Abstract
Propiedades electrofisiológicas de las células se estudian a menudo in vitro, después de disociar desde sus ambientes nativos. Sin embargo, el estudio de la transmisión eléctrica entre las células distantes en un organismo requiere in vivo, grabaciones libres de artefactos de células embebidas dentro de su entorno nativo. La transmisión de señales eléctricas de herida de áreas ilesos en una planta ha puesto mucho despertado el interés de los botánicos. El floema, la parte viva de la vasculatura planta que se extendió por toda la planta, se ha postulado como un pañuelo de papel importante en la transmisión eléctrica en las plantas. La falta de métodos electrofisiológicos adecuados plantea muchos retos para el estudio de las propiedades eléctricas de las células del floema en vivo. Aquí presentamos un nuevo enfoque para la electrofisiología intracelular de elementos de tamiz (PE) que utiliza los áfidos vivos o de otros insectos hemípteros de alimentación floema, integrada en el gra penetración eléctricaph (EPG) de circuito. La versatilidad, robustez y precisión de este método han permitido registrar y estudiar en detalle las señales eléctricas inducidas por la herida en las SE de las venas centrales de la planta modelo Arabidopsis thaliana 1. Aquí nos muestran que la EPG-electrodos se pueden implementar fácilmente intracelulares registros electrofisiológicos de las PE en las venas marginales, así como para el estudio de la capacidad de las PE a responder con señales eléctricas a varios estímulos externos. El enfoque EPG aplicado a electrofisiología intracelular de PE puede ser implementado a una amplia variedad de especies de plantas, en un gran número de combinaciones de plantas / insectos, y para muchos de investigación pretende.
Introduction
La capacidad de producir señales eléctricas de larga distancia es un rasgo ventajoso de los organismos multicelulares que permite respuestas eficientes a los estímulos externos. Este rasgo ha evolucionado independientemente en plantas y animales, y por lo tanto representa un caso de evolución convergente. Dado que las señales eléctricas se acoplan con funciones importantes en animales tales como la transmisión neural y la contracción muscular, la base molecular, el mecanismo de transmisión, y la función de señales eléctricas estímulos inducidos en animales son sujetos de investigación intensiva. Por el contrario, los estímulos inducidos por la señalización eléctrica en plantas ha recibido poca atención de la investigación. Aunque las plantas no tienen nervios o músculos, parece que hay suficiente evidencia para suponer que las señales eléctricas estímulos inducidos en las plantas juegan un papel clave en sus respuestas a los factores ambientales.
El floema, el componente viviente de la vasculatura de la planta, se ha postulado como un sub importanteStrate para la transmisión de señales eléctricas estímulos inducidos, desde estimulado / dañado a las áreas no estimulados / 2 no dañadas. Las principales células del floema son los elementos de criba (SES), células relativamente simple, alargados. Los extremos de las PE están conectados a otra SE, formando una baja resistencia continua, sistema de tubos de tamiz que se extendió por toda la planta. Hay, sin embargo, muy pocos estudios sobre las propiedades eléctricas de estas células altamente especializadas. En estos estudios anteriores, los investigadores acceder a las PE, ya sea con vidrio micro-electrodos 3 estiletes o con electrodos de vidrio que fueron acoplados a plantar insertados-de áfidos, después stylectomy (corte) 4. Microelectrodos de vidrio están hechos de capilares de vidrio que se extraen en un extremo con calor en una punta fina de menos de 1 micra de diámetro, y luego se llena con una solución de KCl. A Ag / AgCl o platino alambre, se inserta en el electrodo de vidrio llenos de KCl se conecta entonces a la entrada del amplificador, y un referenteelectrodo se inserta en el baño que rodea a la célula de interés, completando el circuito. Esta configuración registra la diferencia de potencial entre el electrodo extracelular referente y el electrodo de medición intracelular, es decir, el potencial de membrana de la célula 5. Con este método, Umrath hizo la primera grabación intracelular de una célula de planta, utilizando las algas Nitella 6,7. Nitella es un organismo relativamente simple con células grandes, y por lo tanto susceptibles de experimentos de electrofisiología intracelulares. En contraste, la inserción de electrodos de vidrio intracelulares en las pequeñas células de plantas terrestres multi-celulares, tridimensionales es técnicamente exigente, requiere un investigador altamente cualificado, así como la visualización sofisticado, micromanipulación, y equipo anti-vibración. Aunque electrodos de vidrio son adecuados para grabar a partir de células superficiales en plantas, tales como células epidérmicas de la raíz 8, recordin intracelulargs de células profundamente arraigados en el tejido de la planta, tales como las SE, las respuestas inducidas por daños por causas muy probables, confundiendo los resultados. En 1989, Fromm y Eschrich informaron el uso de un método alternativo, llamado el "método pulgón ', en la que los electrodos de vidrio se acoplan a estiletes áfidos después stylectomy 4. El método áfido es mínimamente invasivo, porque estiletes flexibles no causan daño tejido o célula como electrodos de vidrio hacen. Estiletes áfidos son gran invento de la naturaleza para la penetración de la planta, y los áfidos son considerablemente más hábiles que los seres humanos en la búsqueda de la SE. Desafortunadamente, este método pulgón también es muy exigente en términos de experiencia y el equipo técnico. Además, el éxito de cada experimento que implementa esta técnica depende enteramente de la áfido estar en modo de alimentación - con el estilete insertado en una forma estable SE, en el momento de stylectomy. Pensando en retrospectiva, uno puede ver que las probabilidades de éxito de esta técnica podría haber sido improved mediante la adición a la configuración experimental de un instrumento que permite identificar si o no el estilete áfido está en el SE al aplicar stylectomy.
En 1964, McLean y Kinsey describen un "sistema de vigilancia electrónica" para el estudio del comportamiento de alimentación de los pulgones en tiempo real 9,10. En este sistema, el pulgón y la planta estilete-penetrado fueron integrados en un circuito eléctrico. Más tarde, en 1978, Tjallingii ideó una versión modificada del sistema, llamado sistema 'eléctrico Penetración Graph' (EPG) 11,12. Considerando que el sistema de monitorización electrónica original era sensible a los potenciales de resistencia originada solamente, con el sistema EPG, la fuerza electromotriz (fem) se originó potenciales, es decir, generados en la planta o en el insecto, se podrían registrar además de los potenciales derivados de la resistencia (R) en el insecto. Esto representa una mejora importante, debido a que tanto la señal de componentes, fem y R,proporcionar biológica información pertinente sobre los acontecimientos durante la penetración planta por áfidos. Lo que hace que el preamplificador EPG sensibles a los componentes R es su relativamente baja resistencia de entrada de 1 GΩ, que es cerca de la media de la resistencia de la planta / pulgón. Una tensión de offset pequeño (Figura 1, V) de aproximadamente 100 mV se aplica a la planta, que luego se divide a través de plantas e insectos en un lado, y la resistencia de entrada en el otro. Las tensiones y sus cambios se miden en un punto (Figura 1A, B) entre el insecto y la resistencia de entrada. Por lo tanto, los componentes R representan modulaciones de resistencia-áfido de plantas de la tensión de offset, mientras que los componentes son emf una cierta fracción de los potenciales de la planta en la punta del estilete y potenciales causados en el insecto. Los potenciales de plantas - más relevantes aquí - son potenciales principalmente de membrana de las células vegetales pinchados por los estiletes de áfidos. Los potenciales de insectos parecen ser principalmentelos potenciales de transmisión causados por los movimientos de fluidos dentro de los dos canales del estilete, es decir, la comida y los canales salivales; no hay potenciales de los nervios o músculos internos se registran en la EPG. En la práctica, las funciones de la punta del estilete como una punta de electrodo. Todas las células vegetales están cargados negativamente en el interior respecto al exterior positivo de la célula. La corriente eléctrica (es decir, el movimiento de iones cargados en solución acuosa) que fluye desde el interior hacia el exterior y vice versa es muy limitada debido a la alta resistencia de la membrana celular. Normalmente, el potencial de reposo se mantiene constante. Sin embargo, cuando los iones negativos se mueven hacia fuera o iones positivos se mueven a través de la membrana celular, el potencial de membrana se reduce, es decir, es despolariza '. La despolarización se produce en el caso de la excitación celular. Los iones entonces se mueven dentro o fuera cuando los canales de iones específicos en la membrana se abren o cuando la membrana está dañada y los iones de fugas dentro y fuera. Todas las células tienen canales iónicos y bombas en tque la membrana plasmática que llevar el potencial de membrana a su nivel de reposo mediante la restauración de la concentración original de diversos iones dentro de la célula. El potencial de reposo y sus cambios son componentes emf, y por lo tanto, la técnica de EPG es adecuado para medir ellos.
Figura 1. EPG-electrodos. La EPG-electrodo es un áfido de estar integrado en el circuito eléctrico Penetración Graph (EPG), cuyo estilete se inserta en un elemento de tamiz (SE) en el modo de alimentación estable. Si el estilete SE-empalado está en reposo (panel A), el voltaje en el circuito, registrado por EPG, es estable y en el nivel de potencial de reposo (Panel C, Rest). Si la SE es excitado, sus despolariza la membrana (panel B), que se visualiza en la EPG como un incremento gradual en el voltaje (panel C, despolarización). Como el equilibrio iónico en la SE vuelve a descansar, es decir, repolarizes, la tensión registrada por EPG disminuye gradualmente al nivel potencial de reposo (Grupo C, repolarización). En el panel C, "A" y "B" se refieren a los escenarios que se muestran en los paneles A y B, respectivamente. V = Ajustable fuente de tensión de offset. Ri = resistencia de entrada. En paralelo a la resistencia externa 1 GΩ, el amplificador tiene una interna (en el OpAmp) de alta resistencia de 1,5 TΩ (paneles A y B, en gris). Por control remoto del interruptor de la pre-amplificador EPG se puede cambiar de normal a EMF-mode, que permite obtener valores de tensión de alta precisión. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En la siguiente sección, ofrecemos al lector con un protocolo básico para la realización de experimentos de EPG que es válido tanto para los estudios de insectos centrado y enfocado en plantas.
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Protocol
1. Pulgón Crianza
Nota: La elección de las especies vegetales y de áfidos para grabaciones EPG depende de la finalidad de la investigación. Para los estudios en Arabidopsis thaliana, el brassicae Brevicoryne pulgón es apropiado.
- Posterior B. áfidos brassicae en un invernadero en Brassica oleracea. Mantener las plantas utilizadas para la cría de áfido en jaulas, con el fin de evitar la contaminación de otras plantas. Mantenga las plantas de áfidos crianza y plantas experimentales (en nuestro caso B. oleracea y A. thaliana) en habitaciones separadas, con el fin de evitar la contaminación de las plantas experimentales con pulgones.
- Traslado áfidos de las plantas frescas sobre cada 2 semanas, antes de causar daños a las plantas significativa, o llegar a la superpoblación. Traslado 10-20 pulgones adultos a una planta de cría fresco para iniciar una nueva colonia.
- Supervisar la crianza plantas regularmente para la contaminación por especies no deseadas de áfidos, otros insectos herbívoros, parasitoides de áfidos y fungi que puedan afectar a la salud de la colonia de áfidos.
- Recoger adultos, áfidos sin alas hasta una semana después de su última muda para la grabación EPG.
- Después de los experimentos, devolver las plantas experimentales que no estaban acostumbrados a la cámara de crecimiento, ya que a menudo tienen algún descendiente que se ha producido durante la grabación, que inadvertidamente podría contaminar otras plantas.
2. Insecto de cableado para la grabación EPG
- Para electrodos de insectos, obtener patillas del conector de latón (clavos, Ø 1,2 mm), alambre de cobre fino (Ø 0,2 mm), de alambre de oro muy fina (aprox Ø 20 micras), pegamento plata a base de agua, un perno de soldadura pequeño y sencillo con fluido de soldadura y alambre de soldadura con núcleo de resina, microscopio estereoscópico con aumento 10X, pequeñas tijeras o bisturí, dos pinzas finas, y una hoja de espuma de poliestireno o caja. Nota: Un mezclador de vórtice podría ser útil. Nota: El protocolo paso a paso para hacer electrodos se indica en la Figura 2.
- Para áfidomanipulación y aplicación de cola, obtenemos: un pequeño cepillo de pelo de camello y suave acuarela (tamaño 2 o menor) y los pasadores de insectos tales como los utilizados para colecciones de insectos, aunque una aguja de coser fino o palillo de dientes pueden funcionar tan bien. Paso 4 muestra cómo iniciar la grabación EPG.
- Paso 1.
Nota: Los pasos 1 y 2 a continuación muestran cómo preparar electrodos de insectos menos el pulgón. Paso 3 muestra cómo conectar un áfido al electrodo. Se recomienda vacío fijación del pulgón durante el cableado, pero no siempre se requiere para las especies de movimiento lento (por ejemplo, B. brassicae).- Encienda el perno de soldadura y derretir un poco de alambre de soldadura en la punta (Figura 2A). Humedezca la cabeza de la clavija de conexión de latón con un poco de líquido de soldadura (Figura 2B) e introducirlo en la soldadura de metal fundido (Figura 2C).
- Aplicar una funda de metal de soldadura fundida en un extremo de una pieza larga 1-2 cm del alambre de cobre fino (Figura2D). Luego, lleve el alambre pasador y cobre juntos contra el perno caliente (Figura 2E) y moverlos juntos lejos enfriar y solidificar (Figura 2F).
- Paso 2.
- Agite (o vórtice) el vial con pegamento plata durante varios minutos hasta que se muestre una emulsión suave. Cut (tijeras o bisturí) algunas piezas de alambre de oro (de aproximadamente 1,5 cm de longitud) en la placa objeto de la estereoscópico (Figura 2G).
- Tome un pin de latón con hilo de cobre soldada (hecho en la sección 2.3) y sumergir el extremo libre del cable de cobre en el pequeño depósito de cola de plata que se han reunido en el interior de la tapa del vial después de abrirlo (Figura 2H). Nota: Sólo se necesita una pequeña gota.
- Mueva el extremo de cola de cruce del hilo de cobre a la pieza de hilo de oro, mientras levanta un extremo para evitar manchar el pegamento sobre la placa objeto estereomicroscopio. Trate de solapar copper y alambre de oro para unos pocos mm (Figura 2I), distribuyendo el pegamento a lo largo de la superposición de los dos cables.
- Espere hasta que el pegamento se haya secado lo suficiente para mantener los cables unidos. Compruebe el contacto del pegamento después del secado y añadir un poco de pegamento fresco con un pequeño alfiler u otro trozo de alambre de cobre, si algunas partes de los cables unidos muestran partes sin pegamento.
- Después de que el electrodo de insectos está listo, almacenarla, por ejemplo se inserta en un pedazo de espuma de poliestireno.
Nota: La longitud del hilo de oro determinará la libertad de movimiento del pulgón: si es demasiado corto (menos de 5 mm), el pulgón puede sentirse limitado y no comportarse normalmente; si es demasiado largo (> 2 cm), el áfido se moverá libremente. Los áfidos tienden a moverse hacia el lado adaxial de las hojas, si se le permite. Si el hilo de oro toca la hoja, la señal estará en cortocircuito.
- Paso 3.
- El pulgón puede mantenerse en su lugar por medio de succión luz, usando un vacío; en este caso, instalar tque succionar dispositivo bajo el microscopio estereoscópico. Coloque la abertura de aspiración en el centro del campo.
- Agite el vial con pegamento plata durante varios minutos (o torbellino) hasta que se forma una emulsión suave. Reunir un áfido con el cepillo pequeño.
- Encienda el dispositivo de succión y montar el pulgón de la abertura de succión (Figura 2J), con la parte posterior del abdomen se volvió hacia el experimentador. Con el pincel fino, eliminar cualquier cera de la superficie del abdomen (abundante en los áfidos de col).
- Abra el vial pegamento y mojar un pasador con una muy pequeña gota de pegamento de plata (Figura 2K). Aplicar la gotita de la cola de plata en la parte posterior del abdomen de la áfido (Figura 2L-M). Que esta gotita completamente seco durante varios minutos, agitar enérgicamente el vial pegamento de nuevo y añadir una segunda gota de pegamento de plata en la parte superior de la primera. Nota: Mientras que el pegamento de plata es un conductor eléctrico, que no causa significativadaños a la cutícula del insecto.
- Después de cerrar el frasco de pegamento, inserte el extremo libre del alambre de oro en la gotita húmedo y mantener el cable todavía al tiempo que permite que el pegamento se seque por completo (Figura 2 N). Evite manchar pegamento en las piernas o antenas y descartar un áfido si esto ha sucedido.
- Apague el dispositivo de fijación de succión y levante con cuidado el insecto (Figura 2O). Si es necesario, utilizar un pincel fino para ayudar en el levantamiento del áfido del dispositivo de succión.
Nota: El cableado B. brassicae no requiere un vacío, ya que pueden ser cableados en una pieza de un tejido de precisión de laboratorio, la superficie rugosa de las cuales proporciona el pulgón con suficiente agarre de modo que no será levantado después de aplicar una gota de pegamento húmedo a su abdomen. Después del secado el pegamento se puede levantar el áfido del tejido con la ayuda de un pincel fino. - Inserte el pasador de latón con el insecto por cable en la espuma de poliestireno y, si es necesario, continuarel cableado de todos los otros insectos que se utilizará para la sesión de grabación EPG.
Nota: Estos protocolos para el cableado de áfidos funcionan bien para nosotros. El usuario puede encontrar a su / su propio método para el cableado de los áfidos.
- Paso 4.
- Ponga plantas en la jaula de Faraday (Figura 2P) sobre un soporte no conductor: utilizar placas de Petri o una placa de vidrio o plástico.
- Inserte un electrodo de planta en el suelo de cada maceta. Inserte el pasador de bronce del insecto por cable en el conector de entrada del preamplificador EPG (Figura 2Q). Nota: el electrodo de suelo no se corresponde con el electrodo de tierra utilizado en otras técnicas electrofisiológicas. Tiene la tensión de desplazamiento necesario para ajustar y compensar las tensiones de polarización del electrodo.
- En la interfaz del software de adquisición de estilete +, con frecuencia de muestreo fijo de 100 Hz, introduzca un nombre de archivo, especifique el tiempo de grabación, y escribir texto para especificar los detalles del experimento (tratamiento, planta / inse especies ct, etc.) en líneas de comentario 2 y 3.
- Baje los insectos en una zona de aterrizaje adecuada de la planta e iniciar la sesión de grabación haciendo clic en el botón Inicio de la interfaz de software de adquisición (estilete +).
Nota 1: un máximo de 8 canales se puede utilizar de forma simultánea en una EPG configurar. Una EPG-electrodo o varios electrodos de EPG por planta pueden ser utilizados.
Nota 2: cuando el enfoque del estudio es el comportamiento de áfidos, iniciar la grabación antes de acceso a la planta de los pulgones para evitar perder las primeras actividades de penetración de la planta. - Para el estudio de las respuestas electrofisiológicas de las PE a los estímulos, espere por lo menos 10 minutos después de que el pulgón ha entrado en fase de floema, con el fin de garantizar que el pulgón se encuentra en una fase de la ingestión floema sostenida, y que la línea de base de la señal es estable. Sólo entonces, comenzar cualquier experimento estimulación planta.
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Figura 2. Hacer EPG-electrodos con pulgones y otros insectos hemípteros de gráfico penetración eléctrica (EPG) grabaciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Paneles de AI, los pasos necesarios para preparar la EPG-electrodos menos el pulgón. En primer lugar, fundir una pieza de metal de soldadura en la punta de un perno de soldadura (A). Luego, sumerja la cabeza del pasador de latón en una gota de líquido de soldadura (B), y póngase en contacto con el metal fundido en la punta del perno de soldadura (C). Inmediatamente después de este paso, póngase en contacto con el extremo de un cable de cobre a la punta del perno de soldadura, con el fin de la cola a la cabeza del pasador de latón (EF). Con un bisturí o una cuchilla, cortar un trozo de alambre de oro (G). Inmersiónel extremo libre del hilo de cobre (unido en el otro extremo a la clavija de latón) en el pegamento de plata (H), y rápidamente se unen al alambre de oro a él (I) antes de la plata se seca. El alambre de oro es un excelente conductor, y puede ser polarizada. En realidad, en la mayoría de los casos la polarización es demasiado pequeño para ser detectado, y si es así, puede ser compensada con la tensión de offset (V).
Paneles JO, los pasos necesarios para conectar un áfido (u otro insecto hemipteran) al electrodo. En primer lugar, levante con cuidado un áfido con un pincel de acuarela fino y colocarlo en la apertura del dispositivo de succión de vacío (J). Encienda la bomba de vacío y cubra el orificio de la válvula de aire con un pedazo de papel para aplicar succión. Sumerja la punta del pasador de insectos en la cola de plata (K), y poner una pequeña gota de pegamento en la parte superior del abdomen del pulgón, bajo un microscopio estereoscópico (LM). Dentro depróxima ~ 20 seg, antes de la gota de pegamento de plata en que se seque el pulgón, inserte el extremo del hilo de oro del electrodo de insectos en la gotita húmedo de cola de plata, y mantenerlo en su lugar durante 1-3 minutos, hasta que el pegamento plata tiene completamente seca al aire (N). En este punto, deshabilitar aspiración quitando el pedazo de papel que cubre el agujero de la válvula de aire del dispositivo de succión y retire con cuidado el pulgón, desde el dispositivo de aspiración: levantar el pulgón después cableado menudo requiere un poco de ayuda de un pincel fino (O).
Panel P muestra una vista general de toda la EPG configurado dentro de la jaula de Faraday, y Panel Q muestra una visión general de la combinación planta-áfido de EPG. Vea la sección 2 más arriba para una explicación más detallada de este proceso.
Las letras minúsculas son etiquetas que se refieren a los elementos que uno tiene que hacer EPG-electrodos: a: perno de soldadura; b: fundió el metal de soldadura;c: El líquido de soldadura; d: latón pin conector (uñas); e: alambre de cobre; f: hilo de oro 18μm Ø; g: dispositivo de succión; h: pulgón; i: pegamento plata a base de agua; j: Jaula de Faraday; k: electrodo planta; l: conector de entrada (BNC) de la pre-amplificador EPG.
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Representative Results
En un estudio anterior, se implementó la técnica de EPG-electrodo con el fin de caracterizar las señales eléctricas producidas en las SE de la vena media durante el ataque de oruga 1. El nervio central es un sitio de inserción preferido para electrodos de vidrio convencionales, así como para los electrodos de vidrio-estilete, porque es SE-densa, relativamente robusto y, por lo tanto susceptible a la fijación necesaria para la aplicación de estas técnicas. Aquí, nos aprovechamos de la versatilidad del electrodo EPG con el fin de recabar información electrofisiológica de más difícil acceder a las PE, en particular los de las venas marginales de las hojas. Figura 3 muestra una EPG típica grabación de una SE en una vena marginal de un. planta thaliana, que contiene una señal eléctrica inducida por la herida distal. A diferencia de las SE en las principales venas, las PE en las venas marginales respondieron al daño a distancia con una sola ola, la despolarización lenta que puede corresponder a laonda de despolarización lenta en las SE centrales. En promedio, esta despolarización lenta inducida de forma remota en los PE del margen de la hoja tenía una duración media de 61 ± 27 seg, y la amplitud promedio de 37 ± 2 mV (n = 3, con una media ± SEM). Estos datos, fácilmente obtenibles con EPG-electrodos, sugieren que las señales eléctricas inducidas de heridas en hojas ilesos se propagan desde el gran paquete vascular al floema en las venas menores.
Aquí también explotado la robustez de electrodos de EPG, para investigar si un SE puede responder a diversos estímulos perjudiciales, entregados dentro de un intervalo de tiempo del orden de minutos. Cuando dos hojas fueron cortadas con tijeras en la unión del pecíolo lámina, una EPG-electrodo colocado en una hoja intacta detectado respuestas similares de la misma SE a estas heridas (Figura 4A). En otro experimento, una oruga se utilizó como agente de la herida. La oruga primero cortó una hoja no vecino, y luego, después de unos minutos, se movió thoja vecino oa y cortarlo también. Mientras que la primera herida en la hoja no vecino inducida solamente una despolarización transitoria lenta, la segunda herida en la hoja vecino inducida la señal eléctrica completa que contiene un lento y una despolarización rápida, consistente con los experimentos anteriores 1. Estos datos muestran que un elemento de tamiz puede detectar múltiples eventos hirientes infligidas a otras hojas, entregados dentro minutos el uno del otro.
Figura 3. Grabaciones intracelulares de señales eléctricas inducidas de heridas de elementos de tamiz (SES) en las venas marginales con EPG-electrodos. Eléctrico Penetración Gráfico (EPG) de segmentos de señal de la fase-floema alimentación del brassicae Brevicoryne pulgón. El áfido registrada-EPG se alimentaba de una SE situado en una vena marginal de la hoja # 8 (Arabidopsis thaliana, De tipo salvaje), que se muestra en el dibujo animado de la izquierda. La señal de EPG muestra una onda de despolarización lenta en el SE marginal poco después de cortar una hoja vecino proximal (hoja # 3). Los componentes de la señal, pequeños rápidos, rítmicos hacia abajo representan los potenciales de transmisión derivados de la ascensión de la savia rítmica lo largo del canal de alimentos del estilete durante la fase de ingestión (E2 forma de onda). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. respuestas eléctricas múltiples a hiriendo a estímulos en los elementos de tamiz (SES) adquiridos con EPG-electrodos La robustez de la (Brevicoryne brassicae - Arabidopsis thaliana) áfido-planta. Interacción y la estabilidad de los estiletes de áfidos insertados-SE son propiedades importantes de EPG-electrodes que permiten la adquisición de largas grabaciones EPG (horas). Aquí nos aprovechamos de estas propiedades para investigar si un SE puede responder a dos estímulos hirientes remotas. El panel A muestra las respuestas de un SE a dos eventos hirientes artificiales (corte de la hoja de las tijeras) consecutivamente infligidas a dos vecinos diferentes hojas. Hay un intervalo de aproximadamente 17 min entre los dos estímulos. El panel B muestra las respuestas de un SE a dos eventos hirientes naturales consecutivos. Un 4 º estadio oruga de la mariposa de la col (Pieris brassicae) fue utilizado en este experimento. La oruga primero cortó una hoja no vecino (en relación con la hoja grabada EPG), induciendo una, despolarización transitoria lento. Luego, aproximadamente 7 minutos más tarde, la oruga cortó otra hoja vecino, que provocó una doble señal de despolarización (es decir, que contiene una lenta y una rápida despolarizaciones transitorios) en la SE-áfido registrada. Las flechas indican el tiempo donde las heridasfueron infligidas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este artículo proporciona un protocolo detallado para la toma eléctrica Penetración Gráfico (EPG) grabaciones. La técnica EPG está bien establecida, con 100 a 200 usuarios activos en todo el mundo, y se ha implementado para muchos estudios sobre diferentes temas, por ejemplo: a) resistencia de la planta huésped de pulgones y otros insectos portadores de estilete 13; mecanismos de transmisión b) virus de plantas y patógenos 14; c) el modo de insecticidas de acción, (toxicidad y cambios de comportamiento) 15; d) EPG incluso han sido útiles para demostrar que las peleas de áfidos son ventajosas para el ganador, ya que aumenta su eficiencia de alimentación 16.
Aprender a cablear los insectos para la grabación EPG no es difícil, pero requiere paciencia y la experiencia práctica de dominar. De hacer electrodos en el insecto con cable final, se recomienda un período de práctica de una o dos semanas. Durante este tiempo, el investigador va a familiarizarse / a sí mismo con el manejo de los elegidosespecies de insectos y de proceder a través de todos los pasos correctamente. Los pasos críticos son: para soldar correctamente, moviendo bien el frasco de pegamento de plata antes de tomar una gota de pegamento del tamaño adecuado - ni demasiado pequeño ni demasiado grande - la garantía de conexión eléctrica y mecánica adecuada, y colocar el hilo de oro dentro de la gota de plata en el abdomen del insecto de manera que no va a restringir los movimientos de insectos. El no poder realizar estos pasos correctamente dará lugar a la mala conectividad eléctrica, que se traducirá en datos de mala calidad o inaceptable. Al dar el acceso de insectos por cable a la planta, es importante monitorear visualmente durante la primera media hora de la grabación. Durante este período, los áfidos se están acostumbrando al cable, y pueden alejarse del lugar de grabación deseado, o dejar a la planta. Por lo tanto, uno puede tener que volver a posicionar los áfidos durante este período. En el caso de objetivos de comportamiento, no re-posicionamiento se debe hacer después de la primera half horas para evitar grandes diferencias entre repeticiones. Mal posicionados o individuos caídos-off deben desecharse.
Además de proporcionar un protocolo para la grabación de EPG, este artículo recapitula las características del circuito de EPG que son relevantes para su aplicación como un método en planta de electrofisiología intracelular (Figura 1). La característica principal de EPG-electrodos es que son electrodos altamente específicos de células que permiten para las grabaciones intracelulares exactas de las PE. En el amplificador regular de EPG, la resistencia de entrada es relativamente baja, 1 GΩ (10 9 Ω). En la práctica, esto significa que los cambios de resistencia durante la grabación afectan el potencial medido. Esto no es un problema en la electrofisiología intracelular convencional con electrodos de vidrio, que normalmente utilizan amplificadores de resistencia de entrada superiores. Uno puede corregir los cambios en la resistencia que surgen de la membrana plasmática y de otras fuentes utilizando calibrpulsos ación, como en Salvador-Recatalá et al. 1. Otra opción es aumentar la resistencia de entrada del EPG preamplificador regular, de 1 GΩ a 1,5 TΩ (1,5 x 10 12 Ω) o incluso a 1 PΩ (10 15 Ω, dependiendo de OpAmp del pre-amp), que corresponde a la resistencia de entrada en los amplificadores regulares para registro intracelular. El amplificador de EPG con una mayor resistencia de entrada se denomina aquí como el sistema de "modo de fem EPG". En este amplificador, un interruptor desactiva el amplificador EPG en modo normal (véase la Figura 1). En el modo fem, el método EPG-electrodo registra los potenciales de células vegetales como con precisión como los amplificadores regulares utilizadas en electrofisiología intracelular. La única alteración que queda en la EPG en el modo fem surge de los componentes fem del pulgón durante la alimentación SE, pero estos son bastante bajos y no compromete la exactitud de las mediciones. Si el investigador desea registro simultáneo del(por ejemplo, los cambios en la salivación y la ingestión) y la información del potencial de membrana SE, entonces se recomienda el modo normal de la EPG reacción del pulgón a factores de estrés ambiental. En ese caso, la aplicación del pulso de calibrado proporciona valores aceptables, aproximadas del potencial de membrana.
La falta de métodos adecuados para la adquisición de las respuestas eléctricas de la vasculatura floema in vivo limita actualmente el tipo y número de preguntas relacionadas con las respuestas al estrés ambiental de las plantas. Los investigadores han implantado electrodos de vidrio 3 y electrodos de vidrio estilete 4 para la adquisición de registros intracelulares en las SE en la vena media. En contraste con estos dos tipos de electrodos, EPG-electrodos pueden colocarse en prácticamente cualquier parte aérea de la planta (e incluso en las raíces, el uso de los áfidos de la raíz). Por lo tanto, las EPG-electrodos facilitarán los estudios más completos en la electrofisiología de la planta. Anotsu ventaja de EPG-electrodos más de electrodos convencionales es que el primero permite por períodos extendidos de grabación, lo que hace posible la investigación de las respuestas de las PE individuales a diversos estímulos. Esta es una característica biofísica importante, y puede proporcionar información interesante sobre cómo las PE integrar información de diferentes estímulos ambientales. De hecho, los datos que se muestran aquí demuestra que las PE responden a diversos estímulos perjudiciales (Figura 4), lo que justifica una mayor investigación en esta importante característica biofísica de la SE.
El número de estudios electrofisiológicos de las PE es demasiado pequeño para hacer comparaciones entre los datos adquiridos con EPG-electrodos y los datos obtenidos con electrodos de vidrio tradicionales. De hecho, hasta donde sabemos no hay datos en la literatura sobre las señales eléctricas estímulos inducidos en las PE de Arabidopsis, adquiridos con un método tradicional, sea electrodos de vidrio o electrodos de vidrio de estilete. Usando electrodos de vidrio, Rodas y3 colaboradores encontraron que el calor induce acción potencial como picos en los PE de plantas de tomate. La despolarización rápida que mostraron tuvo una magnitud de alrededor de 70 mV, que se producen en la parte superior de una pequeña despolarización, más lento. Esto es consistente con nuestras señales eléctricas adquiridas por EPG-electrodos 1, aunque se debe tener cuidado cuando se comparan las señales eléctricas a partir de dos especies de plantas diferentes, y inducida por diferentes tipos de estímulos.
El electrodo EPG es una herramienta versátil y elegante para el estudio de las respuestas electrofisiológicas de las células del floema a diversos tipos de estímulos.
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Acknowledgments
VSR fue apoyado por una subvención Marie Curie del IIF (HERIDA EN LA TIERRA, acrónimo de: Herida inducida por señales eléctricas en Arabidopsis thaliana).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brass connector pins | EPG Systems/hardw.shop | Φ 1.2 mm | |
| Thin copper wire | EPG Systems/hardw.shop | approx. Φ 0.2 mm | |
| Thin gold wire | EPG Systems | Φ 18 µm | |
| Soldering fluid | hardware shop | matching the soldering wire | |
| Resin-cored soldering wire | hardware shop | ||
| Styrofoam | any | ||
| Water-based silver glue | EPG Systems | recipe in: www.epgsystems.eu | |
| Paper wipes | Kimberly-Clark | 5511 | |
| Soldering bolt | any | ||
| Stereomicroscope | Hund Wetzlar | minimum magnification is 10X | |
| Small scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10050-00 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Vortex | A. Hartenstein | L46 | |
| Watercolor brushes | any | Number 1 or 2 | |
| Air suction device | see description in: www.epgsystems.eu | ||
| Insect pins | any | No. 1 or 2 | |
| Solid table | |||
| Faraday cage | Hand made | ||
| Computer | Fujitsu Siemens | ||
| Data acquisition software | EPG Systems | Stylet+d | |
| Giga-4 (-8) Complete System | EPG Systems | ||
| includes the following: | |||
| Main control box with USB output | Di155/Di710 | 12/14 bit, rate 100 Hz (softw. fixed) | |
| EPG probes 4 (8) | 50x DC pre-amplifier | ||
| Swivel clamps on rod | |||
| DC power adaptor | bipolar, 230/115 VAC to -/+8 VDC | ||
| Plant electrodes and cables | |||
| Additional test and ground cables |
References
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