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Medicine

Confocal ऑप्टिकल इमेजिंग द्वारा गुलाब बंगाल Photothrombosis Published: June 23, 2015 doi: 10.3791/52794
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1
1Department of Cellular and Structural Biology, The University of Texas Health Science Center San Antonio, 2School of Medicine, The University of Texas Health Science Center San Antonio, 3Cell & Tissue Imaging Center, St. Jude Children’s Research Hospital

Introduction

तुरंत गुलाब बंगाल के शामिल होने के बाद में विवो सेलुलर प्रतिक्रियाओं की तकनीक का वर्णन किया परमिट दृश्य एक अक्षुण्ण माउस में photothrombosis। गुलाब बंगाल (4,5,6,7-tetrachloro -2 ',' 4, 5 ', 7'-tetraiodofluorescein) पशु मॉडल में इस्कीमिक स्ट्रोक (माउस और चूहा) को उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल एक सहज डाई है। एक 564 एनएम लेजर प्रकाश के साथ एक पतला खोपड़ी के माध्यम से पूंछ नस और बाद रोशनी के माध्यम से आरबी की एक सांस में इंजेक्शन के बाद, एक थक्का एक शारीरिक स्ट्रोक 1 के कारण प्रेरित किया जाता है। विधि मूल रूप से 1977 में Rosenblum और अल-Sabban द्वारा वर्णित किया गया था, और बाद में 1980 के दशक के मध्य 1,2 में वाटसन द्वारा रूपांतरित किया गया। संक्षेप में, गुलाब बंगाल बाद में ऊतक कारक, जमावट झरना की एक सर्जक को सक्रिय करता है जो प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन, उत्पन्न करता है जो हरे रंग उत्तेजना प्रकाश (हमारे मामले में 561 एनएम लेजर), के साथ विकिरणित है। जमावट झरना की प्रेरण लेस एक इस्कीमिक का उत्पादननैदानिक ​​स्ट्रोक से 3 विकृतिविज्ञानी प्रासंगिक है कि आयन।

स्ट्रोक न्यूरॉन्स, glia, अन्तःचूचुक और प्रतिरक्षा प्रणाली सहित कई विभिन्न कोशिकाओं प्रकार की परस्पर क्रिया की वजह से एक जटिल pathophysiology है। बेहतरीन तकनीक का चयन एक विशेष सेलुलर प्रक्रिया कई विचार की आवश्यकता का अध्ययन करने के लिए। प्रायोगिक तकनीक को तीन श्रेणियों में से एक में मोटे तौर पर गिरावट: इन विट्रो में, प्रत्येक होने के फायदे और नुकसान के साथ vivo में और सिलिको में इन विट्रो अध्ययन में उनके प्राकृतिक वातावरण से कोशिकाओं को हटाने के प्राथमिक नुकसान है और इसलिए एक अक्षुण्ण में देखा प्रभाव पुन: पेश नहीं हो सकता है। पशु रह रहे हैं। में vivo तकनीक में वृद्धि हुई अनुवादकीय महत्व के साथ रोग राज्यों की बढ़ी प्रयोगात्मक नकल के लिए प्रदान करते हैं। सिलिको में आम तौर पर एक रोग या सेलुलर प्रक्रिया के कंप्यूटर मॉडलिंग करने के लिए संदर्भित करता है, और तेजी से परीक्षा के लिए संभावित दवा बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपयोग करते हुएमिसाल, gleaned किसी भी जानकारी को अभी भी कोशिकाओं या जीवित ऊतक में परीक्षण किया जाना चाहिए।

प्रयोगशाला स्थापित करने में स्ट्रोक का एक आदर्श मॉडल मानव आबादी में देखा उन लोगों के लिए इसी तरह के रोग सुविधाओं का प्रदर्शन करना चाहिए। मानव आबादी में स्ट्रोक के आम शारीरिक विशेषताओं कर रहे हैं, अनुभवी चोट के प्रकार पर निर्भर करता है वहाँ भी कई मतभेद हैं। मानव आबादी में स्ट्रोक विभिन्न रोधगलितांश संस्करणों के साथ ही प्रत्येक विकृति से संबंधित तंत्र में मतभेद है कि परिणाम में के रूप में छोटे या बड़े पोत occlusions, रक्तस्रावी घावों, और धमनी या कार्डियो-embolisms धमनी के लिए होता है। पशु स्ट्रोक मॉडल के उपयोग का लाभ मानव स्ट्रोक की विशेषताओं है कि नकल प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य दौरे की पीढ़ी है। मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा (embolic या endovascular रेशा तरीकों) मॉडल जो बाहर का MCAO और photothrombosis मॉडल: सबसे आम पशु स्ट्रोक मॉडल का उपयोग धमनी रोड़ा शामिल हैं। फायदे एकप्रत्येक मॉडल की घ नुकसान (4 देख सकते हैं और 5) अन्यत्र समीक्षा की गई है। ग्लोबल इस्कीमिक मॉडल (MCAO), प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षाकृत आसान फोकल स्ट्रोक मॉडल हैं की तुलना में मानव स्ट्रोक के लिए कम प्रासंगिक हैं। इसके अलावा, इन तरीकों प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मस्तिष्क रोधगलितांश घावों उत्प्रेरण में अत्यधिक चर रहे हैं। प्रयोगकर्ता MCAO मॉडल पर एक स्पष्ट लाभ प्रदान करने, अच्छी तरह से अपने प्रयोगों के नियंत्रण के रूप में photothrombosis मॉडल लंबे समय के रूप में अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। हालांकि, की वजह microvasculature अपमान करने के लिए मॉडल एक न्यूनतम इस्कीमिक Penumbra, कोशिकाओं 6,7 salvageable माना जाता है जहां क्षेत्र प्रदर्शित करने के लिए वर्णित किया गया है। इसके अतिरिक्त, vasogenic शोफ और साइटोटोक्सिक शोफ गठन भी इमेजिंग क्षेत्र के निम्नलिखित विकिरण प्रेरित किया जा सकता है। इन सीमाओं के बावजूद तकनीक स्ट्रोक 8, 9, 10, 11 निम्नलिखित कई शारीरिक प्रक्रियाओं में नए अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है।

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Protocol

नोट: सभी पशु प्रक्रियाओं टेक्सास स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र सैन एंटोनियो विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति ने मंजूरी दे दी और आने के दिशा निर्देशों के अनुरूप थे गया।

1. Cortical तैयारी के लिए anesthetizing

  1. संज्ञाहरण प्रेरित करने के लिए ऑक्सीजन के साथ मिश्रित 2-3% isofluorane साथ एक प्रेरण कक्ष में माउस रखें। माउस प्रेरित किया जाता है के रूप में श्वसन दर में कमी को ध्यान से देखें। माउस नाक शंकु के लिए ले जाने के लिए तैयार है या नहीं यह निर्धारित करने के लिए माउस का पंजा चुटकी। नोट: संज्ञाहरण स्तर से किसी में विवो तैयार करने में एक महत्वपूर्ण कदम है और देखभाल के वैश्विक ischemia के कारण होगा कि एक स्तर प्रेरित करने के लिए नहीं लिया जाना चाहिए।
  2. माउस पर्याप्त anesthetized है, एक बार सर्जरी / इमेजिंग मंच करने के लिए पशु हस्तांतरण और नाक शंकु में माउस नाक जगह है और एक anesthetized राज्य बनाए रखने के लिए 1-1.2% isofluorane लागू होते हैं। माउस एक तापमान सह पर झूठ बोल रही है कि यह सुनिश्चित करेंntrolled हीटिंग पैड शेष प्रक्रियाओं के दौरान शरीर का तापमान (37 डिग्री सेल्सियस +/- 0.5 डिग्री सेल्सियस) बनाए रखने के लिए। संज्ञाहरण के तहत, जबकि सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम रखें।
  3. प्रणाली के साथ प्रदान की पूंछ या पैर क्लिप का उपयोग कर एक नाड़ी oximetry प्रणाली का उपयोग करने के लिए माउस के शरीर क्रिया विज्ञान की निगरानी करें। सांस की दर 50-65 साँस / मिनट के बीच बनाए रखा है कि जाँच करें। जानवर की लंबी अवधि के अस्तित्व को सुनिश्चित करने के लिए 97-98% के बीच बनाए रखा है बीपीएम और ऑक्सीजन संतृप्ति 300-450 के बीच हृदय की दर बनी हुई है कि जाँच करें।
  4. माउस पर्याप्त रूप से anesthetized है, जब, बिजली क़ैंची का उपयोग कपाल पर बाल दाढ़ी एक इथेनॉल झाड़ू द्वारा पीछा अवशिष्ट बाल और betadine के साथ स्वच्छ, हटा दें। एक बाँझ शल्य वातावरण सुनिश्चित करने के लिए तीन बार करने के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।

2. शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया

  1. पूरी तरह से साफ किया और मुंडा खोपड़ी के साथ, कपाल fissu प्रकट करने के लिए माउस की खोपड़ी में एक 5 मिमी चीरारेस और पर्वबिन्दु पता लगाने के लिए।
  2. कपाल overlying किसी भी शेष प्रावरणी दूर करने के लिए एक बाँझ कपास applicator के लिए उपयोग करें।
  3. शीर्षस्थान की stereotaxic निर्देशांक का उपयोग कर पार्श्विका कॉर्टेक्स overlying हड्डी करने के लिए ऊतक चिपकने के साथ एक कस्टम बनाया स्टेनलेस स्टील की अंगूठी (चित्रा 1) गोंद: पार्श्व -1 -3 मिमी और: 2-4 मिमी। नोट: गोंद आम तौर पर हड्डी पर अंगूठी की नियुक्ति के बाद 2 मिनट के भीतर सेट।
  4. माउस को स्थिर करने और इमेजिंग के दौरान आंदोलन को रोकने के लिए एक stereotaxic धारक (चित्रा 2) के लिए अंगूठी प्रत्यय।
  5. एक शल्य ग्रेड विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, धीरे धीरे एक गति नियंत्रित DREMEL जैसे उपकरण (Meisinger 3.9 मिमी ड्रिल बिट) यह drilled है के रूप में क्षेत्र स्तर पर रखने के लिए सुनिश्चित बनाने का उपयोग कर कपाल में एक 1-2 मिमी खंड ड्रिल। एक zig-zag पैटर्न का उपयोग कर इस लक्ष्य को हासिल। गर्मी से बचने के लिए का निर्माण, कम करने के लिए ड्रिल गति सेट और अक्सर टूट ले।
  6. कपाल खोपड़ी उपस्थिति में हाकी हो जाता है, Thinning जारी रखने केपतला सतह स्तर पर रखने के लिए एक ही zig-zag पैटर्न का उपयोग एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर खोपड़ी के कपाल खोपड़ी की पतली परत के सुचारू हटाने की सुविधा के लिए। एक समय में हड्डी की पतली परत को हटाने के लिए प्रकाश दबाव के साथ छोटे रेखीय स्ट्रोक बनाने स्केलपेल ब्लेड की नोक का उपयोग करना। वाहिका संरचना स्पष्ट रूप से विदारक माइक्रोस्कोप के माध्यम से दिखाई देता है, जब तक यह जारी रखें।
  7. प्रयोगकर्ता के माध्यम से punctures या thinning प्रक्रिया के दौरान खोपड़ी तोड़, कारण अंतर्निहित कॉर्टेक्स की संभावना क्षति के लिए पशु euthanize।
    नोट: माउस खोपड़ी लगभग 300 माइक्रोन मोटाई में है और दो पतली कॉम्पैक्ट हड्डी की परतों (बाहरी और एक आंतरिक परत) और कॉम्पैक्ट हड्डी की दो परतों के बीच sandwiched स्पंजी हड्डी की एक परत के शामिल है। बाहरी कॉम्पैक्ट हड्डी की परत और चिमड़ा हड्डी के सबसे शेष कॉम्पैक्ट हड्डी की एक अनुमानित 50 माइक्रोन परत में जिसके परिणामस्वरूप 5 मिमी ड्रिलिंग के क्षेत्र के भीतर हटा रहे हैं (चित्रा 2B देखें)। Visualizvasculature की व्यावहारिक अंतिम बरकरार पतला खोपड़ी लगभग 50 माइक्रोन मोटाई में है कि यह सुनिश्चित करेंगे। इस मोटाई के लिए पतला जब खोपड़ी अभी भी इसलिए मौजूद है।

3. माइक्रोस्कोप सेट-अप

  1. एक उद्देश्य पलटनेवाला है कि एक औंधा माइक्रोस्कोप प्रणाली (पारंपरिक, confocal या दो photon सिस्टम) का प्रयोग करें। नोट: यह एक मानक ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए भी संभव है। सीमित कारक मंच और उद्देश्यों के बीच की जगह किया जाएगा। चरण के लिए संशोधन इस स्थापना को पूरा करने के लिए आवश्यक हो सकता है।
  2. एक तरफ खुर्दबीन के आधार स्थित है जो एक कस्टम मेड चरण के लिए शल्य चिकित्सा / इमेजिंग मंच सुरक्षित। नोट: मंच उद्देश्य के तहत सर्जिकल / इमेजिंग मंच के ऊर्ध्वाधर आंदोलन की अनुमति के लिए एक प्रयोगशाला जैक का उपयोग किया जाता है। प्रयोगशाला जैक चार बेलनाकार डंडे से चिपका एक थाली करने के लिए मुहिम शुरू की है। (चित्र 2 देखें)।
  3. एक 20X युक्त उद्देश्य पलटनेवाला स्थित करेंकपाल खिड़की से अधिक उद्देश्य। माइक्रोस्कोप के eyepieces के माध्यम से देख कर कपाल खिड़की पाते हैं और इमेजिंग क्षेत्र में उद्देश्य की स्थिति के लिए एक बाहरी प्रकाश स्रोत का उपयोग करें। नोट: इमेजिंग क्षेत्र vasculature की उपस्थिति से चिह्नित किया जाएगा।
  4. पानी आधारित उद्देश्यों के लिए, कृत्रिम मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी में तरल पदार्थ (ACSF) का उपयोग माध्यम के रूप में होने के कारण संभावित करने के लिए (30 मिमी KCl, 130 मिमी NaCl 200 मिमी 3 NaHCO;; 30 मिमी HEPES और 100 मिमी ग्लूकोज के.एच. 2 पीओ 4 12 मिमी) इमेजिंग के दौरान कपाल गुहा में रिसाव (चित्रा 3)।

4. गुलाब बंगाल डाई तैयार करना, प्रशासन और स्ट्रोक की प्रेरण

  1. कृत्रिम मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी द्रव (ACSF) में गुलाब बंगाल के एक ताजा 20 मिलीग्राम / एमएल समाधान तैयार है; फिल्टर और प्रशासन से पहले बाँझ। पुन: उपयोग या इसे मिश्रित किया गया है एक बार गुलाब बंगाल की दुकान नहीं है। एक प्रयोग के लिए एक नए सिरे से समाधान करें।
  2. गुलाब बंगाल के जबकि एक 0.1 मिलीलीटर पूंछ नस इंजेक्शन देएक 561 एनएम लेजर के साथ कपाल खिड़की डिब्बाबंदी समाधान के पर्याप्त इंजेक्शन सुनिश्चित करने के लिए। नोट: गुलाब बंगाल मस्तिष्क की वाहिका में इंजेक्शन के बाद 5 सेकंड के भीतर देखे जा जाएगा। पूरे पोत गुलाब बंगाल से भरा जाना चाहिए।
  3. गुलाब बंगाल डाई के पर्याप्त इंजेक्शन के बाद एक विशेष घाव मात्रा के reproducibility सुनिश्चित करने के लिए पोत व्यास (40-80 माइक्रोन) के आधार पर घनास्त्रता के लिए एक उपयुक्त पोत का चयन करें। रक्त के प्रवाह की दिशा को देखकर धमनियों और नसों के बीच अंतर: धमनियों छोटे व्यास वाहिकाओं के लिए बड़ा व्यास से कदम होगा, नसों बड़ा व्यास वाहिकाओं के लिए छोटे से चलते हैं। गुलाब बंगाल इंजेक्ट किया जाता है एक बार यह आसानी से दृश्य द्वारा पूरा किया है।
  4. इस प्रकार के रूप खुर्दबीन सेटिंग बदलें:
    1. समय ध्यान केन्द्रित करना बढ़ाएँ। नोट: यह उपयोग किया जा रहा माइक्रोस्कोप सिस्टम के आधार पर अलग अलग होंगे।
    2. 100% करने के लिए लेजर शक्ति बढ़ाएँ।
    3. का उपयोग करते हुए 1 फ्रेम / सेकंड में समय अनुक्रम छवियों को इकट्ठाअधिकतम गति स्कैन।
  5. एक स्थिर थक्का पोत के भीतर का गठन किया है जब तक माउस स्कैन करें। नोट: यह आम तौर पर निरंतर स्कैनिंग के 5 मिनट के भीतर हासिल की है (चित्रा 4 देखें)।
  6. गुलाब बंगाल का उपयोग कर थक्का बनने की प्रेरण के बाद वापस विदारक माइक्रोस्कोप के लिए इमेजिंग क्षेत्र से माउस को हटा दें। ध्यान से कपाल खोपड़ी से स्टेनलेस स्टील की अंगूठी को हटा दें। किसी भी खून बह रहा है के लिए कपाल खिड़की की जाँच करें। खून बह रहा होता है, तो प्रयोग को समाप्त।
  7. खोपड़ी के ऊपर चीरा बंद करने के लिए 6.0 monofilament सीवन का प्रयोग करें। संक्रमण को रोकने के लिए सिवनी रेखा के साथ एंटीबायोटिक मलहम रखें। Buprenex (0.05 मिलीग्राम / किग्रा) दर्द प्रबंधन के लिए तीन दिनों के लिए subcutaneously हर 12 घंटा इंजेक्षन।
  8. पूरी तरह से जाग और स्वतंत्र रूप से घूम रहा है जब तक संवेदनाहारी से हटाने के बाद एक वसूली चैम्बर के लिए माउस लौटें।
  9. बाद में आगे की जांच के लिए एक साफ पिंजरे करने के लिए माउस लौटें।

5। बाद के दिनों पर अनुदैर्ध्य इमेजिंग

  1. बाद के दिनों के बाद photothrombosis पर अनुदैर्ध्य इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए निम्न तरीकों को रोजगार।
    1. विधियों की धारा 1 में वर्णित के रूप में माउस anesthetize।
    2. पर्याप्त संज्ञाहरण पर पहले से drilled इमेजिंग क्षेत्र overlying त्वचा को फिर से खोलने के लिए किसी भी अवशिष्ट टांके को हटाने के द्वारा खोपड़ी को फिर से खोलने के लिए।
    3. कपाल overlying किसी भी शेष प्रावरणी दूर करने के लिए एक बाँझ कपास applicator के लिए उपयोग करें।
    4. पिछले इमेजिंग क्षेत्र overlying हड्डी करने के लिए ऊतक चिपकने के साथ एक कस्टम बनाया स्टेनलेस स्टील की अंगूठी (चित्रा 1) गोंद।
    5. माउस को स्थिर करने और इमेजिंग के दौरान आंदोलन को रोकने के लिए एक stereotaxic धारक (चित्रा 2) के लिए अंगूठी प्रत्यय।
    6. पहले से पतला खोपड़ी अंतर्निहित वाहिका संरचना का पता लगा। पहले से प्रेरित थक्का की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए FITC-dextran की पूंछ नस इंजेक्शन का प्रयोग करें।
    7. में बंद करने के लिए 6.0 monofilament सीवन का प्रयोग करेंखोपड़ी से अधिक cision। संक्रमण को रोकने के लिए सिवनी रेखा के साथ एंटीबायोटिक मलहम रखें। Buprenex (0.05mg / किग्रा) दर्द प्रबंधन के लिए तीन दिनों के लिए subcutaneously हर 12 घंटा इंजेक्षन।
    8. पूरी तरह से जाग और स्वतंत्र रूप से घूम रहा है जब तक संवेदनाहारी से हटाने के बाद एक वसूली चैम्बर के लिए माउस लौटें।

स्ट्रोक प्रेरण 6. सत्यापन (पोस्टमार्टम)

  1. एक अध्ययन के निष्कर्ष में, चित्रा 5 में दिखाया गया के रूप में 2,3,5-triphenyltetrazolium क्लोराइड (टीटीसी) धुंधला का उपयोग स्ट्रोक मात्रा की पुष्टि करें। पूर्ण विधि 12 में पाया जा सकता है।

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Representative Results

इस विधि के उद्देश्य के लिए एक 561 एनएम लेजर प्रकाश के साथ एक पतला खोपड़ी की पूंछ नस और बाद रोशनी के माध्यम से आरबी की एक सांस में इंजेक्शन के बाद पशु मॉडल में एक इस्कीमिक स्ट्रोक (माउस और चूहा) प्रेरित करने के लिए किया गया था। चित्रा 4 में छवियों 0, 1, 1.5 और 2 मिनट पर क्षेत्र के विकिरण के बाद एक एकल पोत के भीतर थक्का बनने की प्रगति को प्रदर्शित करता है। थक्का बनने से पहले पूरे पोत गुलाब बंगाल से बह मुक्त करने के कारण सफेद है। पोत के विकिरण के शामिल होने के बाद वहां पोत के कुछ भागों में एक स्पष्ट काला है और थक्का बनने (तख्ते 1 और 1.5 मिनट) के शामिल होने का संकेत है। पूरा रोड़ा के बाद पोत के भीतर थक्का (काला) क्षेत्र पूर्ववर्ती गुलाब बंगाल डाई (सफेद क्षेत्र) के एक चिह्नित संचय नहीं है। 2 मिनट फ्रेम धमनी की पूरी रोड़ा दर्शाता है।

एक इस्कीमिक स्ट्रोक टीटीसी धुंधला की उपस्थिति उपयोग किया जा सकता सत्यापित करने के लिए। टीटीसी एक सह हैmmonly स्वस्थ ऊतकों में लाल formazan टीटीसी उत्पादों के गठन के द्वारा मस्तिष्क रोधगलन का पता लगाने के लिए दाग का इस्तेमाल किया। formazan उत्पादन (सफेद ऊतक) की कमी रोधगलितांश क्षेत्र इंगित करता है। चित्रा 5 में बक्से के द्वारा संकेत क्षेत्रों में एक पोत व्यास में लगभग 80mm के भीतर उत्पादन एक थक्का निम्नलिखित दो अलग-अलग जानवरों से 1 और 5 दिन प्राप्त ठेठ घाव आकार प्रदर्शित करता है। छवि विश्लेषण एक फ्लैट बिस्तर स्कैनर और ImageJ सॉफ्टवेयर के उपयोग पर किया जाता है। हित के क्षेत्रों प्रत्येक मस्तिष्क के लिए स्ट्रोक की मात्रा के क्षेत्र को मापने के लिए ImageJ के भीतर तैयार किया जा सकता है।

चित्र 1
चित्रा 1:। स्टेनलेस स्टील की अंगूठी तीन दृश्य (ऊपर की ओर और नीचे विचारों) stereotaxic धारक के लिए यह प्रत्यय करने के लिए माउस की खोपड़ी के लिए लागू किया जाता है कि स्टेनलेस स्टील की अंगूठी धारक के दिखाए जाते हैं।


चित्रा 2:। आरबी photothrombosis के लिए माइक्रोस्कोप इमेजिंग मंच सेटअप सर्जिकल / इमेजिंग मंच nosecone साथ संज्ञाहरण ट्यूब और के दौरान जानवरों की आवाजाही कम करने के लिए जानवर की खोपड़ी के लिए चिपका है कि स्टेनलेस स्टील की अंगूठी के लिए एक stereotaxic धारक के लिए एक धारक होता है इमेजिंग। मंच के शीर्ष पर रखा गया है और माइक्रोस्कोप के उद्देश्य के तहत माउस स्थिति के लिए ऊर्ध्वाधर आंदोलन की अनुमति के लिए प्रयोगशाला जैक करने के लिए सुरक्षित है। प्रयोगशाला जैक तो क्षैतिज आंदोलन के लिए अनुमति देता है एक खुर्दबीन मंच, से जुड़ा हुआ है। खुर्दबीन मंच के शीर्ष पर रखा गया है और चार बेलनाकार डंडे के लिए सुरक्षित है।

चित्र तीन
चित्रा 3: उद्देश्य निवेश संबंधी निर्णय के तहत इमेजिंग / शल्य चिकित्सा मंच के डिजाइन और उन्मुखीकरण के चित्रerter। (ए) बाईं तरफ के पैनल एक anesthetized माउस (संज्ञाहरण नाक शंकु तस्वीर लेने के लिए संक्षेप में हटा दिया गया था) की स्थिति के एक प्रतिनिधि छवि को दर्शाता है। इमेजिंग प्रक्रियाओं के दौरान कलाकृतियों साँस लेने के योगदान को कम करने के लिए माउस खोपड़ी संलग्न करने के लिए एक कस्टम स्टील की अंगूठी के उपयोग पर ध्यान दें। सही पर छवि एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत कॉर्टिकल खिड़की की एक छवि को दर्शाता है। ड्यूरा मेटर और पूरी खोपड़ी मोटाई के संबंध में पतला क्षेत्र की मोटाई के संबंध में खोपड़ी की परतों का प्रदर्शन एक राज्याभिषेक दृश्य से पतली खोपड़ी तैयारी की (बी) के स्केच।

चित्रा 4
चित्रा 4: गुलाब बंगाल थक्का बनने का चित्र पूंछ VEI इंजेक्शन के माध्यम से किया गया था कि गुलाब बंगाल डाई युक्त एक भी जहाज के प्रतिनिधि छवियाँ।माउस के एन। छवियों 0, 1, 1.5 और 2 मिनट पर क्षेत्र के विकिरण निम्नलिखित पोत के भीतर थक्का बनने की प्रगति को प्रदर्शित करता है। धमनी की पूरी रोड़ा प्रदर्शन 2 मिनट के फ्रेम में थक्का (काला) पूर्ववर्ती गुलाब बंगाल डाई (सफेद) का संचय ध्यान दें।

चित्रा 5
चित्रा 5: आरबी प्रेरित घाव के 2,3,5-triphenyltetrazolium क्लोराइड (टीटीसी) छवि प्रतिनिधि छवियाँ दिन 1 और 5 के बाद photothrombosis प्रेरण पर दिखाए जाते हैं।। चूहों का बलिदान और दिमाग तेजी से मानक तरीकों के अनुसार हटा दिया है और 1mm राज्याभिषेक वर्गों में कटा हुआ और टीटीसी के साथ दाग रहे थे। टीटीसी स्वस्थ ऊतकों में लाल formazan टीटीसी उत्पादों के गठन के द्वारा मस्तिष्क रोधगलन का पता लगाने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया दाग है। formazan उत्पादन (सफेद ऊतक) की कमी रोधगलितांश क्षेत्र इंगित करता है।बक्से ने संकेत दिया क्षेत्रों व्यास में लगभग 80 माइक्रोन एक पोत के भीतर उत्पादन एक थक्का निम्नलिखित प्राप्त ठेठ घाव आकार प्रदर्शित करता है।

चित्रा 6
चित्रा 6: गुलाब बंगाल photothrombotic प्रक्रिया की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व।

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Discussion

मानव आवेदन करने के लिए पशु से प्रयोगात्मक स्ट्रोक pathophysiology अनुवाद करने की क्षमता की विफलता के साथ ग्रस्त हो गया है। हालांकि, इस तरह photothrombosis मॉडल के रूप में पशु मॉडल, के उपयोग में सुधार स्ट्रोक pathophysiology की समझ और एक स्ट्रोक निम्नलिखित neuroprotection प्रदान करने के लिए नए चिकित्सकीय दृष्टिकोण के अन्वेषण के लिए अनुमति देता है। लघु कॉर्टिकल स्ट्रोक और photothrombotic मॉडल द्वारा उत्पादित microinfarctions एक उच्च व्याप्ति है और संयुक्त राज्य अमेरिका की आबादी (लगभग 11 लाख लोग) प्रत्येक वर्ष 16 के लगभग 4 प्रतिशत को प्रभावित करता है, जो लक्षणहीन या "चुप" स्ट्रोक 13-15, चिकित्सकीय प्रासंगिक हैं। साइलेंट स्ट्रोक मध्य मस्तिष्क धमनी (एमसीए) रोड़ा या क्षणिक ischemic हमले (TIA) 17 में देखा जैसे लकवा, संवेदी नुकसान और कठिनाई के रूप में एक बड़ा स्ट्रोक में मौजूद क्लासिक स्ट्रोक के लक्षण, ऐसे बोल रहा हूँ नहीं है। इसके अलावा, मूक स्ट्रोक lacunar स्ट्रोक, जिसमें से अलग हैगहरी मस्तिष्क संरचना में या ब्रेन स्टेम के भीतर एक भी मर्मज्ञ धमनी का रोड़ा की वजह से और भी चिकित्सकीय मोटर, संवेदी या मिश्रित घाटा 18 के साथ प्रकट होता है। लक्षणहीन या "चुप" स्ट्रोक के साथ मरीजों को आमतौर पर किसी भी जावक लक्षण प्रदर्शित करने और वे भी एक स्ट्रोक सामना करना पड़ा है अक्सर अनजान हैं नहीं है। स्मृति में घाटे, निर्णय लेने, और व्यवहार में परिवर्तन द्वारा प्रदर्शित संज्ञानात्मक समारोह में एक लक्षणहीन कमी में साइलेंट स्ट्रोक का परिणाम है। समय के साथ, कई मूक स्ट्रोक नाड़ी या बहु रोधगलितांश पागलपन के रूप में जाना जाता है स्मृति हानि की चिकित्सकीय महत्वपूर्ण लक्षण पैदा होती हैं। हालांकि, मूक स्ट्रोक मस्तिष्क क्षति न्यूरोइमेजिंग का उपयोग कर पता लगाया है, और भविष्य में 19 TIA के लिए जोखिम और प्रमुख झटके में एक मरीज ​​स्थानों पर किया जा सकता है।

photothrombosis मॉडल कोम्बी में सहज डाई गुलाब बंगाल (आरबी) का उपयोग कर एक अक्षुण्ण, anesthetized माउस में घनास्त्रता के vivo मॉडल में एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने के उत्पादन के लिए अनुमति देता हैconfocal माइक्रोस्कोपी के साथ राष्ट्र। इन विवो photothrombosis मॉडल के कई फायदे हैं। इस विधि का एक फायदा stereotaxic निर्देशांक का उपयोग कर स्ट्रोक के स्थान पूर्वपरिभाषित करने की क्षमता है; एक जानवरों भर में विशेष सेल आबादी का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, घाव आकार और मात्रा के reproducibility अच्छी तरह से लेजर प्रकाश की तीव्रता बदलती है और 20 विकिरणित किया जा रहा पोत आकार के लिए नियंत्रित करने के द्वारा इस पद्धति का उपयोग नियंत्रित किया जाता है। इस पद्धति का भी विस्तृत पेरी-रोधगलितांश neurotransmission में परिवर्तन का अध्ययन और contralateral कॉर्टेक्स 4 इसी के लिए अनुमति देता है। एक भी चुप स्ट्रोक न्यूनतम घाटे का कारण बनता है हालांकि, इस मॉडल के reproducibility ऐसे संवहनी मनोभ्रंश के रूप में विभिन्न मस्तिष्क रोग नकल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो विशिष्ट क्षेत्रों में कई मूक स्ट्रोक प्रेरित करने की क्षमता के लिए अनुमति देता है। कई मूक स्ट्रोक और चिकित्सकीय स्पष्ट घाटे के बीच एक सीमा के विकास तकनीक और नवीनता में निर्धारित किया जा सकता हैFIC इस विधि के प्रयोग के माध्यम से मस्तिष्क के क्षेत्रों के रूप में अच्छी तरह से। अंत में, मॉडल तीव्र और जीर्ण दोनों प्रभाव देखा जा करने के लिए अनुमति देने के लिए एक ही पशुओं में अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए अनुमति देता है।

Photothrombosis मॉडल का उपयोग करने में कुछ नुकसान है, तथापि, वहाँ रहे हैं। एक नुकसान यह फोकल स्ट्रोक 4 के अन्य मॉडलों की तुलना में जब एक छोटे से इस्कीमिक Penumbra होने के रूप में उल्लेख किया है कि एक घाव का उत्पादन भी शामिल है। दूसरे, vasogenic और साइटोटोक्सिक शोफ गठन के कारण और अधिक बारीकी से फोकल स्ट्रोक 4 से घाव मस्तिष्क की चोट के जैसा होता है जो photothrombosis की प्रेरण, के दौरान हो सकता है कि क्षति के लिए संभव है।

Photothrombosis मॉडल का उपयोग करते समय प्रयोग के दौरान निगरानी की जानी चाहिए कि कारकों में से एक नंबर रहे हैं। यह पशु की शारीरिक स्थिति सभी इमेजिंग प्रक्रियाओं के दौरान नजर रखी जा है कि महत्वपूर्ण है। यह अच्छी तरह से संज्ञाहरण स्तर शारीरिक सेंट प्रभावित कर सकते हैं कि जाना जाता हैanesthetizing से अधिक के कारण के साथ पशु, के atus जानवर को हृदय गति और ऑक्सीजन प्रसव की कमी हुई। इस वैश्विक ischemia में जिसके परिणामस्वरूप मस्तिष्क को ऑक्सीजन की उपलब्धता कम होगा, क्योंकि यह एक महत्वपूर्ण विचार है। इसलिए, एक प्रणाली के उपयोग के साथ-साथ गैर इनवेसिव रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देगा पशु की शारीरिक स्थिति की निगरानी करने के लिए: धमनी ऑक्सीजन संतृप्ति (एसपीओ 2); हृदय गति; सांस दर; पल्स फैलावट (स्थानीय रक्त प्रवाह और संकेत गुणवत्ता का सूचक); सांस फैलावट (intraplueral दबाव के लिए सरोगेट); चूहों और चूहों में और कोर तापमान। नैदानिक ​​स्टोक में लाभ के लिए प्रयोगात्मक परिणामों का अनुवाद करने में अप्रत्याशित घालमेल कर दिया है कम करने के लिए किसी भी जानवर के मॉडल के साथ काम कर रहे हैं जब यह संज्ञाहरण के लिए नियंत्रित करने के लिए तेजी से महत्वपूर्ण होता जा रहा है घालमेल कर दिया। विकल्प, अवधि और संज्ञाहरण की गहराई प्रयोगात्मक स्ट्रोक के पशु मॉडल में भारी प्रभाव पड़ सकता है। अध्ययनों से पता चलता संवेदनाहारी एजेंटों रोधगलितांश एसआई कम कर सकते हैं दिखा दिया है किज़ी और यहां तक कि मस्तिष्क ischemia 21-23,24 से कुछ सुरक्षा प्रदान कर सकता है। इसके अतिरिक्त, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन में परिवर्तन भी halothane और Propofol 25 के उपयोग की तुलना में एक अध्ययन में प्रदर्शन किया गया है। स्ट्रोक के साथ जुड़े neuronal मौत में प्राथमिक परिकल्पना की एक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों का उत्पादन होता है के रूप में यह उलझाना जरूरी है।

एक स्ट्रोक के लिए मस्तिष्क की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए विवो माइक्रोस्कोपी में उपयोग में से एक जटिलता प्राप्त इमेजिंग गहराई की सीमा है। एक दो photon माइक्रोस्कोप का उपयोग माइक्रोन 400-500 के बीच करने के लिए इस गहराई में वृद्धि कर सकते हैं, जबकि confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग हमारी प्रयोगशाला में प्राप्त किया जा सकता है कि इमेजिंग गहराई, 100-200 माइक्रोन की रेंज में है। ये घालमेल कर दिया है वृद्धि हुई है काम दूरी के साथ और आकार को कम करने के उद्देश्यों के विकास के द्वारा क्रमशः समाप्त किया जा रहा है। उदाहरण के लिए, ढाल अपवर्तनांक (खीस) microlenses microendoscopes बुद्धि रहे हैं35-1,000 माइक्रोन के बीच एच व्यास और तिथि करने के लिए उपलब्ध सबसे छोटी हैं। जांच के इस प्रकार के आक्रामक नुकसान हो सकता है और कम संख्यात्मक apertures के पास बिना ऊतक में सम्मिलित नहीं किया जा सकता है। कम होने के कारण एनए करने के लिए संकल्प पारंपरिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी उद्देश्यों को 26 की तुलना में नीचा है।

सारांश में, गुलाब बंगाल photothrombosis मॉडल छोटे आकार का एक रोधगलितांश लाती है और एक अच्छी तरह से परिभाषित सेलुलर जनसंख्या में तीव्र और जीर्ण चरणों दोनों में एक रोधगलितांश के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया का अध्ययन करने में उपयोगी है। इस मॉडल को फोकल ischemia के निम्नलिखित MCAO के साथ देखा आवश्यक सेलुलर विशेषताओं को दर्शाता है और इसलिए neuroregenerative / न्यूरोप्रोटेक्टिव उपचारों का आकलन करने में उपयोगी है।

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Rose Bengal Sigma 330000
Isoflurane Anesthetic MWI Veterinary Supply 088-076
Vetbond 1469SB 1469SB
aCSF  126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucose and 26 mM NaHCO3 (pH 7.4).
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Dissecting Scissors Bioindustrial Products 500-410
Operating scissors 14 cm Bioindustrial Products 12-055
Forceps Dumont High Tech #5 style, straight Bioindustrial Products TWZ-301.22
LabJack 132X80 Optosigma Co 123-6670
Platform for Labjack 8X 8 Optosigma Co 145-1110
Ear bar holder from stereotaxic setup Stoelting/Cyborg 51654
Dispomed Labvent Rodent anesthesia machine DRE, Inc. 15001
Tech IV Isoflurane vaporizer DRE, Inc. 34001
F Air Canister DRE, Inc 80120
Bain circuit breathing tube DRE, Inc 86111B
Rodent adapter for bain tube DRE, Inc 891000
O2 regulator for oxygen tanks DRE, Inc CE001E
Rodent induction chamber DRE, Inc 15004C
Ethicon Silk 6-0; 18 in with P-3 needle Suture Express 1639G
Objective inverter Optical Adapter LSM technologies
Foredom drill Dual voltage 110/120 Foredom 134.53
Meisinger 3.9 mm drill bit Meisinger (Ref#310 104 001 001 009)

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References

  1. Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17, 497-504 (1985).
  2. Rosenblum, W. I., El-Sabban, F. Platelet aggregation in the cerebral microcirculation: effect of aspirin and other agents. Circulation Research. 40, 320-328 (1977).
  3. Owens, A. P. 3rd, Mackman, N. Sources of tissue factor that contribute to thrombosis after rupture of an atherosclerotic plaque. Thrombosis Research. 129, Suppl 2. S30-S33 (2012).
  4. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2, 396-409 (2005).
  5. Manual of stroke models in rats. , 332 CRC Press. (2009).
  6. Herz, R. C., Kasbergen, C. M., Hillen, B., Versteeg, D. H., de Wildt, D. J. Rat middle cerebral artery occlusion by an intraluminal thread compromises collateral blood flow. Brain Research. 791, 223-228 (1998).
  7. Brint, S., Jacewicz, M., Kiessling, M., Tanabe, J., Pulsinelli, W. Focal brain ischemia in the rat: methods for reproducible neocortical infarction using tandem occlusion of the distal middle cerebral and ipsilateral common carotid arteries. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism : Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 8, 474-485 (1988).
  8. Zheng, W., et al. Purinergic receptor stimulation reduces cytotoxic edema and brain infarcts in mouse induced by photothrombosis by energizing glial mitochondria. PloS One. 5, e14401 (2010).
  9. Zheng, D. M., Wewer, J., Lechleiter, J. P. 2Y. 1R. -initiated IP3R-dependent stimulation of astrocyte mitochondrial metabolism reduces and partially reverses ischemic neuronal damage in mouse. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 600-611 (2013).
  10. Witte, O. W., Stoll, G. Delayed and remote effects of focal cortical infarctions: secondary damage and reactive plasticity. Advances in Neurology. 73, 207-227 (1997).
  11. Hagemann, G., Redecker, C., Neumann-Haefelin, T., Freund, H. J., Witte, O. W. Increased long-term potentiation in the surround of experimentally induced focal cortical infarction. Annals of Neurology. 44, 255-258 (1998).
  12. Kramer, M., et al. TTC staining of damaged brain areas after MCA occlusion in the rat does not constrict quantitative gene and protein analyses. Journal of Neuroscience Methods. 187, 84-89 (2010).
  13. Blinder, P., Shih, A. Y., Rafie, C., Kleinfeld, D. Topological basis for the robust distribution of blood to rodent neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 12670-12675 (2010).
  14. Nishimura, N., Rosidi, N. L., Iadecola, C., Schaffer, C. B. Limitations of collateral flow after occlusion of a single cortical penetrating arteriole. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 30, 1914-1927 (2010).
  15. Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 365 (2007).
  16. Blum, S., et al. Memory after silent stroke: Hippocampus and infarcts both matter. Neurology. 78, 38-46 (2012).
  17. Heinsius, T., Bogousslavsky, J., Van Melle, G. Large infarcts in the middle cerebral artery territory Etiology and outcome patterns. Neurology. 50, 341-350 (1998).
  18. Wardlaw, J. What causes lacunar stroke. Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry. 76, 617-619 (2005).
  19. Inoue, Y., et al. Ischemic stroke under anticoagulant therapy]. Rinsho shinkeigaku. Clinical Neurology. 50, 455-460 (2010).
  20. Tiannan Wang, W. C., Xie, Y., Zhang, W., Ding, S. Controlling the Volume of the Focal Cerebral Ischemic Lesion through Photothrombosis. American Journal of Biomedical Sciences. 2, 33-42 (2009).
  21. Head, B. P., Patel, P. Anesthetics and brain protection. Current Opinion in Anaesthesiology. 20, 395-399 (2007).
  22. Kirsch, J. R., Traystman, R. J., Hurn, P. D. Anesthetics and cerebroprotection: experimental aspects. International Anesthesiology Clinics. 34, 73-93 (1996).
  23. Koerner, I. P., Brambrink, A. M. Brain protection by anesthetic agents. Current Opinion in Anaesthesiology. 19, 481-486 (2006).
  24. Gelb, A. W., Bayona, N. A., Wilson, J. X., Cechetto, D. F. Propofol anesthesia compared to awake reduces infarct size in rats. Anesthesiology. 96, 1183-1190 (2002).
  25. Bhardwaj, A., Castro, I. A., Alkayed, N. J., Hurn, P. D., Kirsch, J. R. Anesthetic choice of halothane versus propofol: impact on experimental perioperative stroke. Stroke; A Journal Of Cerebral Circulation. 32, 1920-1925 (2001).
  26. Barretto, R. P., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses. Nature Methods. 6, 511-512 (2009).

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चिकित्सा अंक 100 गुलाब बंगाल एकल पोत स्ट्रोक, lacunar स्ट्रोक photothrombosis मूक स्ट्रोक
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