera de parafina 11,12. A etapa de fixação ajuda a preservar a morfologia melhor, mas também ligações cruzadas pr endógenooteins necessitando, portanto, de antigénios intrincado procedimentos de recuperação para a imunocoloração e eliminando a possibilidade de coloração enzimática em tais seções 12. As secções congeladas, por outro lado, não precisa de ser pré-fixo ou processado; por conseguinte, as proteínas são capazes de reter conformações nativas biológicos 13,14. Além disso, cortes congelados também permitem rápido tempo de resposta, que às vezes é necessário, por exemplo, no diagnóstico intra-operatório de sarcomas e outras biópsias cirúrgicas 15. No entanto, se não for feito corretamente, este método é propenso a congelar danos, que introduz alterações à arquitetura muscular fazendo as seções impróprios para exame histológico. Este artigo irá delinear o método mais eficaz para preparar biópsias musculares, a fim de alcançar uma óptima coloração para exame adequado.
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Protocol
1. Tissue Colheita e congelamento dos tecidos musculares
- Eutanásia o rato com uma overdose de isoflurano (2-cloro-2- (difluorometoxi) -1,1,1-trifluoro-etano). Execute esta etapa em um exaustor e usar um método de contenção secundária, como um secador ou uma redoma de vidro contendo um cotonete embebido em isoflurano.
- Confirme a morte com firmeza apertando pata. Use um método secundário de eutanásia, como luxação cervical.
- Molhar a pele com álcool a 70% para reduzir a aderência de fios de cabelo soltos sobre os músculos. Descasque a pele fora o membro usando uma pinça fina, tais como # 5.
- Cuidadosamente separar o músculo de interesse (tibial anterior (TA), neste caso) a partir dos ossos por baixo, a partir do tendão e remover.
- Extirpar o músculo, cobri-lo em outubro (de corte ideal composto de temperatura), e coloque-o deitado sobre um molde de congelamento descartável rotulados. Certifique-se de que o músculo está em sua orientação fisiológica normal (cabeça para tail) sem esticar. Alternativamente, congelar o músculo em pequenos quadrados de isopor e fixá-lo utilizando os pinos de insetos para garantir o comprimento correto dos músculos.
- Relaxar 2-metilbutano (isopentano) em um copo de aço usando azoto líquido. Isso leva, em média, 3-5 min. Continue mexendo de forma intermitente até precipitados brancos começam a se formar no fundo e paredes do copo.
NOTA: Quando isso ocorre, isopentano tenha alcançado a temperatura ideal de congelamento (-150 ° C) - Mergulhe os moldes contendo músculos na gelada de 2-metilbutano. Congelar pequenos músculos, como o diafragma e longus extensor digitorum (EDL) para 6-12 seg e músculos maiores, como o sóleo gastrocnêmio (GS) e tríceps para 15 - 20 seg. Não congelar os músculos por muito tempo, pois isso pode levar a fissuras.
- Transfira os tecidos congelados sobre gelo seco e deixe evaporar isopentano (note que este processo leva em média cerca de 15 - 20 min). Enrole os tecidos em papel alumínio e armazená-los em ultra baixa temperatura (-70 ° C a -80 ° C) até o corte.
2. Incorporar os tecidos em outubro de Elaborar bloco de tecido
- Tecidos de transporte em gelo seco para cyrostat para evitar o descongelamento. Transferência para o tecido criostato câmara (definida a -20 a -24 ° C para evitar o descongelamento completo de tecidos) e deixá-los equilibrar durante 30 min.
- Vire a baía Peltier de refrigeração por diante. Se o cryostat não tem esse resfriamento, use aerosol spray de arrefecimento para congelar rapidamente a outubro Não deixe que o degelo do músculo em qualquer ponto durante a incorporação, pois isso pode resultar em danos causados por congelamento.
- Adicione uma camada fina e uniforme de outubro no disco de amostra e deixe esfriar. Quando a maior parte dos PTU é congelada no fundo enquanto ainda líquido na parte superior, insira o tecido na orientação correta (perpendicular outubro para seções transversais e paralelas para outubro para cortes longitudinais). Use spray de aerosol arrefecimento para congelar rapidamente outubro Toque na parte unembeded do tecido com calor extractor e aguarde 45 segundos.
- Adicionar outra camada fina de outubro em torno do músculo, pulverizador com de aerossol de pulverização de arrefecimento e extrair o calor tal como no passo anterior.
- Continua a adicionar outubro em pequenos incrementos e congelar rapidamente OCT utilizando uma combinação de aerossol de pulverização e extractor de calor de arrefecimento até que todo o músculo é coberto.
- Colocar o extractor de calor na parte superior do bloco de tecido e esperar durante 5 min.
3. Preparar Seções e identificando as secções de Mid-barriga Região dos Músculos
- Montar o espécime para o cabeçote da amostra. Aperte o botão para fixar o disco. Certifique-se de que o disco de amostra está em bom contato com o cabeçote de amostra.
- Ajuste a temperatura da câmara de entre -21 e -24 ° C e aguarde até que a temperatura definida é alcançada.
- Ajuste as configurações de espessura (7 um); aparar o bloco através do avanço ou retração do bloco usando configurações grossas e finas.
- Recolher as seçõesem pré-aquecido lâminas de microscópio com carga positiva, pressionando a parte superior da lâmina para as secções, utilizando a atracção entre cargas opostas para facilitar a aderência das secções de corte na lâmina.
- Identificar as secções médio-barriga por medição da área da secção transversa (AST) das secções. Faça isso usando software de imagem no computador que está ligado ao microscópio.
NOTA: As imagens de contraste de fase são tomadas e circunferência de todo o músculo é medido através de uma função de rastreamento sobre o programa de software. Isto irá proporcionar tanto CSA, bem como diâmetro mínimo furão (medida de fibras de tamanho em corte transversal que é expressa como a menor distância entre duas tangentes paralelas em lados opostos de uma partícula) medições. Nota: Quando CSA e diâmetro mínimo ferret medições começar a platô, mid barriga foi atingido. - Inventário e arquivar as lâminas a -80 ° C para a coloração futuro.
NOTA: o PTU não precisam ser removidos antes da staininprocedimentos de g. Uma vez que as lâminas são lamínulas, eles estão prontos para ser manchado imediatamente.
4. Coloração
NOTA: Embora os procedimentos passo a passo detalhadas podem ser encontradas na folha de dados do produto e deve ser seguido por procedimentos de coloração, otimização de pessoal pode ser obrigado a obter a coloração ideal.
- Como meios de montagem (ver quadro) não seja miscível com água, por meio de lâminas de desidratar graus crescentes de álcool (2 min cada em 70%, 95%, e 100% de etanol) e limpá-las com xileno (100% durante 5 min) para garantir lâminas não se tornam opaca ao longo do tempo.
- Lamela seções e deixe-os secar. Imagem com microscópio equipado com software de imagem.
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Representative Results
A instalação para a colheita e congelamento de tecidos pode ser visto na Figura 1. Tecidos excisados deve ser armazenado em uma gaze embebida em PBS para evitar a secagem (Figura 1A). Quando os tecidos são selecionados para serem utilizados para análise histológica eles devem ser mergulhados em outubro e dispostas em molde crio na orientação adequada e tão perto de comprimento fisiológico possível para garantir a morfologia preciso (Figura 1B). Polpa de isopentano apropriada para congelamento de tecidos pode ser conseguida por arrefecimento de isopentano no azoto líquido e agitando até pequenos precipitados brancos aparecem na parte inferior. Neste ponto, os meios de comunicação é adequado para congelamento (Figura 1C). Os tecidos devem ser congeladas 6-15 seg em isopentano arrefecido, dependendo do tamanho / espessura do tecido (Figura 1D). Na sequência de congelamento, o músculo aparecerá branco giz em que ponto ele deve ser armazenado em gelo seco e mais tarde transferido para -80 <strong> ° C congelador.
Configuração criostato e os ingredientes necessários para a preparação do bloco de músculo gradualmente por incorporação do tecido em OCT são mostrados na Figura 2. O criostato deve ser definido entre -20 e -24 ° C (Figura 2A). Outubro e congelá-los devem estar prontamente disponíveis para criar bloco adequado para o corte. Dentro de criostato deve ter escovas pequenas para manipular e achatam seções de corte de lâmina de decisões, bem como pinças para manejo de bloco de tecido, porque ele nunca deve ser tocada com as mãos para garantir o tecido permanece congelado (Figura 2B). Outubro deve ser adicionado ao tecido para criar bloco de corte, mas devem ser imediatamente congelados com Freeze-It spray e, em seguida, ainda arrefecida com heat-extractor retratado aqui (Figura 2C). Para secções transversais, o tecido deve ser colocado sobre a amostra, de modo que a cabeça está orientada perpendicularmente à lâmina (Figura 2D). SeIm press ão deve ser ajustada para atingir a espessura de corte desejada (5-10 uM, dependendo do tecido).
Se congelado corretamente o rosto do tecido deve ser calcário branco, enquanto um tecido que foi congelado de forma inadequada ou descongelado durante o processo de montagem aparece vermelho / rosa. A Figura 3 mostra tecidos representativos para amostras manuseadas inadequadamente (Figura 3A) e amostras tratadas adequadamente (Figura 3B) .
A região do ventre médio é determinado por medição CSA e diâmetro mínimo doninha usando um microscópio equipado com óptica de contraste de fase e software de análise de imagem. Uma imagem representativa de software de análise é mostrado na Figura 4. Hematoxilina e eosina imagens coradas de uma biópsia adequadamente congelados e seccionados ao longo com um congelamento de biópsia danificado tibial anterior (TA) são mostrados na Figura 5. As secções que são adequadamente processados terão morpholo consistenteGy e ainda em toda a coloração (Figura 5A). Indevidamente processadas músculos que estão danificados ou congelamento prematuramente descongelados parecerá ter várias quebras na morfologia e têm a aparência de "desfiado trigo" (Figura 5B). Figura 6 mostra câmara úmida para immunostaining ideal. As lâminas devem ser cobertos com parafilme, mantidos em uma toalha de papel molhado, e selado em uma caixa pequena para evitar a secagem das secções durante immunostaining. Figura 7 mostra um slide imunohistoquímica amostra que tenha sido devidamente preparadas e coradas.
Figura 1. Preparação e criados para congelamento do tecido apropriado. (A) excisada tecidos devem ser armazenados em gaze embebida em PBS. (B) A tecidos selectedfor histológicaanálise mergulhado em outubro e dispostas em molde crio na orientação correta (de barriga para tendão) e tão perto comprimento fisiológico possível. (C) de lodo de isopentano apropriada para o tecido. Nota: pequenos precipitados brancos aparecem na parte inferior. (D) de tecido congelado após imersão em isopentano. Nota:. Aparência branca como giz por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Configurações de criostato e os ingredientes necessários para o corte. (A) Criostato definido entre -20 e -24 ° C com outubro e aerosol spray de arrefecimento prontamente disponíveis. (B) Dentro de configuração de cryostat completo com pequenos pincéis para manipular e achatar seç corteons para fazer slides, bem como uma pinça para manusear de bloco de tecido. (C) bloco de tecido congelado pronto para ser resfriado com extrator de calor (seta branca). Bloco (D) Tissue posta sobre a cabeça pronta para ser cortada de montagem. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. tecidos representativos de músculos corretamente e incorretamente preservadas. (A) Indevidamente congelados ou manipulados (B) Devidamente congelado e manipulados muscular. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Determinação da área da seção transversal do músculo TA usando software de imagem da Nikon. Screenshot imagem de contraste de fase de secção muscular que foi circulado usando imaginar software para a medição da CSA e diâmetro min furão de. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Imagens representativas dos músculos H & E manchada adequadamente e de forma inadequada preparados. (A) Bem seção processado. (B) seção muscular congelamento danificado incorretamente processado. Por favor, click aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. umidificado câmara apropriado para immunostaining. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. Exemplo de imuno-histoquímica de slides de slides devidamente preparados e corados. Deslize foi corado com Fibronectina (verde) e DAPI (azul). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A histologia e imuno-histoquímica têm sido utilizados como ferramentas fundamentais para a compreensão da manifestação e progressão da patologia de várias desordens neuromusculares. Classicamente, biópsias musculares foram fixadas pela primeira vez em formaldeído e depois incorporado com cera de parafina. Enquanto fixação em formol preserva a arquitetura do tecido e permite o armazenamento e transporte de tecido à temperatura ambiente, também inativa enzimas e proteínas ligações cruzadas que obrigariam a novas medidas para alcançar immunostaining precisas. Este problema é eliminado com a utilização de secções congeladas, mas este método apresenta desafios técnicos únicos na obtenção de resultados óptimos de coloração e 14,15 interpretação precisa.
Em primeiro lugar, é essencial que as amostras sejam congeladas imediatamente após a excisão cirúrgica como autólise e decomposição começa logo após a remoção do corpo. Os tecidos também devem ser congelados rapidamente e completamente para a quantidade adequada de tempo que varia de acordo com o tamanho/ Espessura do tecido. Se isso não for feito corretamente, congelar dano ocorrerá tornando o tecido inútil para avaliação histológica. Após congelação, tecidos deve ser imediatamente armazenado em gelo seco e, em seguida, transferidos para uma temperatura ultra baixa (-80 ° C) congelador até seccionamento. É importante notar que os tecidos não deve ser removido do congelador sem ser em gelo seco por congelação-descongelação, também pode danificar arquitectura dos tecidos.
Outra nota de importância quando da realização de análise histológica é cuidar para analisar sempre a mesma parte do tecido de interesse para assegurar a uniformidade entre análise. Isto pode ser feito por secções do músculo através da realização de análise da porção média do ventre. Esta é a parte do músculo que é mais espesso e, por conseguinte, terá maior área da secção transversal do. A fim de assegurar que você está realmente seccionamento porção média do ventre, CSA de seções devem ser medidos utilizando o software de imagem histológica. Measurementos deve continuar a ser feito até que a área transversal começa a estagnar. Quando isso ocorre, a meio da barriga tenha sido alcançada; apenas esta parte do tecido deve ser usado para análise histológica para garantir a uniformidade entre as comparações.
Depois de corte foi preenchido e as lâminas foram preparadas, que deve ser deixada a secar à temperatura ambiente durante 1 - 2 h. Secagem permite a aderência adequada da secção para a corrediça e também evita que o excesso de água para cristalizar após a transferência para -80 ° C congelador. É importante notar que as lâminas apenas devem também ser tratadas em gelo seco quando se selecciona lâminas para análise para evitar ciclos de congelamento e descongelamento. Uma vez que os slides foram selecionadas para a coloração, os protocolos incluídos com a mancha deve ser seguido primeira a título experimental até que foram alcançados os melhores resultados. Ao realizar immunostaining, é importante certificar-se de lâminas não sequem durante o procedimento. A secagem das lâminas pode resultar em interacção transientes para permanecer intacta após incubação. Estas interacções não pode ser removido durante a lavagem e resultar em coloração inespecífica. A secagem pode ser evitada mantendo diapositivos numa atmosfera humidificada. Execução de incubações com partes cobertas com parafilme e desliza sobre uma toalha de papel úmido selado em uma caixa de slides pequeno é suficiente para garantir slides não vai secar a qualquer momento durante o procedimento.
Histologia é uma ferramenta essencial na visualização morfologia e vários aspectos da patologia. Embora um tanto trivial, é da maior importância que tomar muito cuidado na preparação de tecidos poderiam ser utilizados para histologia. A partir de excisão de congelamento, de corte e coloração, os tecidos devem ser tratados de uma forma que irá evitar danos causados por congelamento e produzir as imagens mais precisas possível. Sem preservação adequada, a coloração não refletir com precisão fisiologia e, portanto, levar a erros de interpretação.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat | Leica CM 1850 | Leica Microsystems Inc. | Buffalo Grove, IL 60089 U.S.A., office phone 1-800-248-0123 Alternative: Richard Allen Scientific |
| Microscope | Nikon Eclipse 50i | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternative: Olympus |
| Image analysis software | Nikon Imaging Software Basic Research | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternatives: Image J, Metamorph |
| Isoflurane | 14043-220-05 | JD Medical Dist. Co., Inc. | 1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 U.S.A. |
| OCT | 4583 | Sakura Inc. | Torrence, CA 90501 U.S.A. Alternative source: Leica Microsystem |
| Freeze It | 23-022524 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Disposable tissue mold | 22-363-554 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Colorfrost plus slides | 9991001 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Acetone | 650501-4L | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Ethyl alcohol | HC-1300-1GL | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| 2-methyl butane | M 32631-SL | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Xylene | HC-7001GA | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Cytoseal 280 | 8311-4 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Hematoxylin Gill #3 | CS402-1D | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Eosin | 6766007 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
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