Isolement de cellules mononucléées du système nerveux central de rats avec EAE

Summary

Dans cette vidéo, nous démontrons comment isoler les cellules mononucléées du système nerveux central de rats avec encéphalomyélite allergique expérimentale.

Abstract

Qu'il s'agisse d'étudier une maladie auto-immune dirigés vers le système nerveux central (SNC), tels que encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE, 1), ou la réponse immunitaire à une infection du système nerveux central, telles que la poliomyélite, maladie de Lyme neuroborréliose ou neurosyphilis, il est souvent nécessaire d'isoler les cellules du SNC infiltrant immunitaire.

Dans cette vidéo-protocole que nous montrent comment isoler les cellules mononucléées (CMN) du SNC de rat avec une EAE. La première étape de cette procédure nécessite une perfusion cardiaque du rongeur avec une solution saline pour s'assurer que le sang ne reste dans les vaisseaux sanguins irriguant le SNC. Toute contamination du sang sera d'augmenter artificiellement le nombre de SNC-apparente infiltrer les multinationales et peut modifier la composition apparente du système immunitaire infiltrer. Nous avons ensuite montrer comment retirer le cerveau et la moelle épinière du rat pour dilacération ultérieure pour préparer une suspension à cellule unique. Cette suspension est séparé sur un dégradé de deux couches de Percoll à isoler les multinationales. Après lavage, ces cellules sont alors prêtes à subir une procédure requise.

Des cellules mononucléées isolées en utilisant cette procédure sont viables et peuvent être utilisés pour l'électrophysiologie, la cytométrie en flux (FACS), ou en biochimie. Si la technique est réalisée dans des conditions stériles (à l'aide d'instruments stériles sous une hotte de culture de tissus), les cellules peuvent également être cultivées dans un milieu de culture de tissus. Une population de cellules donné peut encore être purifié en utilisant soit des procédures de séparation magnétique ou un FACS.

Protocol

1. Profondément anesthésier les rats. Vaporiser avec de l'éthanol 70% et faire un perfusion cardiaque avec du PBS pendant 10 min pour éliminer les cellules des vaisseaux sanguins (couper les oreillettes droite et perfuser à travers le ventricule gauche).
2. Enlever le cerveau et la moelle épinière et les placer dans un tube de 50 ml contenant PBS glacé. Couper le cerveau et la moelle épinière dans une passoire cellule 70 mm placé dans une boîte de Pétri de 10 cm contenant 10 ml de PBS glacé. Appuyez sur chaque morceau de l'organe à travers le tamis de cellules en utilisant le dos d'un piston de la seringue stérile de 1 ml. Recueillir la suspension seule cellule dans un tube de 50 ml sur la glace. Laver les cellules avec du PBS-crépine et ajouter au tube jusqu'à ce que la solution est claire.
3. Centrifuger pendant 8-10 min à 390 g.
4. Resuspendre les cellules dans 20 ml de PBS Percoll + 30% et superposer 10 ml de Percoll PBS + 70%.
5. Centrifuger à 390 g pendant 20 min à température ambiante.
6. Retirer le gras sur le dessus du tube. Recueillir les cellules de l'interface et laver deux fois avec du PBS. Comte.

Discussion

Cette procédure, comme toutes les procédures impliquant des animaux vivants, doivent être approuvés par l'utilisation des animaux de votre institution et le comité de soins. Nous recommandons qu'un vétérinaire ou un technicien vétérinaire être présents lors de l'exécution du premier perfusions cardiaques afin d'assurer un niveau suffisant de l'anesthésie est donné à l'animal avant et pendant la procédure, et que les animaux ne subissent pas de souffrances inutiles ou de détresse.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
PBS, 1x, sterile	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14190-250
Cell strainer, 70 um	Tool	Fisher Scientific	08-771-2
Percoll	Reagent	Sigma-Aldrich	P1644