Introduction
바로 로즈 벵갈 유도 다음과 같은 생체 내 세포 반응의 기술 설명을 허용 시각화는 그대로 마우스에 photothrombosis. 로즈 벵골 (4,5,6,7- 테트라 클로로 -2 ', 4', 5 ', 7'- tetraiodofluorescein)는 동물 모델에서 허혈성 뇌졸중 (마우스 및 래트)을 유도하기 위해 사용되는 감광성 염료이다. 564 nm의 레이저 광에 얇게 두개골을 통해 꼬리 정맥을 통해 조사 및 후속 RB의 볼 루스 주입 후, 혈전 생리적 뇌졸중을 일으키는 한 유도된다. 이 방법은 원래 1977 년에 로젠과 엘 Sabban 설명하고, 이후 1980 년대 중반 1, 2에서 왓슨에 의해 채택되었다. 요컨대, 로즈 벵갈이어서 조직 인자, 혈액 응고 캐스케이드의 개시제를 활성화 반응성 산소 종의 생성을 생성 녹색 여기 광 (우리의 경우에 561 nm의 레이저)을 조사한다. 응고 캐스케이드의 유도는 레 허혈성를 생산임상 스트로크 3 병리학 관련 이온.
스트로크는 뉴런, 아교 세포, 내피 세포 및 면역계 세포 등 다양한 종류의 상호 작용으로 인해 복잡한 기전을 갖는다. 최고의 기술을 선택하는 것은 특정 세포 프로세스가 여러 고려 사항을 필요로 공부한다. 실험 방법은 세 개의 범주에 폭넓게 나뉘어 시험 관내에서, 각각 갖는 장단점 생체 내 및 실리코 체외 연구는 자연 환경으로부터 세포를 제거하는 주요 단점이 있으므로 그대로 볼 효과를 재현 할 수있다. 살아있는 동물. 생체 기법 증가 병진 의미와 질환 상태의 개선 실험 복제를 제공한다. 실리코 일반적 질환 또는 세포 처리의 컴퓨터 모델링을 의미하며, 점점 시험을위한 잠재적 약물 상호 작용을 연구하는데 이용하면서PLE, 수집 된 정보는 여전히 세포 나 조직 생활에서 테스트해야합니다.
실험실 설정에서 뇌졸중의 이상적인 모델은 인구에서 본 것과 유사한 병리학 적 특징을 설명한다. 인구 뇌졸중 일반적인 생리적 특성이 있지만, 손상 발생의 종류에 따라 많은 차이도있다. 인구의 스트로크는 다양한 경색 볼륨뿐만 아니라 각 병리에 관한 메커니즘의 차이에 그 결과 크고 작은 혈관 폐색, 출혈 병변과 동맥이나 심장 - 색전증 동맥에 발생합니다. 뇌졸중 동물 모델을 이용하는 이점은 인간 스트로크 특성을 모방 재현성 경색의 발생이다. 중간 대뇌 동맥 폐색 (색전이나 혈관 필라멘트 방법)하는 모델 말단 MCAO 및 photothrombosis 모델 : 가장 일반적인 동물 스트로크 모델은 사용 동맥 폐쇄를 포함한다. 장점각 모델의 D 단점은 (4 및 5 참조) 다른 곳에서 검토되고있다. 글로벌 허혈성 모델 (MCAO), 수행 상대적으로 쉬운 초점 뇌졸중 모델보다 인간의 스트로크에 덜 관련이있다. 또한, 이러한 방법은 재현성 뇌 경색 병변을 유도 매우 다양하다. 실험이 MCAO 모델을 통해 분명한 이점을 제공 아니라 자신의 실험을 제어로 photothrombosis 모델만큼 높은 재현성이다. 그러나, 미세 혈관 비방에 모델은 최소한의 허혈성 주변부, 세포 -6,7- 살릴 것으로 생각되는 영역을 표시하기 위해 설명되었다. 또한 vasogenic 부종 및 세포 독성 부종 형성은 또한 이미징 영역의 다음 조사를 유도 할 수있다. 이러한 제한에도 불구하고 기술은 스트로크 8, 9, 10, 11 다음의 많은 생리적 과정에 새로운 통찰력을 제공했다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
참고 : 모든 동물의 절차는 텍사스 건강 과학 센터 샌 안토니오 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인 도착 도착 가이드 라인과 일치했다되었다.
1. 두피 준비를위한 마취
- 마취를 유도하는 산소와 혼합 2~3% 이소 플루오 란으로 유도 챔버에 놓고 마우스. 마우스가 유도로 호흡 속도 감소를 관찰합니다. 마우스가 코 콘으로 이동 준비가되어 있는지 여부를 확인하려면 마우스의 발을 꼬집어. 주 : 마취 레벨이 어떤 생체 제조에서 중요한 단계 및 관리에 글로벌 허혈 발생할 수준을 유도하지 않도록주의해야한다.
- 마우스가 충분히 마취되면, 수술 / 이미징 플랫폼에 동물을 전송하고 노즈콘에서 마우스의 코를 배치하고 마취 상태를 유지 1-1.2 % 이소 플루오 란을 적용한다. 마우스가 온도 공동에 누워 있는지 확인ntrolled 가열 패드 나머지 절차 내내 체온 (37 ° C +/- 0.5 ° C)를 유지한다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈을 통해 수의사 연고를 놓습니다.
- 시스템과 함께 제공되는 꼬리 클립이나 발을 사용하여 산소 포화도 시스템을 사용하여 마우스의 생리 모니터. 호흡 속도가 50-65 호흡 / 분 사이에 유지되어 있는지 확인합니다. 동물의 장기 생존을 보장하기 위해 97~98% 사이에 유지되는 BPM과 산소 포화도 300-450 사이에 심장 박동이 남아 있는지 확인합니다.
- 마우스가 적절하게 마취되면, 전기 면도기를 사용하여 두개골을 통해 머리를 면도 에탄올 면봉 다음 잔류 머리와 betadine 깨끗를 제거합니다. 무균 수술 환경을 보장하기 위해 세 번에이 절차를 반복합니다.
2. 수술
- 완전히 청소하고 면도 두피로, 두개골 fissu을 나타 내기 위해 마우스의 두피에 5mm의 절개를입술과 브레 그마를 찾습니다.
- 두개골 상부에 남아있는 근막을 제거하기 위해 멸균면 주걱을 사용합니다.
- 브레 그마의 정위 좌표를 사용하여 두정 피질 위에 놓인 뼈 조직 접착제로 맞춤 제작 한 스테인레스 스틸 링 (그림 1) 접착제 : 측면 -1 -3 mm이고 : 2~4mm을. 주 : 접착제는 일반적으로 뼈가 상 링의 배치 후 2 분 이내에 설정한다.
- 마우스를 안정화 및 이미징 동안 움직임을 방지하도록 정위 홀더 (도 2)에 링 부착합니다.
- 수술 학년 해부 현미경, 천천히 속도 제어 DREMEL 같은 도구 (마이 징거 3.9 mm의 드릴 비트)가 드릴 된 바와 같이 지역 수준을 유지해야하기을 사용하여 두개골에 1-2mm 섹션을 드릴. 지그재그 패턴을 이용하여이를 달성. 열을 방지하기 위해 구축, 낮은에 드릴 속도를 설정하고 자주 휴식을 취.
- 두개골 두개골 모양 시니가 될 때, 숱이 계속얇아진 표면 수준을 유지하기 위해 같은 지그재그 패턴을 이용하여 메스 블레이드를 이용하여 두개골의 뇌 두개골의 얇은 층의 제거를 용이하게 매끄럽게한다. 한 번에 뼈의 얇은 층을 제거하는 가벼운 압력으로 작은 선형 스트로크을 메스 블레이드의 팁을 사용. 혈관이 명확하게 해부 현미경을 통해 볼 때까지이 작업을 계속합니다.
- 실험을 통해 천공 또는 씨닝 공정 동안에 두개골을 어기면, 인해 기저 피질 가능성 손상 동물을 안락사.
주 : 마우스의 두개골은 대략 300 μm의 두께를 얇게되어 두 치밀골 층 (외부 하나는 내부 층)과 치밀골의 두 층 사이에 개재 해면골의 층으로 구성된다. 외부 치밀골의 층과 해면골의 대부분이 남아 치밀골의 대략 50 μm의 층에 생성 5mm 시추 지역은 제거된다 (도 2b 참조). Visualiz혈관의 ATION 최종 그대로 얇게 두개골이 약 50 μm의 두께를 있는지 확인합니다. 이 두께로 얇아 때 두개골은 여전히 그러므로 존재한다.
3. 현미경 셋업
- 목표 인버터가 거꾸로 현미경 시스템 (종래의 공 촛점 또는 두 광자 시스템)를 사용합니다. 주 : 표준 직립 현미경을 이용하는 것도 가능하다. 제한 요소는 무대와 목표 사이의 공간이 될 것입니다. 무대에 대한 수정이 설정을 수행 할 필요가있을 수있다.
- 옆 현미경의 기초를 위치 맞춤 제작 단계에 수술 / 영상 플랫폼을 고정합니다. 주 : 플랫폼 대물 하에서 수술 / 이미징 플랫폼의 수직 이동을 허용하도록 실험실 잭을 이용하여 이루어진다. 실험실 잭은 네 개의 원통형 기둥에 고정 플레이트에 장착된다. (그림 2 참조).
- 20X를 포함하는 목표 인버터를 배치두개골 창을 통해 목표. 현미경의 접안 렌즈를 통해 보면 두개 창을 찾아 이미징 영역에서 목표 위치를 외부 광원을 사용한다. 주 : 촬상 영역이 혈관의 존재에 의해 표시 될 것이다.
- 수성 목표를 들어, 인공 뇌척수액 (ACSF)를 사용하여 매체로 인해 잠재적으로 (30 mM의 KCl을 130 mM의 염화나트륨을 200 mM의 NaHCO3를; 30 mM의 HEPES, 100 mM의 포도당 KH 2 PO 4 12 mM의) 영상 중 두개골 공동으로 누설 (그림 3).
4. 로즈 벵갈 염색 준비, 관리 및 뇌졸중의 유도
- 인공 뇌척수액 (ACSF) 로즈 벵골의 신선한 20 ㎎ / ㎖ 솔루션을 준비; 필터링 및 관리하기 전에 소독. 재사용 또는 혼합 된 후에 로즈 벵갈 보관하지 마십시오. 각 실험에 대한 새로운 솔루션을합니다.
- 로즈 벵갈의 동안의 0.1 ml의 꼬리 정맥 주입을 줘561 nm의 레이저를 두개 창 통조림 것은 용액의 주입을 충분히 보장한다. 참고 : 장미 벵골은 뇌의 혈관에 주입 한 후 5 초 이내에 가시화 될 것이다. 전체 용기는 로즈 벵갈로 가득해야합니다.
- 벵갈 로즈 염료의 적절한 주입에 이어 병변 특정 부피의 재현성을 보장하기 위해 용기 직경 (40-80 μm의)에 기초하여, 혈전증 적절한 용기를 선택한다. 혈액 흐름의 방향을보고 동맥과 정맥 사이에 차별화 : 동맥 작은 직경의 혈관에 더 큰 직경에서 이동, 혈관 직경이 큰 혈관에 작은에서 이동합니다. 로즈 벵갈가 주입되면이 쉽게 시각화하여 수행됩니다.
- 다음과 같이 현미경 설정을 변경 :
- 지속 시간을 늘립니다. 참고 :이 사용되는 현미경 시스템에 따라 달라질 수 있습니다.
- 100 %로 레이저 파워를 높입니다.
- 를 사용하여 1 프레임 / sec로 시계열 화상 모아서최대 스캔 속도.
- 안정된 혈전이 혈관 내에서 형성 될 때까지 마우스를 스캔합니다. 참고 :이 일반적으로 연속 스캔의 5 분 이내에 달성된다 (그림 4 참조).
- 벵갈 로즈를 이용하여 혈전 형성의 유도에 따라, 다시 해부 현미경으로 촬상 영역에서 마우스를 제거한다. 조심스럽게 두개골 두개골에서 스테인리스 스틸 링을 제거합니다. 출혈의 두개골 창을 검사합니다. 출혈이 발생하면, 실험 종료.
- 두개골을 통해 절개를 닫 6.0 모노 필라멘트 봉합사를 사용합니다. 감염을 방지하기 위해 봉합 라인을 따라 항생제 연고를 놓습니다. Buprenex (0.05 ㎎ / ㎏) 통증 관리를위한 3 일 동안 피하 매 12 시간을 주입한다.
- 완전히 깨어 자유롭게 이동 될 때까지 마취에서 제거 다음 복구 챔버에 마우스를 돌려줍니다.
- 나중에 추가 조사를 위해 깨끗한 케이지에 마우스를 돌려줍니다.
(5). 이후의 일에 종 이미징
- 이후 일 이후 photothrombosis에 종 이미징을 수행하기 위해 다음과 같은 방법을 사용합니다.
- 방법 1 섹션에 기재된 바와 같이, 마우스를 마취.
- 적절한 마취되면 미리 드릴 된 촬상 필드를 덮는 피부를 다시 봉합하는 임의의 잔류를 제거하여 두피를 다시 연다.
- 두개골 상부에 남아있는 근막을 제거하기 위해 멸균면 주걱을 사용합니다.
- 이전 이미지 필드를 덮는 뼈 조직 접착제 주문품 스테인리스 링 (도 1)을 붙인다.
- 마우스를 안정화 및 이미징 동안 움직임을 방지하도록 정위 홀더 (도 2)에 링 부착합니다.
- 이전에 얇게 두개골의 기초가되는 혈관을 찾습니다. 이전에 유도 된 혈전의 존재를 확인하기 위해 FITC 덱스 트란의 꼬리 정맥 주사를 사용한다.
- 의를 닫 6.0 모노 필라멘트 봉합사를 사용하여두개골을 통해 정밀도 범위. 감염을 방지하기 위해 봉합 라인을 따라 항생제 연고를 놓습니다. Buprenex (0.05mg / kg) 통증 관리를위한 3 일 동안 피하 매 12 시간을 주입한다.
- 완전히 깨어 자유롭게 이동 될 때까지 마취에서 제거 다음 복구 챔버에 마우스를 돌려줍니다.
스트로크 유도 6. 확인 (사후)
- 연구의 결론에서,도 5에 도시 된 바와 같이, 2,3,5- 트리 페닐 테트라 졸륨 클로라이드 (TTC) 염색을 이용하여 심 박출량을 확인. 전체 방법은 12에서 찾을 수있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 방법의 목적은 561 nm의 레이저 광과 두개골의 박형화 꼬리 정맥을 통해 조사 및 후속의 RB 루스 주사 다음 동물 모델에서 허혈성 뇌졸중 (마우스 및 래트)을 유도했다. 도 4의 이미지는 0, 1, 1.5, 2 분으로 조사 영역의 다음 단일 용기 내 혈전 형성의 진행을 보여준다. 혈전 형성하기 전에 전체 선박 로즈 벵갈 흐르는 확보로 인해 흰색입니다. 선박의 조사의 유도에 따라이 선박의 부분에 명백한 어둡게하고 혈전 형성 (프레임 1과 1.5 분)의 유도를 나타냅니다. 완전한 폐쇄 후 혈관 내 응고 (검은 부분) 앞의 장미 벵골 염료 (흰색 영역)의 현저한 축적이있다. 이분 프레임은 동맥의 완전한 폐색을 보여준다.
허혈성 뇌졸중의 TTC 염색의 존재가 활용 될 수 확인합니다. TTC는 공동mmonly 건강한 조직에서 붉은 TTC 포르 마잔 생성물의 형성에 의해 뇌경색의 검출에 얼룩을 사용했다. 포르 마잔 생산 (흰색 조직)의 결여는 경색 부분을 나타낸다. 그림 5에서 상자로 표시된 영역은 혈관 직경 약 80mm 내에서 생산되는 응고 다음과 같은 두 개의 분리 된 동물에서 1, 오일 얻은 전형적인 병변의 크기를 보여줍니다. 이미지 분석은 플랫 베드 스캐너와 ImageJ에 소프트웨어의 사용에 대해 수행된다. 관심 지역 각 뇌 행정 용적의 면적을 측정하기 위해 내부 ImageJ에 그려 질 수있다.
그림 1. 스테인레스 스틸 링 세 뷰 (상부, 측면 및 저면도)은 정위 홀더에 부착하고, 마우스 두개골에 적용 스테인리스 링 홀더 나타낸다.
그림 2 :. RB photothrombosis에 대한 현미경 이미징 플랫폼 설치 외과 / 이미징 플랫폼은 원추형 두부와 마취 튜브와 동안 동물의 이동을 감소시키기 위해 동물의 두개골에 부착 된 스테인레스 스틸 링 정위 홀더 홀더를 포함 영상. 플랫폼의 상부에 배치되고 현미경 대물 하에서 마우스를 위치시키는 수직 이동을 허용하도록 실험실 잭에 고정된다. 실험실 잭이어서 수평 이동 가능 현미경 스테이지에 부착된다. 현미경 스테이지의 위에 놓고 네 원통형 기둥에 고정된다.
그림 3 : 목표 INV에서 영상 / 외과 플랫폼 설계 및 방향의 그림erter. (A) 왼쪽에있는 패널은 마취 마우스 (마취 코 콘은 사진 촬영을 위해 잠시 제거)의 위치의 대표 이미지를 보여줍니다. 촬상 절차 걸쳐 인공물 호흡의 기여를 감소 마우스 두개골을 첨부 텀 스틸 링의 사용을 참고. 오른쪽 이미지는 해부 현미경 피질 윈도우의 이미지를 보여준다. 경막과 두개골의 전체 두께에 관하여 얇아진 영역의 두께와 관련하여 두개골의 층들을 보여주는 뷰에서 관상 얇은 스컬 제제 (B) 스케치.
그림 4 : 로즈 벵갈 혈전 형성의 그림 꼬리 VEI 통해 주입 된 장미 벵골 염료를 포함하는 단일 용기의 대표 이미지.마우스의 N. 이미지는 0, 1, 1.5, 2 분으로 조사 영역의 다음 용기 내에 혈전 형성의 진행을 보여준다. 동맥의 완전 폐쇄를 보여주는 2 분 프레임에서 혈전 (검정색) 앞의 로즈 벵갈 염색 (흰색)의 축적을합니다.
그림 5 : RB에 의한 병변의 2,3,5- 트리 페닐 클로라이드 (TTC) 이미지 대표 이미지는 1 일 5 후 photothrombosis 유도에 표시됩니다.. 마우스를 희생하고 뇌를 신속하게 표준 방법에 따라 제거하고, 1mm 콜로 날 섹션 (coronal section)으로 슬라이스하고 TTC로 염색 하였다. TTC는 건강한 조직에 붉은 TTC 포르 마잔 생성물의 형성에 의해 뇌경색의 검출에 일반적으로 사용되는 염색이다. 포르 마잔 생산 (흰색 조직)의 결여는 경색 부분을 나타낸다.박스로 표시된 영역은 직경이 약 80 μm의 용기 내에 생성 된 응고에 따라 얻어진 전형적인 병변 크기를 보여준다.
그림 6 : 로즈 벵갈 photothrombotic 절차의 도식 표현.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
인간의 응용 프로그램에 동물 실험에서 스트로크 병태 생리를 번역 할 수있는 능력은 실패로 고생하고있다. 그러나, 이러한 모델 photothrombosis 같은 동물 모델의 사용은 개선 된 뇌졸중 병태 생리에 대한 이해와 스트로크 다음 신경 보호를 제공하기위한 새로운 치료 적 접근법의 탐색을 허용한다. 작은 대뇌 피질의 스트로크와 photothrombotic 모델에 의해 생성 microinfarctions은 높은 유병률을 가지고 있으며, 미국 인구 (약 1천1백만명) 매년 16의 약 4 %에 영향을 미치는 무증상 또는 "침묵"뇌졸중 13-15에 임상 적이다. 자동 스트로크는 중간 대뇌 동맥 (MCA) 폐색 또는 일과성 허혈 발작 (TIA) (17)에서 볼 수 있듯이 이러한 마비, 감각 손실과 어려움으로 큰 스트로크에 존재하는 고전적인 뇌졸중 증상이, 발표자가 없습니다. 또한, 침묵 뇌졸중은 열공 뇌졸중, 다른 어떤깊은 뇌 구조 또는 뇌간 내에서 하나의 관통 동맥의 폐색에 의해 발생하며 임상 적으로 모터, 감각 또는 혼합 적자 (18) 명단이다. 무증상 또는 "침묵"뇌졸중 환자는 일반적으로 어떤 외부 증상을 표시하고 그들은 심지어 뇌졸중으로 고통을 종종 모르고있다가 없습니다. 메모리에 적자, 의사 결정과 행동의 변화에 의해 나타나는인지 기능의 무증상 감소에 자동 스트로크 결과. 시간이 지남에 따라, 다수의 침묵 스트로크 혈관 또는 다중 경색 치매로 알려진 기억 상실의 임상 적으로 유의 한 징후로 이어집니다. 그러나 침묵 뇌졸중 뇌 손상은 뇌 영상을 이용하여 검출하고, 미래 19 TIA 위험 및 주요 행정에서 환자를 배치 할 수 있습니다.
photothrombosis 모델 콤비에 감광성 염료를 로즈 벵골 (RB)을 이용하여 완전한 마취 마우스의 생체 내에서의 혈전증 모델에서 재현의 생산을 허용공 초점 현미경과 국가. 생체 photothrombosis 모델의 많은 장점이 있습니다. 이 방법의 장점은 정위 좌표를 이용하여 스트로크의 위치를 미리 정의 할 수있는 능력이다; 하나의 동물에 걸쳐 특정 세포 집단을 연구 할 수 있도록. 또한 병변의 크기 및 볼륨의 재현성이 잘 레이저 광의 강도 변화를 조사하여, 20되는 용기의 크기에 대한 제어함으로써이 방법을 이용하여 제어된다. 이 방법은 자세한 경색 주변의 신경 전달의 변화 연구와 반대측 피질 (4)에 대응이 가능합니다. 단일 스트로크 자동 최소 결손이 발생하지만,이 모델의 재현성은 혈관성 치매 등의 각종 뇌 기능 장애를 모방하는 데 사용될 수있는 특정 영역에서 다수의 스트로크를 자동 유도하는 능력을 허용한다. 다중 스트로크 자동 임상 분명 적자 간의 문턱의 개발은 정시에 결정될 수있다FIC이 방법의 사용을 통해 뇌의 영역뿐만 아니라. 마지막으로, 모델은 급성 및 만성 모두 효과를 관찰 할 수 있도록 같은 동물의 종 방향 연구 수 있습니다.
photothrombosis 모델을 사용의 단점은, 그러나있다. 한 가지 단점은, 초점 선 (4)의 다른 모델에 비해 작은 허혈성 주변부를 갖는 것으로 언급되어 병변의 생산을 포함한다. 둘째, vasogenic 및 세포 독성 부종 형성 인해 더 가깝게 초점 4 스트로크보다 외상성 뇌 손상과 유사한 photothrombosis의 유도시 발생할 수있는 손상시킬 수있다.
photothrombosis 모델을 사용하면 실험 내내 모니터링해야 요인들이있다. 그것은 동물의 생리 학적 상태가 모든 촬상 과정에 걸쳐 모니터링하는 것이 중요하다. 이곳은 마취 레벨 생리 성 영향을 미칠 수 있다고 알려져있다마취 위에 일으키는 동물의 ATUS은 동물에게 심장 박동수 및 산소 공급을 감소시켰다. 이 허혈의 결과 뇌에 산소의 유용성을 감소 하듯이, 중요한 고려 사항이다. 따라서, 시스템의 사용의 비 침습적 동시 기록을 허용한다 동물의 생리 학적 상태를 모니터링 할 : 동맥혈 산소 포화도 (SPO 2); 심장 박동; 호흡 속도; 펄스 팽만 (로컬 혈류 및 신호 품질의 지표); 호흡 팽창 (intraplueral 압력 대리) 마우스 및 쥐의 핵심 온도. 임상 스토크의 혜택을 실험 결과를 번역에서 예상치 못한 교란을 줄이기 위해 어떤 동물 모델로 작업 할 때 그것은 마취를 통제 점점 더 중요 해지고 것은 교란. 선택 기간 및 마취 깊이 실험 뇌졸중 동물 모델에서 극적인 영향을 미칠 수있다. 연구는 마취제가 경색시를 줄일 수 있다는 것을 증명하고있다제국의 아이들, 심지어 뇌허혈 21-23,24에서 몇 가지 보호 기능을 제공 할 수있다. 또한, 활성 산소 종의 생성의 변화는 또한 할로 탄 및 프로포폴 (25)의 사용을 비교 연구에서 증명되었다. 스트로크와 연관된 신경 사망의 주요 가정 중의 하나는 반응성 산소 종의 생산이기 때문에 혼란이 중요하다.
뇌졸중은 뇌의 반응을 연구 생체 현미경 활용 한 합병증 달성 촬상 깊이의 한계이다. 이광자 현미경을 사용하여 400 내지 500 ㎛의 사이에,이 깊이를 높일 수있는 반면 공 초점 현미경을 사용하여 실험실에서 달성 될 수있는 촬상 깊이는 100 내지 200 ㎛의 범위이다. 이 교란은 증가 작동 거리와 크기를 감소 목표의 개발에 의해 완화되고있다. 예를 들어, 경사 굴절률 (GRIN) 마이크로 렌즈 microendoscopes 재치 아르35-1,000 μm의 사이의 시간 직경 및 날짜에 사용할 수있는 가장 작은 수 있습니다. 이러한 유형의 프로브는 침습적 손상을 일으키는 낮은 개구가없이 조직 내로 삽입 될 수 없다. 때문에 낮은 NA에 해상도는 기존의 광학 현미경 목표 (26)에 비해 열등하다.
요약하면, 로즈 벵갈 photothrombosis 모델은 소형의 경색을 유도하고 잘 정의 된 세포 집단에서 급성 및 만성 단계 모두에서 경색에 대한 세포 반응을 연구에 유용하다. 이 모델은 초점 허혈 다음 MCAO로 볼 필수적인 세포의 특성을 보여줍니다 때문에 neuroregenerative / 신경 치료를 평가하는데 유용하다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Rose Bengal | Sigma | 330000 | |
| Isoflurane Anesthetic | MWI Veterinary Supply | 088-076 | |
| Vetbond | 1469SB | 1469SB | |
| aCSF | 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucose and 26 mM NaHCO3 (pH 7.4). | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dissecting Scissors | Bioindustrial Products | 500-410 | |
| Operating scissors 14 cm | Bioindustrial Products | 12-055 | |
| Forceps Dumont High Tech #5 style, straight | Bioindustrial Products | TWZ-301.22 | |
| LabJack 132X80 | Optosigma Co | 123-6670 | |
| Platform for Labjack 8X 8 | Optosigma Co | 145-1110 | |
| Ear bar holder from stereotaxic setup | Stoelting/Cyborg | 51654 | |
| Dispomed Labvent Rodent anesthesia machine | DRE, Inc. | 15001 | |
| Tech IV Isoflurane vaporizer | DRE, Inc. | 34001 | |
| F Air Canister | DRE, Inc | 80120 | |
| Bain circuit breathing tube | DRE, Inc | 86111B | |
| Rodent adapter for bain tube | DRE, Inc | 891000 | |
| O2 regulator for oxygen tanks | DRE, Inc | CE001E | |
| Rodent induction chamber | DRE, Inc | 15004C | |
| Ethicon Silk 6-0; 18 in with P-3 needle | Suture Express | 1639G | |
| Objective inverter Optical Adapter | LSM technologies | ||
| Foredom drill Dual voltage 110/120 | Foredom | 134.53 | |
| Meisinger 3.9 mm drill bit | Meisinger | (Ref#310 104 001 001 009) | |
References
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17, 497-504 (1985).
- Rosenblum, W. I., El-Sabban, F. Platelet aggregation in the cerebral microcirculation: effect of aspirin and other agents. Circulation Research. 40, 320-328 (1977).
- Owens, A. P. 3rd, Mackman, N. Sources of tissue factor that contribute to thrombosis after rupture of an atherosclerotic plaque. Thrombosis Research. 129, Suppl 2. S30-S33 (2012).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2, 396-409 (2005).
- Manual of stroke models in rats. , 332 CRC Press. (2009).
- Herz, R. C., Kasbergen, C. M., Hillen, B., Versteeg, D. H., de Wildt, D. J. Rat middle cerebral artery occlusion by an intraluminal thread compromises collateral blood flow. Brain Research. 791, 223-228 (1998).
- Brint, S., Jacewicz, M., Kiessling, M., Tanabe, J., Pulsinelli, W. Focal brain ischemia in the rat: methods for reproducible neocortical infarction using tandem occlusion of the distal middle cerebral and ipsilateral common carotid arteries. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism : Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 8, 474-485 (1988).
- Zheng, W., et al. Purinergic receptor stimulation reduces cytotoxic edema and brain infarcts in mouse induced by photothrombosis by energizing glial mitochondria. PloS One. 5, e14401 (2010).
- Zheng, D. M., Wewer, J., Lechleiter, J. P. 2Y. 1R. -initiated IP3R-dependent stimulation of astrocyte mitochondrial metabolism reduces and partially reverses ischemic neuronal damage in mouse. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 600-611 (2013).
- Witte, O. W., Stoll, G. Delayed and remote effects of focal cortical infarctions: secondary damage and reactive plasticity. Advances in Neurology. 73, 207-227 (1997).
- Hagemann, G., Redecker, C., Neumann-Haefelin, T., Freund, H. J., Witte, O. W. Increased long-term potentiation in the surround of experimentally induced focal cortical infarction. Annals of Neurology. 44, 255-258 (1998).
- Kramer, M., et al. TTC staining of damaged brain areas after MCA occlusion in the rat does not constrict quantitative gene and protein analyses. Journal of Neuroscience Methods. 187, 84-89 (2010).
- Blinder, P., Shih, A. Y., Rafie, C., Kleinfeld, D. Topological basis for the robust distribution of blood to rodent neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 12670-12675 (2010).
- Nishimura, N., Rosidi, N. L., Iadecola, C., Schaffer, C. B. Limitations of collateral flow after occlusion of a single cortical penetrating arteriole. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 30, 1914-1927 (2010).
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 365 (2007).
- Blum, S., et al. Memory after silent stroke: Hippocampus and infarcts both matter. Neurology. 78, 38-46 (2012).
- Heinsius, T., Bogousslavsky, J., Van Melle, G. Large infarcts in the middle cerebral artery territory Etiology and outcome patterns. Neurology. 50, 341-350 (1998).
- Wardlaw, J. What causes lacunar stroke. Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry. 76, 617-619 (2005).
- Inoue, Y., et al. Ischemic stroke under anticoagulant therapy]. Rinsho shinkeigaku. Clinical Neurology. 50, 455-460 (2010).
- Tiannan Wang, W. C., Xie, Y., Zhang, W., Ding, S. Controlling the Volume of the Focal Cerebral Ischemic Lesion through Photothrombosis. American Journal of Biomedical Sciences. 2, 33-42 (2009).
- Head, B. P., Patel, P. Anesthetics and brain protection. Current Opinion in Anaesthesiology. 20, 395-399 (2007).
- Kirsch, J. R., Traystman, R. J., Hurn, P. D. Anesthetics and cerebroprotection: experimental aspects. International Anesthesiology Clinics. 34, 73-93 (1996).
- Koerner, I. P., Brambrink, A. M. Brain protection by anesthetic agents. Current Opinion in Anaesthesiology. 19, 481-486 (2006).
- Gelb, A. W., Bayona, N. A., Wilson, J. X., Cechetto, D. F. Propofol anesthesia compared to awake reduces infarct size in rats. Anesthesiology. 96, 1183-1190 (2002).
- Bhardwaj, A., Castro, I. A., Alkayed, N. J., Hurn, P. D., Kirsch, J. R. Anesthetic choice of halothane versus propofol: impact on experimental perioperative stroke. Stroke; A Journal Of Cerebral Circulation. 32, 1920-1925 (2001).
- Barretto, R. P., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses. Nature Methods. 6, 511-512 (2009).
