In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.
חומרים סינטטיים ידועים ליזום סיבוכים קליניים כגון דלקת, היצרות, וזיהומים כאשר מושתלים כתחליף כלי דם. קולגן כבר בשימוש נרחב למגוון רחב של יישומים ביו-רפואיים, והוא נחשב אלטרנטיבה חוקית לחומרים סינטטיים בשל ההתאמה הביולוגית הטבועה בו (כלומר, antigenicity הנמוך, דלקת, ותגובות רעילות לתאים). עם זאת, התכונות מכאניות מוגבלות ויד-היכולת הנמוכה הקשורות של ג'ל קולגן שהקשו על השימוש בם כחומרי פיגום להנדסת רקמות וכלי דם. לכן, את הרציונל מאחורי עבודה זו היה ראשון להנדס ג'ל קולגן cellularized לגיאומטריה בצורת צינור והשני כדי לשפר את תאי שריר חלק הארגון מחדש של מטריצה מונע קולגן כדי להשיג רקמות נוקשה מספיק כדי להיות מטופלים.
האסטרטגיה שתוארה כאן מבוססת על ההרכבה הישירה של קולגן ותאי שריר חלק (לבנות) בcyli 3Dגיאומטריה ndrical עם השימוש בטכניקת דפוס. תהליך זה דורש תקופת התבגרות, שבמהלכו בונה בתרבית bioreactor בתנאי סטטי (ללא אילוצים מכאניים דינמיים חיצוניים שימושיים) במשך שבועות 1 או 2. "Bioreactor סטטי" מספק סביבה מנוטרת ומבוקרת סטרילי (pH, טמפרטורה, חילוף גזים, אספקת חומרי מזון ופינוי פסולות) לבונה. במהלך תקופת התרבות, מדידות עובי בוצעו על מנת להעריך את שיפוץ מונע תאים של מטריצת קולגן, וצריכה וייצור חומצת החלב שיעורי גלוקוז נמדדו כדי לפקח על תאי פעילות המטבולית. לבסוף, תכונות מכאניות וviscoelastic הוערכו למבנים צינוריים וכתוצאה מכך. לשם כך, פרוטוקולים ספציפיים וידע ממוקד (מניפולציה, מרתק, עובד בסביבת התייבשות, וכן הלאה) פותחו כדי לאפיין את הרקמות מהונדסות.
הנדסת רקמות כלי דם חוזה אסטרטגיות שונות שמטרת הייצור של כלי מהונדסים, כוללים שתלים מבוססים על פיגומים סינטטיים, כלי דם רקמות מהונדסות מבוסס גיליון תא (TEBVs), ומטריצה תאית (ECM) TEBVs מבוסס רכיבים. בין גישות אלה, פולימרים סינטטיים תערוכה תכונות מכאניות טובות, אבל חולקים חסרון משותף כפי שהם חסרי פעילות ביולוגית 1. השיטה מבוססת גיליון תא מאפשרת הייצור של תחליפי כלי דם מהונדסים עם תכונות מכאניות גבוהות, אבל את הזמן הנדרש כדי לייצר שתלים כזה הוא כ -28 שבועות 2. biopolymers הטבעי של ECM, כגון קולגן, אלסטין, הפיברין 3 או שילוב שלהם, יישאר חומרי תקן זהב עבור פיגומים להנדסת רקמות. זה בעיקר מהסיבה שחומרים אלה יש התאמה ביולוגית טובה בדרך כלל בעת היותו מסוגל לגרום לתגובות הסלולר תפקודיות 4-5. בין אלה biopolymerים, סוג אני קולגן הוא אחד של חלבון עומס הרב והבולט ביותר של ECM ברקמות רבות כגון עור, כלי דם וגידים. עבודה נרחבת נערכה על התכונות מכאניות של קולגן 6-8, אבל יש כבר כמה מחקרים רק על שיפוץ סלולארי של ג'ל קולגן במהלך התבגרות סטטי. שיפוץ סלולרי מתייחס לשינויים המבניים של מטריצת קולגן הנגרמת על ידי תאים שיכולים להשפיע על היציבות של סיבי קולגן הרשת 9. כפיגום טבעי, כמויות גדולות היחסי של הסוג אני קולגן יכולות להיות מבודדות, מעוקרות ומאוחסנות ממקורות כגון גידי עכברוש זנב 10 שונים. הבנת אינטראקציות הסלולר עם קולגן והתנהגויות מכאניות כללית בנושא של פיגומי cellularized קולגן (בונה) היא צעד חיוני לבניית רקמות. יכול להיות מעובד TEBVs מבוסס קולגן על ידי ישירות ערבוב תאים עם קולגןבמהלך הכנת ג'ל ומעוצבת נוסף לצורות ספציפיות כגון צינורי ומישוריים 11. תאי כלי דם בתוך ג'לי להתרבות וסוג לשפץ אני קולגן 12. לכן, שיטה זו עוקפת את הצורך בmacroporosity הספציפי שמייצג את אחד מהנושאים המשמעותיים בפיתוח של פיגומים עבור יישומי הנדסת רקמות. עם זאת, החסרונות העיקריים של ג'ל קולגן הם התכונות מכאניות שלהם נמוכות בהשוואה לחומרים סינטטיים 13.
במחקר זה, רקמת קיימא עם חלוקה הומוגנית של תאים תוכננה על ידי ערבוב ישיר של קולגן עם תאים בתהליך צעד אחד. "Bioreactors סטטי" שימש לשבועות 1 או 2 של התבגרות סטטי של ג'ל קולגן cellularized (ללא אילוצים מכאניים דינמיים חיצוניים מיושמים). במהלך התרבות, שיפוץ מטריצת קולגן התרחש, ובכך לספק מיגון למבנים. יתר על כן, מבנים אלה היו ready שיועבר למסתובב קיר bioreactor והאנדותל הומוגנית הושג. בנוסף, בעבודה זו בפרוטוקול בדיקות מכאני ספציפי גם הציע לספק גישה חדשנית מתאימה באפיון התכונות מכאניות של רקמות רכות צינורי.
לסיכום, עבודה זו מציגה שיטה לייצור המהיר במבחנה וההתבגרות של רקמות וכלי דם, כי הם חזקים מספיק כדי להיות מטופלים לא רק לאפיונים ביולוגיים ומכאניים, אלא גם לאוויר נוסף מכאני בbioreactor דינמי, הנחשב לקריטי צעד בהתחדשות של רקמות.
בקרב הקהילה של מהנדסי רקמת כלי דם, מאמצים אדירים שנעשו כדי לשחזר את שכבת תקשורת Tunica אחראית ליציבות המכנית של כלי דם 16. מאז עבודתו החלוצית של ויינברג ובל 17, קולגן כבר בשימוש נרחב כפיגום להנדסת רקמות כלי דם בגלל ההתאמה הביולוגית, הנכסים שאינם החיסוניים שלה והזמינות. עם זאת, השימוש בקולגן מהווה אתגר גדול לחוקרים, כחומר זה לא קל לטפל, בשל החוסר המהותי של קשיחות מכאנית. מניפולציות במהלך הכנת פיגום עלולות לגרום נזק לפיגומים, להתפשר לשימוש נוסף.
הטכניקה המתוארת בעבודה זו מאפשרת: i) להנדס ג'ל קולגן cellularized לגיאומטריה בצורת צינור; ii) להנדס רקמות ביולוגיות חזקים מספיק כדי להיות מטופלים לאחר תקופה קצרה סטטי התבגרות (1 או 2 שבועות); ג) כלתכונות מכאניות וviscoelastic sess של רקמות ביולוגיות כגון בצורת צינור ב-2 כיוונים. תאים בג'ל לשחק תפקיד מפתח בשיפוץ מטריצת קולגן. במהלך תקופת ההתבגרות, SMCs ההתכווצות הוביל לדחיסה של ג'לי מניב מבנה עם יציבות מכאנית גבוהה שיכול להיות מוערך בכיווני האורך והיקפיים. לאחר מכן, HUVECs זורעים בצד luminal של המבנים שנוצרו האנדותל הומוגנית ובת-קיימא, ובכך הוכיחו את התאמתו של ג'ל קולגן עבור יישומי הנדסת רקמות וכלי דם.
Bioreactor מוצג בעבודה זו תוכנן במיוחד כדי לספק סביבה אופטימלית לצמיחת תאים במהלך התבגרות סטטי. בנוסף, המכשירים שפותחו עבור האפיון של התכונות מכאניות וviscoelastic של המבנים נועדו במטרה להפחית את הנזק פוטנציאלי הגלום במניפולציה שלחומרים עדינים כזה. לפיכך, bioreactor סטטי היה מצויד במסנן 0.22 מיקרומטר וקרום מסנן על הכובע (שלב 1.1.2, איור 1 א ו- B) שאיפשר חילוף גזים בין מדיום התרבות בתוך המאגר והחממה, תוך שמירה על סביבת סטרילית תרבות. מחיצת luer בתחתית שימשה כנמל לדגימת מדיום תרבות ושינוי בתרבות סטטי. כמה צעדים קריטיים צריכים להיחשב במהלך ייצור מבנה ואפיונים. כל המניפולציות (שבוצעו בשלב 2.1.1 ובשלבים הבאים) שעשוי לשנות את העקרות של המערכת בוצעו במנדף הביולוגי סטרילי. תאים וג'ל קולגן הכנת תערובת טופלה על קרח כדי לעכב את תהליך gelation (שלבים 2.1.4 ל2.1.7). בשלב 2.1.7, כל בועות אוויר כלואות בתערובת לפני gelation אזורי ריכוז לחץ פוטנציאליים שיכול לסכן את יםtability של המבנים. לכן, הסרת בועות אוויר כזה דורש מעט רועד ההרכבה או באמצעות ואקום רפואי במשך 3 דקות לdegasing בתנאים סטריליים. לבסוף, להתמודד עוצבו במיוחד לשמירה על הציר המרכזי בmandrel עובש הצינור במהלך gelation ולמאפשר מניפולציה עדינה של המבנים בקציר (הסרת mandrel, סעיף 2.4), לendothelialization, ועל מנת להקל על ההרכבה המערכת המכנית (בדיקות אורך).
הפרוטוקול הנוכחי מציע גישה מקורית וקל לתהליך אלטרנטיבי של חיזוק מבני ג'ל קולגן המבוססים על הפוטנציאל הגלום התכווצות הטבעית של SMCs. טכניקות נפוצות של חיזוק מטריצות קולגן כרוך בשימוש בסוכני crosslinking פיזיים וכימיים שיכולה להיות השפעות מזיקות על אינטראקציות תאי מטריצת 18-20. טכניקת הייצור מוצגת בעבודה זו מאפשרת לכוון את תהליך שיפוץ מונע תאים זו להניב מבנה רקמות מהונדסות עם תכונות מכאניות ממוקדות ללא כל טיפול פיזי או כימי.
אפיון של תכונות מכאניות וviscoelastic של ג'ל קולגן התייבשות הוא אתגר גדול. בפרספקטיבה זו, הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה פשוטה ויעילה מקורית להערכת התכונות מכאניות של רקמות רכות צינורי. אפיון זה יכול להתבצע לא רק בכיוון ההיקפי, אלא גם בכיוון האורך, ישירות על כל המבנה צינורי. במהלך אפיון מכאני, טמפרטורה, סביבה מימית, pH וחוזק יוני הם חלק מהגורמים הסביבתיים שידועים כי הם משפיעים על ההתנהגות המכנית של רקמות ביולוגיות 21 באופן דרסטי. לפיכך, העבודה הנוכחית מצביעה על הגדרה מקורית ופרוטוקול לאפיון המכני של רקמות ביולוגיות במאודפסאודו-פיזיולוגית לשחזור סביבה (תמיסת מלח על 37 מעלות צלזיוס וpH 7.4). למיטב ידיעתנו, של אפיון סוג זה דווח לא במקום אחר.
לסיכום, הטכניקה המוצעת בעבודה זו מדגימה את הפוטנציאל הגבוה של ערבוב הישיר של תאים עם קולגן עבור יישומי הנדסת רקמות וכלי דם. שיטה זו ביחד עם תהליך האפיון וendothelialization המכני מהווה פרוטוקולים רבים ערכיים גבוהים. מכאן, דרך שינויים קלים של הסט-אפ ופרוטוקולים, תוך שמירה על אותו הרציונל, דרישות עיקריות לשווים רקמת כלי דם הנדסה ניתן לטפל כגון עיבוד מהיר ולא מסובך, כולל endothelialization, ואת האפשרות להיות משורבב למגוון רחב של רך רקמות עם אורכים ובקטרים שונים. יתר על כן, ניתן לחקור סוגים שונים חסיד תא, חלבוני ECM וגיאומטריות יצוקות למספר applicati הממוקדתוספות, כגון גידי הנדסה, שתלי עור, כתמי לב, עצבים, בין יתר. למרות התכונות מכאניות של המבנים מעודדות, הם עדיין נמוכים יותר מאלה של רקמות ילידים. בהקשר זה, אנו מאמינים שתקופת התבגרות סטטי קצרה מאוד היא צעד חיוני לגירוי הדינמי לתוך bioreactor, ובכך מוביל לשלמות מבנית גבוהה ויציבות מכאנית. עם זאת, את האפשרות לייצר במהירות מבנים מבוסס קולגן cellularized רקמות מהונדסות מתאימה למכאני והיסטולוגית ניתוחים עושה bioreactor סטטי המתואר במסמך זה כלי שימושי ומבטיח לספק תובנה יחסי הגומלין בין תאים וECM במהלך צמיחה ושיפוץ, או אפילו ל לשמש כמודל לטיפולים ומערכות אספקת סמים.
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה מומן על ידי מדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה, המכון הקנדי לחקר הבריאות וקוויבק מרכז מחקר CHU דה.
CellTreat 50 mL Bio-Reaction tubes | CELLTREAT Scientific Products | 229-475 | Centrifuge tube |
Male luer with lock ring x 1/8" hose barb. PP. 25/pk | Cole Parmer | RK-45503-04 | Luer fittings for "gas-exchange port" |
Female luer x 1/8" hose barb adapter. PP. 25/pk | Cole Parmer | RK-45500-04 | Luer fittings for the "medium sampling port" |
Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 17. 25 ft. | Cole Parmer | RK-96410-17 | Tube 1 and 2 for the gauze grippers |
Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 16. 25 ft. | Cole Parmer | RK-96410-16 | Tube 3 for the gauze grippers |
Silastic Medical adhesive silicone, type A | Dow Corning | – | Silicon glue for the fabrication of the static bioreactor |
Polyvent 4 Vessel venting filters | Whatman | 6713-0425 | Filter for "gas exchange port" |
Rod. PP. stirring. 8’’ | Scienceware | 377660008 | Mandrel |
Stopper silicone rubber 00 PK12 | VWR | 59590-084 | Stopper for the insertion of the mandrel to the vented cap of the centrifuge tube |
Krytox PFPE/PTFE Greases | Dupont | GPL 202 | Medical grade grease for covering the mandrel |
Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 | Cell culture |
Xiameter RTV-4130-J base and curing agent | Dow Corning | – | C-shaped silicone support for endothelialization |
Dulbecco’s modified Eagle medium, DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco (Life Technology) | 11995-065 | Cell culture |
Pure acetone (99%) | Laboratoire Mat Inc. | AP0102 | Chemical for collagen extraction |
Isopropyl alcohol (HPLC grade, 99.9%) | Fisher Scientific | AC610080040 | Chemical for collagen extraction |
0.02 N acetic acid (glacial acetic acid, HPLC grade, 99%; Fisher Scientific, | Fisher Scientific | FL070494 | Chemical for collagen extraction |
Chloroform solution (99%) | Laboratoire Mat Inc. | CR 0179 | Chemical for collagen extraction |
Hepes | Sigma-Aldrich | 163716 | Chemical for construct preparation |
NaOH | Laboratoire Mat Inc. | SR-0169 | Chemical for construct preparation |
LaserMike 136 | LaserMike | Series 183B | Scanning laser interferometer |
ElectroPulse MicroTester | Instron Corporation | – | Micromechanical Tester |
HyClone Media M199/EBSS, 500 mL | GE Healthcare Life Sciences | SH30253.01 | Component of cell culture medium |
Fetal bovine serum HI – 500mL | Gibco | SH 30396.03 | Component of cell culture medium |
Porcine serum (PS) | Sigma-Aldrich | P9783 | Component of cell culture medium |
Penicillin-Streptomicin | Gibco | 15140-122 | Component of cell culture medium |
Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP661-50 | Saline solution |
Tissue culture flask T17CN Vent Cap Red | Sarstedt Inc. | 83.1812.002 | Cell culture |
ColorpHast- pH-indicator strips (pH=6.5-10.0) | EMD | 9583 | pH measurements |
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 mL vial | BD Biosciences – Discovery Labware | 356230 | Concentrate protein mixture for endothelialization process |
LifeCam VX-3000 | Microsoft | – | Thickness measurement |
Biochemical analyzer, DxC600 | Beckman Coulter Unicell Synchron | – | Glucose and lactate concentrations measurements |
Collagen fibers | Rat tails | – | Collagen was extracted in the laboratory |
Porcine smooth muscle cells (pSMCs) | Porcine aortas | – | pSMCs were isolated in the laboratory |
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Human umbilical veins | – | HUVECs were isolated in the laboratory |