Abstract
Histologisk utvärdering av muskelbiopsier har fungerat som ett oumbärligt verktyg i förståelsen av utvecklingen och utvecklingen av patologi neuromuskulära sjukdomar. Men för att göra detta, behöver ordentlig vård som skall vidtas när utskärning och bevara vävnader för att uppnå optimal färgning. En metod för vävnads bevarande innebär fastställande vävnader i formaldehyd och sedan bädda in dem med paraffin. Denna metod bevarar morfologi väl och möjliggör långtidslagring vid rumstemperatur men är besvärligt och kräver hantering av giftiga kemikalier. Vidare, formaldehyd fixeringsresulterar i antigentvärbindning, vilket kräver antigenåtervinning protokoll för effektiv immunfärgning. Tvärtom, inte fryst sektionering inte kräver fixering och därmed bibehåller biologisk antigenkonformation. Denna metod ger också en klar fördel i snabb vända tid, vilket gör det särskilt användbart i situationer som kräver snabb histologisk utvärdering som intraoperativ kirurgiska biopsier. Här beskriver vi den mest effektiva metoden för framställning av muskelbiopsier för visualisering med olika histologiska och immunologiska fläckar.
Introduction
Undersökning av muskel histologi spelar en avgörande roll i förståelsen av olika typer av neuromuskulära sjukdomar 1-4. I kombination med andra tekniker, gör det möjligt för forskare att få en bättre uppfattning om manifestationen och utvecklingen av patologi och kan också vara viktigt att utvärdera effekten av en terapeutisk intervention 5-10. Men för att vara exakt, vävnaderna måste bevaras på rätt sätt för att bevara den fysiologiska tillståndet omedelbart före excision. Detta kräver stor försiktighet när du tar bort, konservering, snitt och färgning.
Vävnader kan framställas på två olika sätt för Ijusmikroskopisk undersökning. Den första metoden, formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) sektioner kräver vävnader som skall fastställas i 10% naturliga buffert formaldehyd innan de inbäddade med paraffin 11,12. Fixerings steg hjälper till att bevara morfologi bättre men också tvärlänkar endogena proteins därmed kräver intrikata antigenåtervinning förfaranden för immunfärgning och eliminera risken för enzymatisk färgning på sådana avsnitt 12. Frysta sektioner, å andra sidan, behöver inte vara pre-fast eller bearbetas; Därför, proteiner kan behålla infödda biologiska konforma 13,14. Vidare, frysta snitt möjliggör även snabb vändning tid, vilket ibland är nödvändigt, till exempel i intraoperativ diagnos av sarkom och andra kirurgiska biopsier 15. Men om det inte görs på rätt sätt, är denna metod benägna att frysa skador, som införs ändringar av muskel arkitektur gör avsnitten olämpliga för histologisk undersökning. Detta dokument kommer att beskriva den mest effektiva metoden för att förbereda muskelbiopsier för att uppnå optimal färgning för ordentlig undersökning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tissue Skörd och Frysning av muskelvävnad
- Euthanize musen med en överdos av isofluran (2-klor-2- (difluormetoxi) -1,1,1-trifluor-etan). Utföra detta steg i ett dragskåp och använda en sekundär inneslutning metod såsom en exsickator eller en glaskupa innehållande en bomullstuss indränkt i isofluran.
- Bekräfta döden genom fast klämma trampdynan. Använd en sekundär metod för dödshjälp såsom halsdislokation.
- Blöt pälsen med 70% alkohol för att minska fastklibbning av lösa hårstrån på muskler. Bort skinnet på extremiteten med hjälp av en fin pincett som # 5.
- Ta försiktigt loss muskeln av intresse (tibialis anterior (TA) i detta fall) från benen under, från senan och ta bort.
- Punktskatter muskeln, täck den i OCT (Optimal Cutting Temperature förening), och lägga den platt på en märkt engångsfrys mögel. Se till att muskeln är vid sin normala fysiologiska orientering (huvud till tail) utan att sträcka. Alternativt, frysa muskeln på små frigolit rutor och stift den med insekt stift för att säkerställa rätt längd av musklerna.
- Chill 2-metylbutan (isopentan) i en stålbägare med hjälp av flytande kväve. Detta tar i genomsnitt 3 - 5 min. Håll omrörning intermittent tills vita fällningar börjar bildas på botten och väggar bägaren.
OBS: När detta inträffar, har isopentan uppnått optimal frystemperatur (-150 ° C) - Doppa formarna innehåller musklerna i den kylda 2-metylbutan. Freeze små muskler som membranet och extensor digitorum longus (EDL) 6 - 12 sekunder och större muskler som gastrocnemius soleus (GS) och triceps för 15 - 20 sek. Får ej frysas musklerna för länge eftersom det kan leda till sprickbildning.
- Överför frusna vävnaderna på torris och låt isopentan avdunsta (observera att denna process tar i genomsnitt ca 15 - 20 min). Linda vävnaderna i aluminiumfolie och förvara dem på uLTRA låg temperatur (-70 ° C till -80 ° C) tills snittning.
2. Bädda vävnaderna i ULT Förbered Tissue Block
- Transport vävnader på torris för att cyrostat att förhindra upptining. Överföring vävnad till kryostat kammare (inställd på -20 till -24 ° C för att undvika fullständig upptining av vävnader) och låt dem jämvikt under 30 minuter.
- Vrid Peltier bay kylning på. Om kryostatens inte har denna kylning, använder aerosol kylspray för att snabbt frysa ULT. Låt inte muskeln tina vid något tillfälle under inbäddningen eftersom det kan leda till frysskador.
- Lägg till en enhetligt tunt lager av OCT på preparatskivan och låt den svalna. När de flesta av landet eller territoriet är frusen på botten medan den fortfarande flytande på toppen, sätter vävnaden vid rätt riktning (vinkelrätt mot oktober för tvärsektioner och parallellt med oktober för längdsnitt). Använd aerosol kylspray för att snabbt frysa oktober Peka på unembeded delen av vävnaden med värme extractor och vänta 45 sekunder.
- Lägga till ytterligare tunt skikt av oktober runt muskeln, spraya med aerosol kylspray och extrahera värme som i föregående steg.
- Fortsätt att tillsätta oktober i små steg och snabbt frysa ULT med en kombination av aerosol kylspray och kylelement tills hela muskeln är täckt.
- Sätt kylelementet på toppen av vävnadsblock och vänta 5 minuter.
3. Förbereda Sektioner och Identifiera avsnitten från Mid-mage regionen muskler
- Montera provet på preparathuvudet. Dra åt knoppen för att fästa skivan. Se till att preparatskivan är i god kontakt med preparathuvudet.
- Justera kammartemperaturen till mellan -21 och -24 ° C och vänta tills den inställda temperaturen har uppnåtts.
- Justera tjockleken inställningarna (7 pm); trimma blocket genom att avancera eller dra tillbaka blocket med hjälp av grova och fina inställningar.
- Samla avsnittenpå förvärmda positivt laddade objektglas genom att trycka upp bilden på sektionerna med hjälp av attraktionen mellan motsatta laddningar för att underlätta vidhäftningen av de skurna sektionerna på glaset.
- Identifiera de halva magen sektioner genom mätning tvärsnittsyta (CSA) av sektionerna. Gör detta med hjälp av bildbehandlingsprogram på datorn som är ansluten till mikroskopet.
OBS: Fas kontrastrika bilder tas och omkrets hela muskeln mäts via en spårning funktion på programmet. Detta kommer att ge både CSA samt minimi iller diameter (mått på fibertvärsektionsstorlek som uttrycks som det minsta avståndet mellan två parallella tangenter på motsatta sidor av en partikel) mätningar. Obs: När CSA och minimi iller diameter mätningar börjar platå, har mitten mage nåtts. - Inventering och arkivera bilderna vid -80 ° C för framtida färgning.
OBS: Okt behöver inte tas bort före staining förfaranden. När objektglas täck, de är redo att färgas omedelbart.
4. Färgning
OBS: Även om detaljerade steg-för-steg-anvisningar kan hittas på produktdatablad och bör följas för färgning förfaranden får personlig optimering krävas för att uppnå optimal färgning.
- Eftersom montering media (se tabell) är inte blandbar med vatten, torkar glider genom att öka kvaliteter av alkohol (2 minuter vardera i 70%, 95% och 100% etanol) och rensa dem med xylen (100% under 5 minuter) för att säkerställa diabilder inte blir ogenomskinlig över tiden.
- Täck sektioner och låt dem torka. Bild med mikroskop utrustat med bildbehandlingsprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Upplägget för skörd och frysning av vävnader kan ses i figur 1. Utskurna vävnader ska förvaras på en kompress indränkt i PBS för att undvika uttorkning (Figur 1A). När vävnaderna väljs att användas för histologisk analys bör de doppas i OCT och läggs ut på Cryo mögel i rätt riktning och så nära fysiologisk längd som möjligt för att säkerställa korrekt morfologi (Figur 1B). Uppslamning av isopentan lämplig för vävnads frysning kan uppnås genom kylning isopentan i flytande kväve och omröring tills små vita fällningar visas längst ner. Vid denna punkt, är media som lämpar sig för frysning (Figur 1C). Vävnader bör frysas 6-15 sek i kyld isopentan beroende på storleken / tjocklek av vävnaden (figur 1D). Efter frysning, kommer muskeln visas kritvit vid vilken punkt det skall lagras på torr is och senare överfördes till -80 <stark> ° C frys.
Kryostat inställningen och ingredienser som krävs för framställning av muskelblocket genom att gradvis inbädda vävnaden i oktober visas i figur 2. Kryostaten bör ställas in mellan -20 och -24 ° C (Figur 2A). ULT och Frys Det bör vara lätt tillgängliga för att skapa blocket lämplig för sektionering. Insidan av kryostat bör ha små penslar att manipulera och platta skurna sektioner för glid gör liksom pincett för hantering av vävnadsblock eftersom det aldrig får vidröras med händerna för att säkerställa att vävnaden är frusen (Figur 2B). Oktober bör läggas till vävnad för att skapa snitt blocket men bör omedelbart frysas med Freeze-It spruta och kyldes därefter vidare med värme utsug bilden här (Figur 2C). För tvärsektioner, bör vävnad placeras på preparathuvudet så att det är orienterad vinkelrätt mot bladet (figur 2D). Sebeslags bör justeras för att uppnå önskad snittjocklek (5-10 | j, m beroende på vävnaden).
Om frysta korrekt vävnaden ansikte bör vara kritvit medan en vävnad som frystes felaktigt eller tinas under monteringsprocessen kommer att visas röd / rosa. Figur 3 visar representativa vävnader för felaktigt hanterade prover (Figur 3A) och hanteras korrekt prover (Figur 3B) .
I mitten magen regionen bestäms genom att mäta CSA och minsta iller diameter med hjälp av ett mikroskop utrustat med faskontrast optik och bildanalys programvara. En representativ skärmbild av analysmjukvara visas i figur 4. Hematoxylin och eosin färgade bilder av ett korrekt fryst och sektione biopsi tillsammans med en frys skadad biopsi av tibialis anterior (TA) muskler visas i figur 5. Sektioner som är korrekt bearbetas kommer att ha konsekvent morphology och även färgning hela (figur 5A). Felaktigt bearbetas muskler som är frys skadade eller förtid tinade visas att ha flera avbrott i morfologi och har utseendet av "strimlad vete" (figur 5B). Figur 6 visar befuktad kammare för optimal immunfärgning. Diabilder bör täckas med parafilm, som hålls på en våt pappershandduk, och förseglas i en liten låda för att undvika uttorkning av avsnitten under immunfärgning. Figur 7 visar ett exempel immunohistokemi bild som har ordentligt förberedd och färgas.
Figur 1. Beredning och som du kan korrekt vävnad frysning. (A) Utskurna vävnader bör förvaras på gasväv indränkt i PBS. (B) Vävnader selectedfor histologiskaanalys doppas i OCT och läggs ut på Cryo mögel i rätt riktning (från magen till sena) och så nära fysiologisk längd som möjligt. (C) uppslamning av isopentan lämplig för vävnad. Obs: små vita fällningar visas längst ned. (D) Fryst vävnad efter doppning i isopentan. Obs:. Kritvit utseende Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Kryostat inställningar och ingredienser som behövs för sektionering. (A) Kryostat in mellan -20 och -24 ° C med oktober och aerosol kylspray lättillgänglig. (B) Inre inställning av kryostat komplett med små borstar för att manipulera och platta skurna avsons slide gör liksom pincett för hantering av vävnadsblock. (C) Frysta vävnadsblock redo att kylas med kylelement (vit pil). (D) Tissue modul som på monteringshuvudet redo att skäras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Representativa vävnader korrekt och felaktigt bevarade muskler. (A) Felaktigt frysta eller hanteras (B) ordentligt frusen och hanteras muskler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Fastställande av tvärsnittsarea TA muskeln med Nikon bildbehandlingsprogram. Skärmdump av faskontrast bild av muskelsektion som har ringats in med hjälp av föreställa mjukvara för mätning av CSA och min iller diameter. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5. Representativa bilder av korrekt och felaktigt beredda H & E färgade muskler. (A) Rätt bearbetade avsnitt. (B) Felaktigt bearbetat frysa skadad muskel sidan. Vänligen click här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. fuktig kammare lämplig för immunfärgning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Exempel immunohistokemi rutschbanan i ordentligt förberedda och färgade bild. Slide har målat med fibronektin (grön) och DAPI (blå). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Histologi och immunohistokemi har använts som viktiga verktyg för att förstå manifestation och utvecklingen av patologi i olika neuromuskulära sjukdomar. Klassiskt, var muskelbiopsier först i formaldehyd och sedan inbäddade med paraffin. Medan formaldehyd fixering bevarar vävnad arkitektur och låter vävnads lagring och transport vid RT, inaktiverar också enzymer och tvärbindningar proteiner som kräver ytterligare åtgärder för att uppnå korrekt immunfärgning. Detta problem elimineras med hjälp av frysta snitt men denna metod ger unika tekniska utmaningar att få optimala färgningsresultat och korrekt tolkning 14,15.
För det första är det viktigt att proverna frysas omedelbart efter kirurgisk excision som autolys och nedbrytning börjar snart efter avlägsnande från kroppen. Vävnader måste också frysas snabbt och grundligt för rätt mängd tid som varierar beroende på storlek/ Tjocklek av vävnaden. Om detta inte görs på rätt sätt, frysskada skall uppkomma rendering vävnaden oanvändbar för histologisk utvärdering. Efter frysning, måste vävnaderna omedelbart lagras på torr is och överfördes sedan till en ultra låg temperatur (-80 ° C) frys tills snittning. Det är viktigt att notera att vävnader inte bör tas bort från frysen utan att vara på torris eftersom frysning-upptining kommer också skada vävnadsarkitektur.
En annan del av betydelse när du utför histologiska analysen är att vara noga med att alltid analysera samma del av vävnaden av intresse för att säkerställa enhetlighet mellan analys. Detta kan göras för muskel sektioner genom att utföra analys av midbelly. Detta är den del av den muskel som är den tjockaste och därför kommer att ha den största tvärsektionsarean. För att säkerställa att du verkligen är sektionering midbelly bör CSA efterföljande sektioner mätas med hjälp av histologiska bildprogram. Measurement bör fortsätta att göras förrän den tvärsnittsarea börjar platå. När detta inträffar, har mitten magen nåtts; Endast denna del av vävnaden ska användas för histologisk analys för att säkerställa enhetlighet mellan jämförelser.
Efter sektionering har slutförts och diabilder har upprättats, ska de torka vid rumstemperatur under 1 - 2 tim. Torkning medger korrekt vidhäftning av avsnittet till bilden och även förhindrar överflödigt vatten att kristallisera efter överföring till -80 ° C frys. Det är viktigt att notera att glider också bara bör hanteras på torris när val av diabilder för analys för att förhindra frys-tö-cykler. När bilder har valts ut för färgning, ingår protokoll med fläcken bör följas först på försöksbasis fram optimala resultat har uppnåtts. När du utför immunfärgning, är det viktigt att se till att diabilder inte torka under hela förfarandet. Torkning av bilder kan orsaka övergående samverkans för att förbli intakt efter inkubering. Dessa interaktioner kan inte avlägsnas under tvättar och resultera i icke-specifik färgning. Torkning kan undvikas genom att hålla objektglasen i en fuktad atmosfär. Utföra inkubationer med delar som är täckta med parafilm och diabilder på en fuktig pappershandduk förseglade i en liten bild ruta är tillräcklig för att säkerställa diabilder torkar inte på någon punkt under förfarandet.
Histologi är ett viktigt verktyg i visualisera morfologi och olika aspekter av patologi. Medan något trivialt, är det av största vikt att ta stor omsorg i beredningen av vävnader som skall användas för histologi. Från excision frysning, sektionering och färgning, bör vävnaderna hanteras på ett sätt som kommer att undvika frysskador och ge de mest exakta bilder möjligt. Utan ordentlig bevarande kommer färgningen inte korrekt återspeglar fysiologi och därmed leda till feltolkningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat | Leica CM 1850 | Leica Microsystems Inc. | Buffalo Grove, IL 60089 U.S.A., office phone 1-800-248-0123 Alternative: Richard Allen Scientific |
| Microscope | Nikon Eclipse 50i | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternative: Olympus |
| Image analysis software | Nikon Imaging Software Basic Research | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternatives: Image J, Metamorph |
| Isoflurane | 14043-220-05 | JD Medical Dist. Co., Inc. | 1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 U.S.A. |
| OCT | 4583 | Sakura Inc. | Torrence, CA 90501 U.S.A. Alternative source: Leica Microsystem |
| Freeze It | 23-022524 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Disposable tissue mold | 22-363-554 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Colorfrost plus slides | 9991001 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Acetone | 650501-4L | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Ethyl alcohol | HC-1300-1GL | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| 2-methyl butane | M 32631-SL | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Xylene | HC-7001GA | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Cytoseal 280 | 8311-4 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Hematoxylin Gill #3 | CS402-1D | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Eosin | 6766007 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
References
- Bonnemann, C. G., et al. Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies. Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).
- Caughey, J. E., Pachomov, N. The diaphragm in dystrophia myotonica. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 22, 311-313 (1959).
- Fetterman, G. H., Wratney, M. J., Donaldson, J. S., Danowski, T. S. Muscular dystrophy. I. History, clinical status, muscle strength, and biopsy findings. AMA J Dis Child. 91, 326-338 (1956).
- Platzer, A. C., Chase, W. H. Histologic Alterations in Preclinical Mouse Muscular Dystrophy. The American journal of pathology. 44, 931-946 (1964).
- Mercuri, E., et al. Muscle magnetic resonance imaging involvement in muscular dystrophies with rigidity of the spine. Ann Neurol. 67, 201-208 (2010).
- Tasca, G., et al. Different molecular signatures in magnetic resonance imaging-staged facioscapulohumeral muscular dystrophy muscles. PloS one. 7, e38779 (2012).
- Girgenrath, M., Dominov, J. A., Kostek, C. A., Miller, J. B. Inhibition of apoptosis improves outcome in a model of congenital muscular dystrophy. The Journal of clinical investigation. 114, 1635-1639 (2004).
- Kumar, A., Yamauchi, J., Girgenrath, T., Girgenrath, M. Muscle-specific expression of insulin-like growth factor 1 improves outcome in Lama2Dy-w mice, a model for congenital muscular dystrophy type 1A. Human molecular genetics. 20, 2333-2343 (2011).
- Mehuron, T., et al. Dysregulation of matricellular proteins is an early signature of pathology in laminin-deficient muscular dystrophy. Skeletal muscle. 4, 14 (2014).
- Yamauchi, J., Kumar, A., Duarte, L., Mehuron, T., Girgenrath, M. Triggering regeneration and tackling apoptosis: a combinatorial approach to treating congenital muscular dystrophy type 1 A. Human molecular genetics. 22, 4306-4317 (2013).
- Sheriffs, I. N., Rampling, D., Smith, V. V. Paraffin wax embedded muscle is suitable for the diagnosis of muscular dystrophy. Journal of clinical pathology. 54, 517-520 (2001).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33, 845-853 (1985).
- Maccarty, W. C. The Diagnostic Reliability of Frozen Sections. The American journal of pathology. 5, 377-380 (1929).
- Shi, S. R., et al. Evaluation of the value of frozen tissue section used as 'gold standard' for immunohistochemistry. Am J Clin Pathol. 129, 358-366 (2008).
- Turan, T., et al. Accuracy of frozen sections for intraoperative diagnosis of complex atypical endometrial hyperplasia. Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP. 13, 1953-1956 (2012).
