روز البنغال Photothrombosis بواسطة التصوير الضوئي متحد البؤر Published: June 23, 2015 doi: 10.3791/52794

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Lora Talley Watts¹, Wei Zheng¹, R. Justin Garling², Victoria C. Frohlich³, James Donald Lechleiter¹

¹Department of Cellular and Structural Biology, The University of Texas Health Science Center San Antonio, ²School of Medicine, The University of Texas Health Science Center San Antonio, ³Cell & Tissue Imaging Center, St. Jude Children’s Research Hospital

Introduction

تقنية الموضحة تصاريح التصور في الجسم الحي الاستجابات الخلوية التالية تحريض روز البنغال على الفور photothrombosis في الماوس سليمة. روز البنغال (4،5،6،7-tetrachloro-2، 4، 5، 7'-tetraiodofluorescein) هو صبغ حساس يستخدم للحث على السكتة الدماغية في النماذج الحيوانية (الماوس والفئران). بعد حقن البلعة من RB عن طريق الوريد الذيل وإضاءة لاحقة من خلال الجمجمة ضعيفة مع ضوء الليزر 564 نانومتر، الجلطة هو فعل يسبب السكتة الدماغية الفسيولوجية ^1. طريقة وصفت في الأصل من قبل روزنبلوم وايل الصبان في عام 1977، وتكييفها في وقت لاحق من قبل واتسون في منتصف 1980s ^1،2. وباختصار، فإن المشع روز البنغال مع الضوء الأخضر الإثارة (ليزر 561 نانومتر في حالتنا)، الذي يولد إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية، والذي ينشط في وقت لاحق العامل النسيجي، وهو البادئ شلال التخثر. تحريض شلال التخثر ينتج الدماغية ليهأيون التي هي ذات الصلة مرضي السكتة الدماغية السريرية ^3.

السكتة الدماغية لديها الفيزيولوجيا المرضية المعقدة ويرجع ذلك إلى تفاعل العديد من خلايا مختلفة الأنواع بما في ذلك الخلايا العصبية، الدبقية، البطانة والجهاز المناعي. اختيار أفضل أسلوب لدراسة تتطلب عملية الخلوية معينة اعتبارات متعددة. تقنيات تجريبية تقع على نطاق واسع في واحدة من ثلاث فئات: في المختبر، في الجسم الحي وسيليكون ولكل منها مزايا وعيوب في الدراسات المختبرية لديها عيب أساسي لإزالة الخلايا من بيئتها الطبيعية، وبالتالي قد لا تتكاثر آثار ينظر في حالها. الحيوانات الحية. في الجسم الحي تقنيات توفير لتعزيز النسخ التجريبية من الحالات المرضية مع زيادة أهمية متعدية. وفي سيليكون وتشير بصفة عامة إلى النمذجة الحاسوبية من مرض أو عملية الخلوية، وحين تستخدم بشكل متزايد لدراسة التفاعلات المخدرات المحتملة للامتحانسبيل، ما زال يتعين اختبار أي معلومات استقاها في الخلايا أو الأنسجة الحية.

يجب أن النموذج المثالي من السكتة الدماغية في إعداد مختبر تظهر ملامح مرضية مشابهة لتلك التي ظهرت في عدد السكان. في حين أن هناك خصائص مشتركة الفسيولوجية من السكتة الدماغية في البشر، وهناك أيضا العديد من الاختلافات تبعا لنوع الإصابة من ذوي الخبرة. السكتة الدماغية في البشر كما يحدث انسداد صغيرة أو كبيرة سفينة، والآفات نزفية، والشريان إلى الشريان أو الانسدادات القلب والتي تؤدي إلى احتشاء أحجام متنوعة فضلا عن الاختلافات في الآليات المتعلقة بكل علم الأمراض. الاستفادة من استخدام نماذج السكتة الدماغية الحيوان هو الجيل من عوائق استنساخه التي تحاكي خصائص السكتة الدماغية الإنسان. وتشمل النماذج الأكثر شيوعا السكتة الدماغية الحيوان انسداد الشريان باستخدام: وسط انسداد الشريان الدماغي (أساليب خيوط صمية أو اللف) التي نماذج القاصي MCAO ونموذج photothrombosis. مزايا لوقد استعرض د عيوب كل نموذج في مكان آخر (انظر ⁴ و ^5). نماذج عالمية الدماغية (MCAO)، في حين أن من السهل نسبيا لأداء هي أقل أهمية من السكتة الدماغية البشرية من هي نماذج السكتة الدماغية التنسيق. وبالإضافة إلى ذلك، وهذه الأساليب تختلف اختلافا كبيرا في إحداث تقرحات احتشاء الدماغ استنساخه. نموذج photothrombosis هو تكرار للغاية طالما يتحكم المجرب التجارب بشكل جيد، وتوفير ميزة واضحة على نماذج MCAO. ومع ذلك، ويرجع ذلك إلى الأوعية الدموية الدقيقة إهانة وقد وصفت نموذج لعرض غبش الدماغية الحد الأدنى، المنطقة التي يعتقد أن الخلايا لتكون انقاذها ^6،7. بالإضافة إلى ذلك، وذمة وعائية المنشأ وتشكيل السامة للخلايا وذمة ويمكن أيضا أن يتسبب الإشعاع التالي من منطقة التصوير. على الرغم من هذه القيود وفرت تقنية نظرة جديدة في العديد من العمليات الفسيولوجية التالية السكتة الدماغية ^{8، 9، 10، 11.}

Protocol

ملاحظة: تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من جامعة تكساس مركز العلوم الصحية في سان انطونيو، وكانت متسقة مع المبادئ التوجيهية صلوا اليها.

1. التخدير لإعداد القشرية

1. ضع الماوس في غرفة الاستقراء مع 2-3٪ isofluorane مختلطة مع الأكسجين للحث على التخدير. نلاحظ انخفاض معدل التنفس كما هو الناجم عن الماوس. قرصة مخلب من الماوس لتحديد ما إذا كان الفأر هو على استعداد للانتقال إلى مخروط الأنف. ملاحظة: مستوى التخدير هو خطوة حاسمة في أي تحضير في الجسم الحي، وينبغي الحرص على عدم للحث على المستوى الذي سوف يسبب نقص التروية العالمي.
2. مرة واحدة يتم تخدير الماوس بما فيه الكفاية، ونقل الحيوان إلى الجراحة / منصة التصوير ووضع الأنف الماوس، في مخروط الأنف وتطبيق 1-1،2٪ isofluorane للحفاظ على حالة تخدير. تأكد من أن الفأر هو ملقى على درجة حرارة المشتركntrolled سادة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم (37 درجة مئوية +/- 0.5 ° C) في جميع أنحاء الإجراءات المتبقية. وضع مرهم التعليم والتدريب المهني في العيون لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
3. مراقبة علم وظائف الأعضاء من الفأرة باستخدام نظام قياس التأكسج نبض باستخدام الذيل أو القدم كليب المتوفرة مع النظام. تأكد من أن معدل التنفس ويحتفظ بين 50-65 الأنفاس / دقيقة. تأكد من أن معدل ضربات القلب لا يزال بين 300-450 نبضة في الدقيقة وتشبع الأكسجين يحتفظ بين 97-98٪ لضمان البقاء على المدى الطويل للحيوان.
4. عندما يتم تخدير الماوس بشكل كاف، حلق شعر على الجمجمة باستخدام كليبرز الكهربائية، إزالة الشعر المتبقي ونظيفة مع betadine، تليها مسحة الإيثانول. كرر هذا الإجراء حتى ثلاث مرات لضمان بيئة الجراحية المعقمة.

2. إجراء العمليات الجراحية

1. مع فروة الرأس وتنظيفها بالكامل وحليق، وجعل 5 ملم شق في فروة الرأس من الفأرة للكشف عن fissu الجمجمةالدقة وتحديد bregma.
2. استخدام قضيب من القطن المعقم لإزالة أي رباط المتبقية المغطي الجمجمة.
3. الغراء حلقة العرف الفولاذ المقاوم للصدأ (الشكل 1) مع لاصق الأنسجة حتى العظم المغطي القشرة الجدارية باستخدام إحداثيات التجسيمي من Bregma: -1 الى -3 ملم والوحشي: 2-4 ملم. ملاحظة: الغراء يحدد عادة في غضون 2 دقيقة بعد وضع الحلقة على العظام.
4. يضعوا عصابة لحامل التجسيمي (الشكل 2) لتحقيق الاستقرار في الماوس ولمنع الحركة أثناء التصوير.
5. تحت المجهر الجراحي الصف تشريح، حفر ببطء قسم 1-2 ملم في الجمجمة باستخدام سرعة تسيطر عليها مثل DREMEL أداة (Meisinger 3.9 مم مثقاب) والتأكد من الحفاظ على مستوى المنطقة كما هو حفر عليه. تحقيق ذلك باستخدام نمط التعرج. لتجنب حرارة بناء، ضبط سرعة الحفر إلى الأقل وأخذ فترات راحة متكررة.
6. عندما تصبح الجمجمة الجمجمة تسلق في المظهر، ومواصلة رقيقمن الجمجمة باستخدام شفرة مشرط باستخدام نفس نمط التعرج للحفاظ على مستوى سطح ضعفت لتسهيل إزالة السلس للطبقات رقيقة من الجمجمة الجمجمة. استخدام غيض من شفرة مشرط جعل السكتات الدماغية خطية صغيرة مع الضغط الخفيف لإزالة طبقات رقيقة من العظام في وقت واحد. مواصلة هذا العمل حتى بشكل واضح الأوعية الدموية وضوحا من خلال المجهر تشريح.
7. إذا يثقب المجرب من خلال أو كسر في الجمجمة أثناء عملية رقيق، الموت ببطء الحيوان بسبب الضرر المحتمل أن القشرة الكامنة.
   ملاحظة: الجمجمة الماوس ما يقرب من 300 ميكرون في سمك ويتكون من اثنين من طبقات رقيقة من العظم المضغوط (الطبقة الداخلية واحد خارجي واحد)، وطبقة من العظم الإسفنجي تقع بين طبقتين من العظم المضغوط. الطبقة الخارجية من العظم المضغوط ويتم إزالة معظم العظم الإسفنجي داخل منطقة حفر 5 مم أدى إلى التقريبية طبقة 50 ميكرون من العظم المضغوط المتبقية (انظر الشكل 2B). Visualizسوف أوجه من الأوعية الدموية ضمان النهائية الجمجمة ضعيفة سليمة ما يقرب من 50 ميكرون في سمك. لذا الجمجمة لا تزال موجودة عندما ضعفت هذه سمك.

3. المجهر مجموعة المتابعة

1. استخدام نظام مجهر مقلوب (التقليدية، متحد البؤر أو النظامين الفوتون) الذي يحتوي على العاكس موضوعي. ملاحظة: من الممكن أيضا للاستفادة من المجهر تستقيم القياسية. فإن العامل المحدد أن تكون المساحة بين مرحلة والأهداف. تعديلات على مرحلة قد تكون ضرورية لتحقيق هذا الإعداد.
2. تأمين منصة الجراحية / التصوير إلى مرحلة العرف الذي يقع جانبا قاعدة المجهر. ملاحظة: يرصد منصة باستخدام جاك مختبر للسماح الحركة الرأسية من منصة العمليات الجراحية / التصوير تحت الهدف. هي التي شنت جاك مختبر لوحة الملصقة على أربعة أعمدة اسطوانية. (انظر الشكل 2).
3. وضع العاكس موضوعي يحتوي على 20Xالهدف خلال نافذة الجمجمة. استخدام مصدر ضوء خارجي للعثور على نافذة الجمجمة من خلال النظر من خلال العدسات المجهر ووضع الهدف في مجال التصوير. ملاحظة: سيتم يرمز منطقة التصوير من خلال وجود الأوعية الدموية.
4. لتحقيق أهداف المياه القائمة، استخدم السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي (ACSF) (130 ملي كلوريد الصوديوم، و 30 ملي بوكل، 12 ملي KH ₂ PO _4، 200 ملي NaHCO ₃ و 30 ملي HEPES، و 100 ملي الجلوكوز) باعتبارها وسيلة نظرا لاحتمالات تسرب داخل تجويف الجمجمة أثناء التصوير (الشكل 3).

4. روز البنغال صبغ إعداد وإدارة وتحريض السكتة الدماغية

1. إعداد 20 ملغ حل / مل جديدة من روز البنغال في السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي (ACSF)؛ تصفية وتعقيم قبل الإدارة. لا إعادة استخدام أو تخزين البنغال روز مرة واحدة وقد تم مزجه. جعل حل جديد لكل تجربة.
2. إعطاء حقن الوريد 0.1 مل ذيل روز البنغال بينما الصورةتعليب النافذة الجمجمة مع ليزر 561 نانومتر لضمان حقن كاف من الحل. ملاحظة: سيتم تصور روز البنغال في 5 ثانية بعد الحقن في الأوعية الدموية في الدماغ. ينبغي أن تملأ وعاء كامل مع روز البنغال.
3. بعد الحقن كافية من روز البنغال صبغ اختيار سفينة مناسبة للتخثر على أساس قطر الأوعية الدموية (40-80 ميكرون) لضمان استنساخ حجم الآفة بشكل خاص. التفريق بين الشرايين والأوردة من خلال النظر في اتجاه تدفق الدم: والشرايين تنتقل من قطر أكبر للسفن القطر الأصغر، وعروق تتحرك من أصغر لسفن القطر الأكبر. ويتم إنجاز هذا بسهولة عن طريق التصور مرة واحدة يتم حقن روز البنغال.
4. تغيير الإعداد المجهر على النحو التالي:
   1. زيادة مدة بقاء. ملاحظة: هذا وسوف تختلف وفقا لنظام المجهر يجري استخدامها.
   2. زيادة قوة الليزر إلى 100٪.
   3. جمع الصور التسلسل الزمني في 1 إطار / ثانية باستخدامأقصى سرعة المسح الضوئي.
5. مسح الماوس حتى يتم تشكيل جلطة مستقرة داخل السفينة. ملاحظة: هذا يتحقق عادة في غضون 5 دقائق من المسح المستمر (انظر الشكل 4).
6. بعد تحريض تشكيل الجلطة باستخدام روز البنغال، وإزالة الماوس من منطقة التصوير إلى مجهر تشريح. إزالة بعناية حلقة من الصلب غير القابل للصدأ من الجمجمة الجمجمة. دراسة نافذة في الجمجمة عن أي نزيف. في حالة حدوث نزيف، إنهاء التجربة.
7. استخدام 6.0 حيدة خياطة لإغلاق الجرح على الجمجمة. وضع مرهم مضاد حيوي على طول خط خياطة لمنع العدوى. حقن Buprenex (0.05 ملغ / كلغ) تحت الجلد كل 12 ساعة لمدة ثلاثة أيام لإدارة الألم.
8. عودة الماوس إلى غرفة الإنعاش بعد إزالة من مخدر حتى مستيقظا تماما والتحرك بحرية.
9. عودة الماوس إلى قفص نظيفة لمزيد من التحقيق في وقت لاحق.

5. التصوير الطولي على اللاحقة أيام

1. توظيف الأساليب التالية لإجراء التصوير الطولي في أيام لاحقة آخر photothrombosis.
   1. تخدير الماوس كما هو موضح في المادة 1 من الطرق.
   2. على الكافية التخدير إعادة فتح فروة الرأس عن طريق إزالة أي الغرز المتبقية لإعادة فتح الجلد المغطي مجال التصوير المحفورة سابقا.
   3. استخدام قضيب من القطن المعقم لإزالة أي رباط المتبقية المغطي الجمجمة.
   4. الغراء حلقة العرف الفولاذ المقاوم للصدأ (الشكل 1) مع لاصق الأنسجة حتى العظم المغطي مجال التصوير السابق.
   5. يضعوا عصابة لحامل التجسيمي (الشكل 2) لتحقيق الاستقرار في الماوس ولمنع الحركة أثناء التصوير.
   6. تحديد الأوعية الدموية الكامنة وراء الجمجمة ضعيفة سابقا. استخدام الوريد الذيل حقن FITC-ديكستران للتحقق من وجود تجلط يسببها سابقا.
   7. استخدام 6.0 حيدة خياطة لإغلاق فيCISION على الجمجمة. وضع مرهم مضاد حيوي على طول خط خياطة لمنع العدوى. حقن Buprenex (0.05mg / كلغ) تحت الجلد كل 12 ساعة لمدة ثلاثة أيام لإدارة الألم.
   8. عودة الماوس إلى غرفة الإنعاش بعد إزالة من مخدر حتى مستيقظا تماما والتحرك بحرية.

6. التأكيد من السكتة الدماغية التعريفي (بعد الوفاة)

1. في ختام دراسة، تحقق من حجم المخ باستخدام 2،3،5-triphenyltetrazolium كلوريد (TTC) تلطيخ كما هو مبين في الشكل (5). إن طريقة الكامل يمكن العثور عليه في ^12.

Representative Results

وكان الهدف من هذا الأسلوب للحث على السكتة الدماغية في النماذج الحيوانية (الماوس والفئران) بعد حقن البلعة من RB عن طريق الوريد الذيل وإضاءة لاحقة من جمجمة ضعفت مع ضوء الليزر 561 نانومتر. الصور في الشكل (4) تدل على تطور تكوين جلطة في وعاء واحد بعد التشعيع في المنطقة في 0، 1، 1.5 و 2 دقيقة. قبل تشكيل جلطة السفينة بأكملها بيضاء بسبب التدفق الحر روز البنغال. بعد تحريض تشعيع السفينة هناك سواد واضح في أجزاء من السفينة ويشير إلى تحريض تشكيل جلطة (إطارات 1 و 1.5 دقيقة). بعد انسداد كامل هناك تراكم ملحوظ روز البنغال الصبغة (المنطقة البيضاء) التي تسبق جلطة (المنطقة السوداء) داخل الوعاء. يوضح الإطار 2 دقيقة انسداد كامل للشريان.

للتحقق من وجود نقص تروية المخ TTC تلطيخ يمكن الاستفادة منها. TTC غير مشارك تستخدم mmonly وصمة عار للكشف عن احتشاء الدماغ عن طريق تشكيل لمنتجات TTC formazan الحمراء في الأنسجة السليمة. عدم وجود إنتاج formazan (الأنسجة البيضاء) يشير إلى منطقة احتشاء. الميادين المشار إليها من قبل صناديق في الشكل (5) تبين أحجام الآفة النموذجية التي تم الحصول عليها 1 و 5 أيام من حيوانين منفصلة بعد جلطة المنتجة داخل وعاء 80MM تقريبا في قطر. يتم تنفيذ تحليل الصورة على ماسح ضوئي سرير مسطح واستخدام البرمجيات يماغيج. ويمكن استخلاص مناطق المصالح داخل يماغيج لقياس مساحة حجم المخ لكل الدماغ.

يتم عرض الفولاذ المقاوم للصدأ حلقة ثلاثة آراء (أعلى، والجانب وجهات النظر أسفل) لصاحب حلقة من الصلب المقاوم للصدأ التي يتم تطبيقها على الجمجمة من الماوس ليضعوا عليه لصاحب التجسيمي: الرقم 1.

ف together.within صفحة = "دائما">
الشكل 2: مجهر منصة التصوير الإعداد لphotothrombosis RB تحتوي الجراحية منصة / التصوير على حامل لأنبوب التخدير مع الرؤوس وحامل التجسيمي للحلقة من الصلب المقاوم للصدأ التي الملصقة على جمجمة الحيوان لتقليل حركة الحيوان خلال التصوير. يتم وضع منصة على رأس والمضمون إلى جاك مختبر للسماح للحركة الرأسية لتحديد المواقع الماوس في إطار الهدف المجهر. ثم يتم إرفاق جاك المختبر إلى مرحلة المجهر، والذي يسمح للحركة أفقية. يتم وضع المسرح المجهر على رأس والمضمون إلى أربعة أعمدة اسطوانية.

الرقم 3: صورة التصوير / الجراحية تصميم منصة والتوجه تحت الجرد موضوعيerter. (A) لوحة على اليسار يوضح صورة تمثيلية لتحديد المواقع من الفأرة تخدير (تمت إزالة التخدير مخروط الأنف لفترة وجيزة لالتقاط الصورة). لاحظ استخدام حلقة من الصلب مخصصة لإرفاق الجمجمة الماوس لخفض مساهمة في التنفس القطع الأثرية في جميع أنحاء الإجراءات التصوير. الصورة على اليمين توضح صورة من النافذة القشرية تحت المجهر تشريح. (B) رسم إعداد الجمجمة رقيقة من وجهة نظر الاكليلية مما يدل على طبقات من الجمجمة فيما يتعلق جافية وسمك منطقة ضعيفة فيما يتعلق سماكة الجمجمة الكامل.

الرقم 4: صورة لتشكيل روز البنغال الجلطة الصور التمثيلية للسفينة واحدة تحتوي على روز البنغال الصبغة التي تم حقن من خلال VEI الذيل.ن من الفأرة. الصور توضح تطور تشكيل جلطة داخل السفينة بعد التشعيع في المنطقة في 0، 1، 1.5 و 2 دقيقة. ملاحظة تراكم الصبغة روز البنغال (أبيض) السابقة الجلطة (الأسود) في إطار 2 دقيقة مما يدل على انسداد كامل للشريان.

الشكل 5: كلوريد 2،3،5-triphenyltetrazolium (TTC) صورة RB الناجم عن آفة وتظهر الصور التمثيلية في يوم 1 و 5 بعد photothrombosis الاستقراء. تمت التضحية الفئران والعقول إزالة بسرعة وشرائح إلى أقسام الاكليلية 1MM وملطخة TTC وفقا للأساليب القياسية. TTC هو وصمة عار تستخدم عادة للكشف عن احتشاء الدماغ عن طريق تشكيل لمنتجات TTC formazan الحمراء في الأنسجة السليمة. عدم وجود إنتاج formazan (الأنسجة البيضاء) يشير إلى منطقة احتشاء. الالمناطق المشار إليها مربعات تظهر أحجام الآفة النموذجية التي تم الحصول عليها بعد جلطة المنتجة داخل سفينة ما يقرب من 80 ميكرون في القطر.

الشكل (6): تمثيل تخطيطي لإجراء photothrombotic روز البنغال.

Discussion

ابتليت القدرة على ترجمة التجريبية الفيزيولوجيا المرضية السكتة الدماغية من الحيوان إلى الإنسان التطبيق مع الفشل. ومع ذلك، فإن استخدام نماذج حيوانية، مثل نموذج photothrombosis، ويسمح لفهم أفضل للالسكتة الدماغية الفيزيولوجيا المرضية واستكشاف طرق علاجية جديدة لتوفير الحماية العصبية إثر إصابته بجلطة. السكتات الدماغية وmicroinfarctions التي تنتجها نموذج photothrombotic القشرية الصغيرة هي ذات الصلة سريريا تحت الإكلينيكي أو "الصامتة" السكتة الدماغية ^13-15، والتي لديها ارتفاع معدل انتشار ويؤثر على ما يقرب من 4 في المئة من سكان الولايات المتحدة (نحو 11 مليون نسمة) كل ¹⁶ عاما. لم يقم السكتة الدماغية الصامتة أعراض السكتة الدماغية الكلاسيكية الحالية في السكتة الدماغية الكبيرة، مثل الشلل وفقدان الحواس وصعوبة في الكلام من هذا القبيل كما رأينا في الشريان الدماغي الأوسط (MCA) انسداد أو هجوم نقص تروية عابرة (TIA) ^17. أيضا، والسكتة الدماغية الصامتة مختلفة من السكتة الدماغية الجوبي، التيينجم عن انسداد شريان اختراق واحد في هياكل الدماغ أكثر عمقا أو داخل جذع الدماغ وأيضا يظهر سريريا مع محرك والحسية أو العجز مختلطة ^18. المرضى الذين يعانون من الإكلينيكي أو "الصامتة" السكتة الدماغية عادة لا تظهر أي أعراض ظاهرية وغالبا لا يدركون حتى أنهم عانوا من سكتة دماغية. نتائج السكتة الدماغية الصامتة في الانخفاض تحت الإكلينيكي في الوظيفة المعرفية التي أظهرتها العجز في الذاكرة، وصنع القرار، والتغييرات في السلوك. مع مرور الوقت، والسكتات الدماغية الصامتة متعددة تؤدي إلى علامات هامة سريريا من فقدان الذاكرة المعروف باسم الأوعية الدموية أو الخرف متعددة احتشاء. ومع ذلك، يمكن الكشف عن تلف في الدماغ السكتة الدماغية الصامتة باستخدام التصوير العصبي، ويضع المريض في خطر لTIA والسكتة الدماغية الكبرى في ¹⁹ المستقبل.

نموذج photothrombosis يسمح للإنتاج استنساخه في نموذج الجسم الحي من تخثر في حالها، والماوس تخدير باستخدام صبغة حساس روز البنغال (RB) في نقل الركاب والحمولاتالأمة مع المجهر متحد البؤر. هناك العديد من المزايا التي تتمتع بها في الجسم الحي نموذج photothrombosis. ومن مزايا هذه الطريقة هي القدرة على تحديد مسبق موقع السكتة الدماغية باستخدام الإحداثيات التجسيمي. يسمح احد لدراسة معين السكان الخلية عبر الحيوانات. بالإضافة إلى ذلك، استنساخ حجم الآفة وحجم وتسيطر عليها بشكل جيد باستخدام هذه الطريقة من خلال تغيير شدة ضوء الليزر والسيطرة على حجم السفن التي المشع ^20. هذا الأسلوب يسمح أيضا لدراسة مفصلة للتغيرات في شبه احتشاء العصبي وما يقابلها من القشرة المقابل ^4. على الرغم من السكتة الدماغية الصامتة واحدة يسبب الحد الأدنى من العجز، واستنساخ هذا النموذج يسمح للقدرة للحث على السكتات الدماغية الصامتة متعددة في مجالات محددة، والتي يمكن استخدامها لمحاكاة مختلف الاختلالات الدماغ مثل الخرف الوعائي. يمكن تحديد وضع عتبة بين السكتات الدماغية الصامتة متعددة وعجز واضح سريريا في SPECIالمناطق المرورية في الدماغ من خلال استخدام هذه الطريقة أيضا. وأخيرا، فإن النموذج يسمح للدراسات طولية في نفس الحيوان السماح للآثار حادة ومزمنة التي يتعين مراعاتها.

هناك، ومع ذلك، بعض العيوب في استخدام نموذج photothrombosis. ويشمل عيب واحد إنتاج الآفة التي كما لاحظ وجود غبش الدماغية صغير بالمقارنة مع نماذج أخرى من السكتة الدماغية التنسيق ^4. ثانيا، تشكيل عائية المنشأ والسامة للخلايا وذمة غير ممكن نظرا إلى الأضرار التي قد تحدث خلال تحريض photothrombosis، الذي يشبه بشكل وثيق إصابات الدماغ من السكتة الدماغية الوصل ^4.

عند استخدام نموذج photothrombosis هناك عدد من العوامل التي يجب مراقبتها في كافة مراحل التجربة. فمن الأهمية بمكان أن الحالة الفسيولوجية للحيوان يمكن رصدها في جميع الإجراءات التصوير. ومن المعروف جيدا أن مستوى التخدير يمكن أن تؤثر على شارع الفسيولوجيةانخفضت atus من الحيوان، مع أكثر من التخدير يسبب معدل ضربات القلب وصول الأكسجين إلى الحيوان. هذا اعتبار مهم، لأن هذا من شأنه أن يقلل من توافر الأكسجين إلى الدماغ مما يؤدي إلى نقص تروية العالمي. ولذلك، فإن استخدام نظام لمراقبة الحالة الفيزيولوجية للحيوان تسمح للفي وقت واحد تسجيل غير الغازية من: الشرياني تشبع الأكسجين (مكتب التخطيط الاستراتيجي _2)؛ معدل ضربات القلب. التنفس أسعار. انتفاخ النبض (مؤشر تدفق الدم المحليين وجودة الإشارة)؛ التنفس انتفاخ (بديل للضغط intraplueral)؛ ودرجة الحرارة الأساسية في الفئران والجرذان. أنها أصبحت ذات أهمية متزايدة للسيطرة على التخدير يفند عند العمل مع أي نموذج حيواني للحد من يفند غير متوقعة في ترجمة النتائج التجريبية في الاستحقاقات في ستوك السريري. الاختيار، ومدة وعمق التخدير يمكن أن يكون لها تأثير جذري في نموذج حيواني من السكتة الدماغية التجريبية. وقد أثبتت الدراسات أن وكلاء مخدر قد يقلل من احتشاء سيزي، بل وربما توفر بعض الحماية من نقص التروية الدماغية ^21-23،24. بالإضافة إلى ذلك، كما ثبت التعديلات في إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية في دراسة مقارنة بين استخدام الهالوثين والبروبوفول ^25. هذا الخلط لا يقل أهمية عن واحدة من الفرضيات الأولية في وفاة الخلايا العصبية المرتبطة مع السكتة الدماغية هو إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية.

واحد مضاعفات استخدام في الجسم الحي المجهري لدراسة استجابة من الدماغ إلى السكتة الدماغية هي الحد من عمق التصوير تحقيقه. في مختبرنا باستخدام متحد البؤر المجهري عمق التصوير التي يمكن تحقيقها في نطاق 100-200 ميكرون، في حين باستخدام مجهر ثنائي الفوتون يمكن زيادة هذا العمق إلى ما بين 400-500 ميكرون. يتم تخفيف هذه يفند من خلال تطوير أهداف مع زيادة المسافات العمل وتناقص حجم. على سبيل المثال، مؤشر الانحدار الانكسار (غرين) microlenses هم microendoscopes الطرافةح أقطار بين 35-1،000 ميكرون و هي أصغر متاحة حتى الآن. هذا النوع من التحقيق لا يمكن إدراجها في الأنسجة دون التسبب في اضرار الغازية ولها فتحات العددية المنخفضة. يرجع ذلك إلى انخفاض NA القرار هو أدنى مقارنة بالأهداف المجهر الضوئي التقليدية ^26.

وباختصار، فإن نموذج photothrombosis روز البنغال يدفع إلى احتشاء من حجم صغير ومفيد في دراسة الاستجابة الخلوية إلى احتشاء في كل المراحل الحادة والمزمنة في السكان الخلوية واضحة المعالم. هذا النموذج يوضح الخصائص الخلوية الأساسية شهدت مع البؤري نقص التروية MCAO التالية، وبالتالي هو مفيد في تقييم العلاجات اعصاب / neuroregenerative.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Rose Bengal	Sigma	330000
Isoflurane Anesthetic	MWI Veterinary Supply	088-076
Vetbond	1469SB	1469SB
aCSF	126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucose and 26 mM NaHCO3 (pH 7.4).

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Dissecting Scissors	Bioindustrial Products	500-410
Operating scissors 14 cm	Bioindustrial Products	12-055
Forceps Dumont High Tech #5 style, straight	Bioindustrial Products	TWZ-301.22
LabJack 132X80	Optosigma Co	123-6670
Platform for Labjack 8X 8	Optosigma Co	145-1110
Ear bar holder from stereotaxic setup	Stoelting/Cyborg	51654
Dispomed Labvent Rodent anesthesia machine	DRE, Inc.	15001
Tech IV Isoflurane vaporizer	DRE, Inc.	34001
F Air Canister	DRE, Inc	80120
Bain circuit breathing tube	DRE, Inc	86111B
Rodent adapter for bain tube	DRE, Inc	891000
O2 regulator for oxygen tanks	DRE, Inc	CE001E
Rodent induction chamber	DRE, Inc	15004C
Ethicon Silk 6-0; 18 in with P-3 needle	Suture Express	1639G
Objective inverter Optical Adapter	LSM technologies
Foredom drill Dual voltage 110/120	Foredom	134.53
Meisinger 3.9 mm drill bit	Meisinger		(Ref#310 104 001 001 009)