Abstract
La evaluación histológica de las biopsias musculares ha servido como una herramienta indispensable en la comprensión del desarrollo y la progresión de la patología de los trastornos neuromusculares. Sin embargo, con el fin de hacerlo, el cuidado apropiado debe ser tomado cuando la escisión y la preservación de los tejidos para lograr tinción óptimo. Uno de los métodos de conservación de tejidos implica la fijación de tejidos en formaldehído y luego incrustarlos con cera de parafina. Este método preserva la morfología bien y permite el almacenamiento a largo plazo a temperatura ambiente pero es engorroso y requiere la manipulación de productos químicos tóxicos. Además, los resultados de fijación en formol antígeno entrecruzamiento, lo que requiere protocolos de recuperación de antígeno por inmunotinción eficaz. Por el contrario, seccionado congelado no requiere la fijación y por lo tanto retiene conformación antígeno biológica. Este método también proporciona una clara ventaja en vuelta rápida alrededor del tiempo, por lo que es especialmente útil en situaciones que requieren evaluación histológica rápida como intraoperaTIVE biopsias quirúrgicas. A continuación se describe el método más eficaz de preparar biopsias musculares para la visualización con diferentes tinciones histológicas e inmunológicas.
Introduction
El examen de histología muscular juega un papel crítico en la comprensión de los diferentes tipos de trastornos neuromusculares 1-4. Cuando se combina con otras técnicas, permite a los investigadores para obtener una mejor idea de la manifestación y la progresión de la patología y también pueden ser esenciales para evaluar la eficacia de una intervención terapéutica 5-10. Sin embargo, para ser precisos, los tejidos necesitan ser conservado en la manera apropiada a fin de preservar el estado fisiológico inmediatamente antes de la escisión. Esto requiere gran cuidado durante la extracción, preservación, seccionamiento y tinción.
Los tejidos pueden prepararse de dos maneras diferentes para estudio microscópico de luz. El primer método, formol fija en parafina (FFPE) secciones, requiere tejidos que se fijaron en formaldehído al 10% tamponada naturales antes de ser integrado con cera de parafina 11,12. La etapa de fijación ayuda a preservar la morfología mejor, pero también vínculos transversales pr endógenaoteins necesitando por lo tanto los procedimientos de recuperación de antígeno intrincada de inmunotinción y eliminando la posibilidad de tinción enzimática en tales secciones 12. Las secciones congeladas, por otra parte, no tienen que ser pre-fijo o procesados; por lo tanto, las proteínas son capaces de retener conformaciones biológicos nativos 13,14. Además, las secciones congeladas también permiten el tiempo de respuesta rápida, que a veces es necesario, por ejemplo en el diagnóstico intraoperatorio de los sarcomas y otros biopsias quirúrgicas 15. Sin embargo, si no se hace correctamente, este método es propenso a los daños por congelación, que introduce cambios en la arquitectura muscular haciendo las secciones no aptos para el examen histológico. En este trabajo se expondrá el método más eficaz para preparar las biopsias musculares para lograr tinción óptimo para examen adecuado.
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Protocol
1. Tejido Cosecha y congelación de los tejidos musculares
- La eutanasia del ratón con una sobredosis de isoflurano (2-cloro-2- (difluorometoxi) -1,1,1-trifluoro-etano). Realice este paso en una campana de extracción y el uso de un método de contención secundaria, como un secador o una campana de vidrio que contiene un hisopo de algodón empapado en isoflurano.
- Confirmar la muerte apretando firmemente la almohadilla plantar. Use un método secundario de la eutanasia como la dislocación cervical.
- Humedezca la piel con alcohol al 70% para reducir la adherencia de los cabellos sueltos sobre los músculos. Pelar la piel de la extremidad utilizando unas pinzas finas como el # 5.
- Separar cuidadosamente el músculo de interés (tibial anterior (TA) en este caso) de los huesos por debajo, a partir de tendón y quitar.
- Extirpar el músculo, cubrirlo en octubre (compuesto temperatura óptima de corte), y déjelo sobre un molde de congelación desechables etiquetados. Asegúrese de que el músculo está en su orientación fisiológica normal (cabeza para tail) sin estirar. Alternativamente, congelar el músculo en pequeños cuadrados de espuma de poliestireno y el pin con alfileres de insectos para asegurar la longitud correcta de los músculos.
- Chill 2-metilbutano (isopentano) en un vaso de precipitados de acero usando nitrógeno líquido. Esto toma en promedio 3-5 min. Mantener la agitación intermitente hasta precipitados blancos comienzan a formarse en la parte inferior y las paredes del vaso de precipitados.
NOTA: Cuando esto ocurre, isopentano ha alcanzado la temperatura óptima de congelación (-150 ° C) - Sumerja los moldes que contienen músculos en el frío 2-metilbutano. Congele pequeños músculos como el diafragma y el extensor largo del dedo dedos (EDL) durante 6-12 segundos y músculos más grandes como el sóleo gastrocnemio (GS) y tríceps de 15 a 20 seg. No congelar los músculos durante demasiado tiempo ya que esto puede conducir a la rotura.
- Transferir los tejidos congelados sobre hielo seco y dejar que se evapore isopentano (tenga en cuenta que este proceso toma en promedio alrededor de 15 a 20 min). Envuelva los tejidos en papel de aluminio y almacenarlos en ultra baja temperatura (-70 ° C a -80 ° C) hasta el corte.
2. Incorporación de los tejidos en octubre preparar Tissue Bloquear
- Tejidos Transporte en hielo seco para cyrostat para evitar la descongelación. Transferencia de tejido a criostato cámara (establecido a de -20 a -24 ° C para evitar la descongelación completa de los tejidos) y dejar que se equilibren durante 30 min.
- Gire la bahía Peltier de enfriamiento en. Si el criostato no tiene este enfriamiento, utilice aerosol spray de refrigeración para congelar rápidamente la OCT. No deje que el deshielo del músculo en cualquier momento durante la incrustación ya que esto puede resultar en daños por congelación.
- Añadir una fina capa uniforme de octubre en el disco muestra y dejar enfriar. Cuando la mayoría de la OCT se congela en el fondo mientras que todavía líquido en la parte superior, inserte el tejido en la orientación correcta (perpendicular a octubre para las secciones transversales y paralelas a octubre de secciones longitudinales). Utilice aerosol spray de refrigeración para congelar rápidamente octubre Toque la parte unembeded del tejido con el calor extractor y esperar 45 seg.
- Añadir otra capa delgada de octubre alrededor del músculo, rociar con aerosol spray de enfriamiento y extraer el calor como en el paso anterior.
- Mantenga la adición de octubre en pequeños incrementos y rápidamente congelar el octubre mediante una combinación de aspersión y extractor de calor de refrigeración aerosol hasta que el músculo está cubierto.
- Ponga el extractor de calor en la parte superior del bloque de tejido y esperar 5 min.
3. Preparación de las secciones e identificación de las Secciones de Mid-vientre Región de los músculos
- Montar la muestra sobre la cabeza de la muestra. Apriete la perilla para asegurar el disco. Asegúrese de que el disco de la muestra se encuentra en buen contacto con la cabeza de la muestra.
- Ajuste la temperatura de la cámara a entre -21 y -24 ° C y espere hasta que se alcanza la temperatura programada.
- Ajuste los valores de espesor (7 micras); recortar el bloque mediante el avance o retroceso del bloque usando ajustes gruesos y finos.
- Recoge las seccionesen pre-calentado portaobjetos cargados positivamente presionando la parte superior de la diapositiva en secciones, con la atracción entre cargas opuestas para facilitar la adherencia de las secciones cortadas a la diapositiva.
- Identificar las secciones mediados de vientre mediante la medición de área de sección transversal (CSA) de las secciones. Para ello, el software de imágenes usando en el equipo que está conectado al microscopio.
NOTA: Las imágenes de contraste de fase se toman y la circunferencia de todo el músculo se mide a través de una función de seguimiento del programa de software. Esto producirá tanto CSA así como hurón diámetro mínimo (medida de la fibra de tamaño de sección transversal que se expresa como la distancia más pequeña entre dos tangentes paralelas en lados opuestos de una partícula) mediciones. Nota: Cuando las mediciones CSA y diámetro mínimo hurón comienzan a estabilizarse, se ha llegado a mediados del vientre. - Inventario y archivar las diapositivas a -80 ° C para la tinción futuro.
NOTA: octubre no tiene que ser eliminado antes de staininprocedimientos g. Una vez portaobjetos se cubrieron, que están listos para ser manchado inmediatamente.
4. La tinción
NOTA: Si bien los procedimientos detallados paso a paso se pueden encontrar en la hoja de datos del producto y se deben seguir los procedimientos de tinción, la optimización del personal puede ser requerido para obtener la tinción óptima.
- Debido a que los medios de montaje (véase la tabla) no es miscible con agua, deshidratar diapositivas a través crecientes grados de alcohol (2 min cada uno en 70%, 95%, y 100% de etanol) y claro ellos con xileno (100% durante 5 min) para asegurar diapositivas no se vuelven opacas en el tiempo.
- Cubreobjetos secciones y déjelos secar. Imagen con microscopio equipado con software de imágenes.
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Representative Results
La puesta a punto para la cosecha y la congelación de los tejidos se puede ver en la Figura 1. Tejidos extirpados se deben almacenar en una gasa empapada en PBS para evitar el secado (Figura 1A). Cuando se seleccionan los tejidos a ser utilizado para el análisis histológico deben ser sumergidos en OCT y se presentarán en molde crio en la orientación adecuada y lo más cerca a la longitud fisiológica como sea posible para asegurar la morfología exacta (Figura 1B). Slurry de isopentano adecuado para la congelación del tejido puede lograrse mediante enfriamiento isopentano en nitrógeno líquido y agitando hasta pequeños precipitados blancos aparecen en la parte inferior. En este punto, los medios de comunicación es adecuado para congelar (Figura 1C). Los tejidos deben congelarse 6-15 seg en isopentano enfriado en función del tamaño / grosor del tejido (Figura 1D). Tras la congelación, aparecerá el músculo blanco calcáreo momento en el que se debe almacenar en hielo seco y trasladado posteriormente a -80 <strong> congelador ° C.
Ajuste Criostato y los ingredientes necesarios para preparar el bloque muscular mediante la incorporación gradual del tejido en octubre se muestran en la Figura 2. El criostato debe establecerse entre -20 y -24 ° C (Figura 2). Octubre y Freeze-It deben estar fácilmente disponibles para crear el bloque adecuado para el corte. Dentro del criostato debe tener pequeños cepillos para manipular y aplanar secciones cortadas para hacer diapositivas, así como pinzas para el manejo de bloque de tejido, ya que no debe tocarse con las manos para asegurarse de que el tejido permanece congelado (Figura 2B). Octubre, debe añadirse a los tejidos para crear bloques de seccionamiento, pero se debe congelar inmediatamente con Freeze-It aerosol y después se enfrió aún más con el calor-extractor ilustrado aquí (Figura 2C). Para secciones transversales, el tejido debe ser colocado en el cabezal portamuestras de modo que está orientada perpendicular a la cuchilla (Figura 2D). SeAjus tes deben ajustarse para lograr el espesor deseado sección (5-10 micras dependiendo del tejido).
Si se congela correctamente la cara del tejido debe ser blanco tiza mientras que un tejido que se congela de forma incorrecta o descongela durante el proceso de montaje aparecerá rojo / rosado. Figura 3 muestra los tejidos representativos de muestras inadecuadamente manejados (Figura 3A) y muestras adecuadamente manejados (Figura 3B) .
La región mediados vientre se determina mediante la medición de CSA y el diámetro mínimo hurón usando un microscopio equipado con óptica de contraste de fase y software de análisis de imagen. Una captura de pantalla representativa de software de análisis se muestra en la Figura 4. Hematoxilina y eosina imágenes manchadas de una biopsia adecuadamente congelado y seccionada a lo largo con una congelación biopsia dañada del tibial anterior (TA) músculos se muestran en la Figura 5. Secciones que son procesados correctamente tendrá morpholo coherenteGY e incluso a lo largo de la tinción (Figura 5A). Indebidamente procesada músculos que están congelación dañado o prematuramente descongeló aparecerá tener varias pausas en la morfología y tienen la apariencia de "trigo triturado" (Figura 5B). Figura 6 muestra cámara de humidificado para inmunotinción óptima. Las diapositivas deben ser cubiertos con parafilm, mantuvo en una toalla de papel húmeda, y se sella en una pequeña caja para evitar la desecación de las secciones durante inmunotinción. La figura 7 representa una diapositiva inmunohistoquímica muestra que ha sido debidamente preparado y manchadas.
Figura 1. Preparación y creados para la congelación del tejido correcta. (A) Extirpados tejidos deben ser almacenados en una gasa empapada en PBS. (B) Los tejidos selectedfor histológicoanálisis sumergido en octubre y se presentarán en el molde crio en la orientación correcta (de vientre para tendón) y lo más cerca a la longitud fisiológica posible. (C) de lechada de isopentano adecuado para el tejido. Nota: Los pequeños precipitados blancos aparecen en la parte inferior. (D) El tejido congelado después de la inmersión en isopentano. Nota:. Aspecto blanco calcáreo Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Configuración de criostato y los ingredientes necesarios para el corte. (A) Criostato ajustar entre -20 y -24 ° C con octubre y aerosol spray de refrigeración disponibles. (B) Configuración de criostato completa con pequeños cepillos Dentro de manipular y aplanar secti corteons para hacer diapositivas, así como pinzas para el manejo del bloque de tejido. (C) bloque de tejido congelado listo para ser enfriado con extractor de calor (flecha blanca). Bloque (D) del tejido fijado en la cabeza listo para ser cortado de montaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. tejidos representativos de músculos correcta e incorrectamente conservadas. (A) incorrectamente congelada o manipulado (B) correctamente congelado y manejados muscular. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Determinación del área de la sección transversal del músculo TA utilizando software de imagen de Nikon. Captura de imagen de contraste de fase de la sección muscular que ha sido un círculo usando imaginar software para la medición de la CSA y el diámetro de hurón min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Imágenes representativas de los músculos H & E manchadas correctamente y inadecuadamente preparados. (A) sección correctamente procesadas. (B) sección del músculo dañado congelación incorrectamente procesada. Por favor click aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. cámara húmeda adecuada para inmunotinción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. Muestra inmunohistoquímica diapositivas de diapositiva. Slide adecuadamente preparado y teñido ha sido manchada con fibronectina (verde) y DAPI (azul). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Histología e inmunohistoquímica se han utilizado como herramientas clave en la comprensión de la manifestación y la progresión de la patología en diversos trastornos neuromusculares. Clásicamente, las biopsias musculares se fijaron por primera vez en formaldehído y luego incrustados con cera de parafina. Si bien la fijación de formaldehído conserva la arquitectura del tejido y permite el almacenamiento y transporte del tejido a temperatura ambiente, también inactiva las enzimas y los entrecruzamientos proteínas que requieran medidas adicionales para lograr la inmunotinción exacta. Este problema se elimina con el uso de secciones congeladas pero este método presenta desafíos técnicos únicos en la obtención de resultados de la tinción óptimos y 14,15 interpretación precisa.
En primer lugar, es esencial que las muestras se congelaron inmediatamente después de la escisión quirúrgica como la autolisis y descomposición comienzan poco después de la eliminación del cuerpo. Los tejidos también deben congelarse rápidamente y completamente para la cantidad adecuada de tiempo que varía en función del tamaño/ Grosor del tejido. Si esto no se hace correctamente, congelar el daño ocurrirá haciendo que el tejido inútil para evaluación histológica. Tras la congelación, los tejidos deben almacenarse inmediatamente en hielo seco y luego fue trasladado a una temperatura ultra baja (-80 ° C) congelador hasta el corte. Es importante tener en cuenta que los tejidos no deben ser retirados del congelador sin estar en hielo seco debido a la congelación-descongelación también puede dañar la arquitectura del tejido.
Otra nota de importancia cuando se realiza el análisis histológico es cuidar para analizar siempre la misma parte del tejido de interés para asegurar la uniformidad entre los análisis. Esto se puede hacer para las secciones musculares mediante la realización de análisis de la midbelly. Esta es la parte del músculo que es la más gruesa y por lo tanto tendrá el área de sección transversal más grande. Con el fin de asegurarse de que está hecho seccionar el midbelly, CSA de las secciones subsiguientes se debe medir utilizando software de imagen histológica. Measurempadres deben seguir haciéndose hasta que el área de la sección transversal empieza a estabilizarse. Una vez que esto ocurre, se ha llegado a la mitad del vientre; sólo que esta parte del tejido se debe utilizar para el análisis histológico para asegurar la uniformidad entre comparaciones.
Después de seccionamiento se ha completado y las diapositivas han sido preparados, se les debe permitir que se seque a temperatura ambiente durante 1 - 2 hr. El secado permite la adherencia adecuada de la sección a la diapositiva y también evita el exceso de agua para cristalizar después de la transferencia a -80 ° C congelador. Es importante señalar que se desliza sólo deben también ser manejados en hielo seco al seleccionar diapositivas para el análisis para evitar ciclos de congelación-descongelación. Una vez que las diapositivas se han seleccionado para la tinción, los protocolos incluidos con la mancha se debe seguir primero a modo de prueba hasta que se hayan logrado resultados óptimos. Al realizar la inmunotinción, es importante asegurarse de que las diapositivas no se sequen durante todo el procedimiento. El secado de las diapositivas puede dar lugar a la interacción transitorias permanezca intacto después de la incubación. Estas interacciones no pueden eliminarse durante el lavado y resultan en la tinción inespecífica. El secado se puede evitar manteniendo diapositivas en un ambiente humidificado. Realización de las incubaciones con tramos cubiertos con parafilm y se desliza sobre una toalla de papel húmeda sellado en una caja de portaobjetos pequeña es suficiente para asegurar las diapositivas no se seque en cualquier momento durante el procedimiento.
Histología es una herramienta esencial en la visualización de la morfología y diversos aspectos de la patología. Aunque un tanto trivial, es de la mayor importancia tener mucho cuidado en la preparación de los tejidos que se utilizará para la histología. A partir de la escisión de la congelación, el seccionamiento y tinción, los tejidos deben ser manejados de una manera que permita evitar daños por congelación y producir las imágenes más precisas posible. Sin buena conservación, la tinción no reflejar con precisión la fisiología y por lo tanto dar lugar a malas interpretaciones.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat | Leica CM 1850 | Leica Microsystems Inc. | Buffalo Grove, IL 60089 U.S.A., office phone 1-800-248-0123 Alternative: Richard Allen Scientific |
| Microscope | Nikon Eclipse 50i | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternative: Olympus |
| Image analysis software | Nikon Imaging Software Basic Research | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternatives: Image J, Metamorph |
| Isoflurane | 14043-220-05 | JD Medical Dist. Co., Inc. | 1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 U.S.A. |
| OCT | 4583 | Sakura Inc. | Torrence, CA 90501 U.S.A. Alternative source: Leica Microsystem |
| Freeze It | 23-022524 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Disposable tissue mold | 22-363-554 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Colorfrost plus slides | 9991001 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Acetone | 650501-4L | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Ethyl alcohol | HC-1300-1GL | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| 2-methyl butane | M 32631-SL | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Xylene | HC-7001GA | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Cytoseal 280 | 8311-4 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Hematoxylin Gill #3 | CS402-1D | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Eosin | 6766007 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
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