Abstract
Proprietà elettrofisiologiche di cellule sono spesso studiati in vitro, dopo averli dissociandosi dal loro ambiente naturale. Tuttavia, lo studio di trasmissione elettrica tra le cellule lontane in un organismo è necessario in vivo, registrazioni prive di artefatti di cellule incorporate all'interno del loro ambiente nativo. La trasmissione dei segnali elettrici da ferita a zone illesi in un impianto ha suscitato da tempo l'interesse di botanici. Il floema, la parte viva del sistema vascolare pianta che si sviluppa in tutta la pianta, è stata postulata come un tessuto importante nella trasmissione elettrica negli impianti. La mancanza di adeguati metodi elettrofisiologici pone molte sfide per lo studio delle proprietà elettriche delle cellule floema in vivo. Qui vi presentiamo un nuovo approccio per elettrofisiologia intracellulare di elementi setaccio (SE) che utilizza afidi che vivono, o altri insetti hemipteran floema-alimentazione, integrata nella gra penetrazione elettricoph (EPG) del circuito. La versatilità, la robustezza e la precisione di questo metodo ha permesso di registrare e studiare in dettaglio i segnali elettrici ferita indotta a SE di vene centrali del pianta modello Arabidopsis thaliana 1. Qui mostriamo che EPG-elettrodi possono essere facilmente implementati per intracellulari registrazioni elettrofisiologiche di SE in vene marginali, nonché per studiare la capacità delle SE di rispondere con segnali elettrici a diversi stimoli esterni. L'approccio EPG applicata alla elettrofisiologia intracellulare di SE può essere implementata per una grande varietà di specie vegetali, in un gran numero di combinazioni pianta / insetti, e per molti ricerca mira.
Introduction
La capacità di produrre segnali elettrici a lunga distanza è una caratteristica vantaggiosa di organismi pluricellulari che permette risposte efficaci agli stimoli esterni. Questa caratteristica si è evoluto in maniera indipendente in piante e animali, e rappresenta quindi un caso di evoluzione convergente. Dato che i segnali elettrici sono accoppiati con funzioni importanti in animali come trasmissione neurale e la contrazione muscolare, la base molecolare, il meccanismo di trasmissione, e la funzione di segnali elettrici di stimolo indotto negli animali sono oggetto di ricerca intensiva. Al contrario, lo stimolo indotto la segnalazione elettrica nelle centrali ha ricevuto scarsa attenzione della ricerca. Anche se le piante non hanno i nervi o muscoli, ci sembra essere prove sufficienti per supporre che i segnali elettrici di stimolo indotto nelle piante svolgono un ruolo chiave nelle loro risposte ai fattori ambientali.
Il floema, la componente vivente del sistema vascolare delle piante, è stata postulata come uno dei principali substrate per la trasmissione di segnali elettrici di stimolo indotto, da stimolato / danneggiato ad aree non stimolato / integri 2. Le principali cellule del floema sono gli elementi setaccio (Ses),, cellule allungate relativamente semplici. Le estremità delle SE sono collegati ad altre SE, formando una continua, a bassa resistenza, sistema del tubo setaccio che si sviluppa per tutta la pianta. Vi sono, tuttavia, molto pochi studi sulle proprietà elettriche di queste cellule altamente specializzate. In questi studi precedenti, i ricercatori accessibili SE o con vetro micro-elettrodi 3 mandrini o con elettrodi di vetro che sono stati accoppiati a piantare-inseriti di afidi, dopo stylectomy (taglio) 4. Microelettrodi di vetro sono realizzati da capillari di vetro che sono tirati ad una estremità con il calore in una punta sottile inferiore a 1 micron di diametro, e successivamente riempito con una soluzione di KCl. A Ag / AgCl o platino filo, inserito nel elettrodo di vetro KCl-riempita viene quindi collegato all'ingresso dell'amplificatore, e un referenteelettrodo viene inserito nella vasca che circonda la cella di interesse, completando il circuito. Questa configurazione registra la differenza di potenziale tra l'elettrodo extracellulare referente e l'elettrodo di misura intracellulare, cioè, il potenziale di membrana della cellula 5. Con questo metodo, Umrath fatto la prima registrazione intracellulare da una cellula vegetale, utilizzando le alghe Nitella 6,7. Nitella è relativamente semplice organismo a grandi cellule, e quindi suscettibili di esperimenti elettrofisiologia intracellulari. Al contrario, l'inserimento degli elettrodi di vetro intracellulari nelle piccole cellule, piante terrestri tridimensionali multicellulari è tecnicamente impegnativo, richiede un ricercatore altamente qualificato, nonché visualizzazione sofisticato, micromanipolazione e apparecchiature antivibrazione. Sebbene elettrodi di vetro sono adatti a registrare da cellule superficiali nelle piante, come le cellule epidermiche radice 8, recordin intracellularegs dalle cellule profondamente radicate nel tessuto della pianta, come la SE, causa danno risposte indotte molto probabilmente, confondendo i risultati. Nel 1989, Fromm e Eschrich segnalato l'uso di un metodo alternativo, chiamato il 'metodo di afide', in cui gli elettrodi di vetro sono accoppiati a stiletti afidi dopo stylectomy 4. Il metodo afide è minimamente invasiva, perché mandrini flessibili non causano tessuti o cellule danni elettrodi in vetro fanno. Mandrini afidi sono grande invenzione della natura per la penetrazione pianta, e gli afidi sono molto più abili di esseri umani nella ricerca di SE. Sfortunatamente, questo metodo afide è anche molto esigente in termini di competenze tecniche e attrezzature. Inoltre, il successo di ogni esperimento che implementa questa tecnica dipende interamente l'afide essere in modalità di alimentazione - con il mandrino stabilmente inserita in una SE, al momento della stylectomy. Pensare in retrospettiva, si può vedere che le probabilità di successo di questa tecnica avrebbe potuto essere improved aggiungendo al setup sperimentale uno strumento che consente di identificare se il mandrino è afidi in SE nell'applicazione stylectomy.
Nel 1964, McLean e Kinsey descritto un 'sistema di monitoraggio elettronico' per lo studio del comportamento alimentare di afidi in tempo reale 9,10. In questo sistema, l'afide e l'impianto mandrino-penetrato sono stati integrati in un circuito elettrico. Successivamente, nel 1978, Tjallingii ideato una versione modificata del sistema, denominato sistema 'Electrical Penetrazione Graph' (EPG) 11,12. Considerando che il sistema di controllo elettronico originale era sensibile alle potenzialità resistenza origine solo, con il sistema EPG, la forza elettromotrice (fem) originato potenziali, cioè, in un impianto o l'insetto, potrebbero essere registrati in aggiunta alle potenzialità derivanti dal resistenza (R) nella insetto. Questo rappresenta un miglioramento importante, perché sia il segnale componenti, EMF e R,fornire biologico informazioni rilevanti sugli eventi durante la penetrazione pianta dagli afidi. Ciò che rende la EPG preamplificatore sensibile alle componenti R è relativamente bassa resistenza di ingresso 1 GΩ, che è vicino alla media della resistenza delle piante / afidi. Una piccola tensione di offset (Figura 1, V) di circa +100 mV viene applicato alla pianta, che viene poi suddivisa su piante e insetti da un lato, e la resistenza di ingresso sull'altro. Le tensioni e le loro variazioni sono misurate in un punto (Figura 1A, B) tra l'insetto e la resistenza di ingresso. Pertanto, le componenti R rappresentano modulazioni resistenza vegetale afide della tensione di offset, mentre i EMF-componenti sono una certa frazione di potenziali di piante al punta del mandrino e potenzialità causati nella insetto. I potenziali vegetali - più importanti qui - sono potenziali principalmente membrane delle cellule vegetali forati dai stiletti afidi. I potenziali insetti sembrano essere principalmentepotenziale di streaming causate da movimenti fluidi nei due canali stiletto, cioè, il cibo ei canali salivari; nessun potenziale nervose o muscolari interne sono registrate nel EPG. In pratica, le funzioni punta del mandrino come una punta dell'elettrodo. Tutte le cellule vegetali sono caricati negativamente all'interno rispetto all'esterno positiva della cellula. La corrente elettrica (cioè, il movimento di ioni in soluzione acquosa) scorre dall'interno verso l'esterno e vice versa è molto limitato a causa della elevata resistenza della membrana cellulare. Normalmente il potenziale di riposo viene mantenuta costante. Tuttavia, quando gli ioni negativi muovono fuori o ioni positivi si muovono attraverso la membrana cellulare, il potenziale di membrana è ridotto, cioè, 'depolarizza'. Depolarizzazione si verifica in caso di eccitazione delle cellule. Ioni quindi spostare avanti o indietro quando specifici canali ionici nella membrana vengono aperti o quando la membrana è danneggiata e ioni perdite dentro e fuori. Tutte le cellule hanno canali ionici e pompe in tegli membrana plasmatica che portano il potenziale di membrana al suo livello di riposo ripristinando la concentrazione originale di vari ioni all'interno della cellula. Il potenziale di riposo e le sue variazioni sono componenti EMF, e di conseguenza, la tecnica EPG è adatto a misurare loro.
Figura 1. EPG-elettrodi. L'EPG-elettrodo è un afide vivente integrato nel circuito elettrico Penetrazione Graph (EPG), il cui mandrino viene inserito in un elemento di setaccio (SE) in modalità di alimentazione stabile. Se il mandrino SE-infilzata è a riposo (pannello A), la tensione nel circuito, registrato da EPG, è stabile e al potenziale livello di riposo (pannello C, Rest). Se la SE è entusiasta, i suoi depolarizza membrana (pannello B), che viene visualizzato nella EPG come un graduale aumento della tensione (pannello C, Depolarizzazione). Come l'equilibrio ionico nella SE torna a riposare, cioè, repolarizes, la tensione registrata da EPG diminuisce gradualmente al potenziale livello di riposo (Panel C, ripolarizzazione). Nel pannello C, "A" e "B" si riferiscono agli scenari illustrati in pannelli A e B, rispettivamente. V = regolabile sorgente di tensione di offset. Ri = resistenza di ingresso. In parallelo alla resistenza esterna 1 GΩ, l'amplificatore ha un interno (nel OpAmp) alto 1,5 resistore TΩ (pannelli A e B, in grigio). Con il controllo remoto dello switch EPG pre-amp può essere cambiata da normale a EMF-mode, che permette di ottenere valori di tensione ad alta precisione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Nella sezione successiva, mettiamo a disposizione il lettore con un protocollo di base per l'esecuzione di esperimenti EPG che sia valido per entrambi gli studi insetti focalizzati e vegetali a fuoco.
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Protocol
1. afide allevamento
Nota: La scelta delle specie vegetali e afidi per le registrazioni EPG dipende dalla finalità di ricerca. Per gli studi sulla Arabidopsis thaliana, il brassicae afide Brevicoryne è appropriato.
- Posteriore B. afidi brassicae in una serra su Brassica oleracea. Mantenere le piante utilizzate per afide allevamento in gabbie, per evitare di contaminare altre piante. Mantenere le piante-afidi allevamento e impianti sperimentali (nel nostro caso B. oleracea e A. thaliana) in stanze separate, al fine di evitare la contaminazione di impianti sperimentali con gli afidi.
- Trasferimento afidi di piante fresche su ogni 2 settimane, prima di causare danni significativi pianta, o raggiungere la sovrappopolazione. Trasferire 10-20 afidi adulti ad un impianto di allevamento fresca per iniziare una nuova colonia.
- Monitorare allevamento piante regolarmente per contaminazione da specie indesiderate di afidi, altri erbivori insetti parassitoidi, afidi e fungi che possa influenzare la salute della colonia di afidi.
- Raccogliere adulti, afidi senza ali fino a una settimana dopo la loro muta finale per la registrazione EPG.
- Dopo gli esperimenti, restituire le piante sperimentali che non sono stati utilizzati per la camera di crescita, come spesso hanno alcune progenie che è stata prodotta durante la registrazione, che potrebbe contaminare inavvertitamente altre piante.
2. Insect cablaggio per la registrazione EPG
- Per elettrodi di insetti, ottenere i pin del connettore ottone (chiodi, Ø 1,2 mm), sottile filo di rame (Ø 0,2 mm), di filo d'oro molto sottile (Ø circa 20 micron), a base di acqua d'argento colla, un semplice piccolo bullone di saldatura con fluido saldatura e filo di saldatura in resina animato, stereomicroscopio con ingrandimento 10X, piccole forbici o bisturi, due pinza sottile, e un foglio di polistirolo o scatola. Nota: un vortex potrebbe essere utile. Nota: Il protocollo passo-passo per rendere elettrodi è indicato nella figura 2.
- Per afidemanipolazione e l'applicazione della colla, ottengono: un piccolo e morbido pennello acquerello cammello (formato 2 o più piccolo) e perni di insetti, come quelli usati per le collezioni di insetti, anche se un ago da cucito multa o uno stuzzicadenti può funzionare così. Fase 4 mostra come avviare la registrazione EPG.
- Passo 1.
Nota: I passi 1 e 2 qui di seguito mostrano come preparare elettrodi insetti meno la afide. Passo 3 illustra come collegare un afide all'elettrodo. Vacuum fissaggio del afidi è raccomandato durante il cablaggio, ma non sempre necessaria per specie movimento lento (ad esempio, B. brassicae).- Accendere il bullone di saldatura e sciogliere qualche filo di saldatura alla sua punta (Figura 2A). Bagnare la testa del perno connettore di ottone con un fluido di saldatura (Figura 2B) ed immergerlo nel metallo di saldatura fuso (Figura 2C).
- Applicare una guaina di metallo fuso di saldatura su una estremità di un lungo pezzo di filo di rame sottile 1-2 cm (Figura2D). Quindi portare il filo di perno e di rame insieme contro il bullone caldo (Figura 2E) e spostarli insieme via raffreddare e solidificare (Figura 2F).
- Passo 2.
- Agitare bene (o vortex), il flacone con colla d'argento per alcuni minuti fino a visualizzare una emulsione liscia. Cut (forbici o bisturi) un paio di pezzi di filo d'oro (di circa 1,5 cm di lunghezza) sul piatto oggetto della stereomicroscopio (Figura 2G).
- Dai pin ottone con filo di rame saldato (realizzato in sezione 2.3) e immergere l'estremità libera del filo di rame nel piccolo serbatoio di collante argento che sono riuniti in all'interno del coperchio della fiala dopo l'apertura (Figura 2H). Nota: E 'necessaria solo una piccola goccia.
- Spostare fine colla-tuffato del filo di rame al pezzo di filo d'oro, mentre si solleva un'estremità per evitare sbavature la colla sulla piastra oggetto stereomicroscopio. Provate a sovrapporsi copper e filo d'oro per pochi mm (figura 2I), distribuire la colla lungo la sovrapposizione dei due fili.
- Attendere che la colla si è asciugata abbastanza per tenere i fili uniti. Verificare il contatto colla dopo l'essiccazione e aggiungere un po 'di colla fresca con un piccolo spillo o un altro pezzo di filo di rame se alcune parti dei fili uniti mostrano parti senza colla.
- Dopo l'elettrodo insetto è pronto, conservarlo, ad esempio inserito in un pezzo di polistirolo.
Nota: La lunghezza del filo d'oro determinerà la libertà di movimento del afidi: se è troppo breve (meno di 5 mm), l'afide può sentirsi vincolata e non si comporterà normalmente; se è troppo lungo (> 2 cm), l'afide si muove liberamente. Afidi tendono a spostarsi verso il lato adaxial delle foglie, se lasciati. Se il filo d'oro tocca la foglia, il segnale sarà cortocircuitato.
- Fase 3.
- L'afide può essere tenuto in posizione mediante aspirazione luce, utilizzando un vuoto; in questo caso, installare tegli dispositivo di aspirazione con lo stereomicroscopio. Posizionare la bocca di aspirazione al centro del campo.
- Agitare bene il flacone con colla d'argento per alcuni minuti (o vortex) fino a quando si forma un'emulsione liscia. Raccogliere un afide con il pennellino.
- Accendere il dispositivo di aspirazione e montare l'afide sull'apertura di aspirazione (figura 2J), con la parte posteriore del ventre rivolto allo sperimentatore. Con il pennello fine, rimuovere ogni residuo di cera con l'addome (abbondante in afidi cavolo).
- Aprire il flacone colla e bagnare un perno con una piccola goccia di colla argento (Figura 2K). Applicare la goccia di colla argento sul retro dell'addome del afidi (Figura 2L-M). Sia questo droplet completamente asciutta per parecchi minuti, agitare vigorosamente il flaconcino colla di nuovo e aggiungere una seconda goccia di colla d'argento in cima al primo. Nota: Mentre la colla argento è un conduttore elettrico, non provoca significativedanni alla cuticola dell'insetto.
- Dopo aver chiuso la fiala colla, inserire l'estremità libera del filo oro nella gocciolina bagnato e mantenere il filo ancora consentendo la colla si asciughi completamente (Figura 2N). Evitare sbavature colla sulla gambe o antenne e scartare un afide se questo è successo.
- Spegnere il dispositivo di fissaggio di aspirazione e sollevare con attenzione l'insetto (Figura 2O). Se necessario, utilizzare un pennello fine di contribuire alla revoca del afide dal dispositivo di aspirazione.
Nota: Cablaggio B. brassicae non richiede un vuoto, in quanto possono essere collegati su un pezzo di un tessuto precisione da laboratorio, la superficie ruvida che fornisce l'afide con abbastanza impugnatura in modo che non venga sollevato dopo l'applicazione di una goccia di colla a freddo al suo addome. Dopo asciugatura della colla si può sollevare l'afide dal tessuto con l'aiuto di un pennello fine. - Inserire il perno in ottone con l'insetto cablata in polistirolo e, se necessario, continuarecablaggio tutti gli altri insetti da utilizzare per la sessione di registrazione EPG.
Nota: Questi protocolli per il cablaggio afidi funzionano bene per noi. L'utente può trovare la sua / suo proprio metodo di cablaggio afidi.
- Passo 4.
- Mettere piante nella gabbia di Faraday (Figura 2P) su un supporto non conduttivo: utilizzare capsule Petri o una lastra di vetro o di plastica.
- Inserire un elettrodo pianta nel terreno di ogni piatto. Inserire il perno di ottone dell'insetto metallico nel connettore di ingresso della EPG preamplificatore (Figura 2Q). Nota: l'elettrodo terreno non corrisponde all'elettrodo terra utilizzato in altre tecniche elettrofisiologiche. Ha la tensione di offset necessaria per regolare e compensare le tensioni di polarizzazione dell'elettrodo.
- Nell'interfaccia del software di acquisizione mandrino +, con frequenza di campionamento fissa di 100 Hz, immettere un nome file, specificare il tempo di registrazione, e scrivere il testo di specificare i dettagli dell'esperimento (trattamento, impianti / inse specie ct, ecc) in commento linee 2 e 3.
- Abbassare gli insetti su una zona di atterraggio adeguata dell'impianto e avviare la sessione di registrazione facendo clic sul pulsante Start del software di acquisizione di interfaccia (Stylet +).
Nota 1: un massimo di 8 canali può essere utilizzata contemporaneamente in un EPG istituito. Un EPG elettrodi o più EPG-elettrodi per ogni impianto può essere utilizzato.
Nota 2: quando il focus dello studio è il comportamento afide, avviare la registrazione prima di accedere pianta degli afidi per evitare di perdere le prime attività di penetrazione pianta. - Per studiare le risposte elettrofisiologiche delle SE a stimoli, attendere almeno 10 minuti dopo l'afide è entrato in fase floema, al fine di garantire che il afidi è in una fase di sostenuta ingestione floema, e che la linea di base del segnale è stabile. Solo allora, avviare qualsiasi esperimento di stimolazione della pianta.
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Figura 2. Fare EPG-elettrodi con afidi o altri insetti hemipteran per grafico elettrica penetrazione (EPG) registrazioni. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Pannelli AI, passaggi necessari per preparare EPG-elettrodi meno la afide. Innanzitutto, sciogliere un pezzo di metallo di saldatura sulla punta di un bullone di saldatura (A). Poi, immergere la testa del perno di ottone in una goccia di liquido saldatura (B), e in contatto con il metallo fuso sulla punta del bullone di saldatura (C). Immediatamente dopo questo passo, contattare l'estremità di un filo di rame alla punta del bullone di saldatura, per l'incollaggio alla testa del perno in ottone (EF). Con un bisturi o una lama, tagliare un pezzo di filo d'oro (G). Tuffol'estremità libera del filo di rame (unito all'altra estremità al perno ottone) sulla colla d'argento (H), e rapidamente uniscono il filo d'oro ad esso (I) prima l'argento asciuga. Il filo d'oro è un ottimo conduttore, e può essere polarizzata. In realtà, nella maggior parte dei casi, la polarizzazione è troppo piccolo per essere rilevato, e in tal caso, può essere compensata con l'offset di tensione (V).
Pannelli JO, passaggi necessari per collegare un afide (o altro hemipteran insetto) all'elettrodo. Innanzitutto, sollevare accuratamente un afide con un pennello acquarello fine e posizionarlo sulla apertura del dispositivo di aspirazione di vuoto (J). Accendere la pompa di aspirazione e coprire il foro valvola dell'aria con un pezzo di carta per applicare il vuoto. Immergere la punta del perno dell'insetto nella colla argento (K), e mettere una piccola goccia di colla sulla parte superiore dell'addome del afidi, allo stereomicroscopio (LM). All'interno delprossimi ~ 20 sec, prima della gocciolina colla argento si asciuga afide, inserire l'estremità del filo d'oro dell'elettrodo insetto nella gocciolina bagnato di colla d'argento, e tenerlo in posizione per 1-3 minuti, fino a quando la colla argento ha completamente essiccata all'aria (N). A questo punto, disattivare aspirazione rimuovendo il pezzo di carta che copre il foro di sfiato del dispositivo di aspirazione e rimuovere accuratamente l'afide, dal dispositivo di aspirazione: sollevamento afide dopo il cablaggio spesso richiede qualche aiuto da un pennellino (O).
Pannello P mostra una panoramica di tutta la EPG allestito all'interno della gabbia di Faraday, e Panel Q mostra una panoramica della combinazione impianto-afide per EPG. Vedere sezione 2 sopra per una spiegazione più dettagliata di questo processo.
Piccole lettere sono etichette che alludono alle voci che bisogna fare EPG-elettrodi: un: Bullone di saldatura; b: fuso in metallo di saldatura;c: il fluido di saldatura; d: connettore d'ottone perno (unghie); e: filo di rame; f: filo d'oro Ø 18μm; g: dispositivo di aspirazione; h: afide; i: colla d'argento a base d'acqua; j: Gabbia di Faraday; k: impianto dell'elettrodo; l: connettore di ingresso (BNC) dell'EPG preamplificatore.
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Representative Results
In uno studio precedente, abbiamo implementato la tecnica EPG-elettrodo con lo scopo di caratterizzare i segnali elettrici prodotti in SE della midvein durante l'attacco caterpillar 1. Il midvein è un sito di inserzione preferito per elettrodi in vetro convenzionale, così come per gli elettrodi di vetro-stiletto, perché è SE-denso, e relativamente robusto, quindi suscettibili di fissazione necessaria per attuare queste tecniche. Qui, abbiamo sfruttato la versatilità dell'elettrodo EPG con lo scopo di raccogliere informazioni elettrofisiologiche da più difficile accedere SE, in particolare quelli nelle vene marginali di foglie. Figura 3 mostra un tipico EPG registrazione da SE in una vena marginale di una. pianta thaliana, che contiene un segnale elettrico indotto da ferita distale. Diversamente da SE in grandi vene, SE nelle vene marginali risposto a danni a distanza con un singolo, lento onda di depolarizzazione che potrebbero corrispondere allalento onda di depolarizzazione a SE centrali. In media, questo depolarizzazione lenta distanza indotta nelle SE del margine foglia aveva una durata media di 61 ± 27 sec, e l'ampiezza media di 37 ± 2 mV (n = 3, media ± SEM). Questi dati, facilmente ottenibili con EPG-elettrodi, suggeriscono che i segnali elettrici ferite indotte foglie illesi si diffondono dalla principale fascio vascolare al floema nelle vene minori.
Qui abbiamo anche sfruttato la robustezza di elettrodi EPG, di verificare se una SE in grado di rispondere a vari stimoli dannosi, consegnati entro un intervallo di tempo dell'ordine di minuti. Quando due fogli sono stati tagliati con le forbici al bivio picciolo-lamina, una EPG-elettrodo posto in una foglia intatto rilevato risposte simili nella stessa SE a queste ferite (Figura 4A). In un altro esperimento, un bruco è stato utilizzato come agente ferimento. Il bruco prima tagliare un foglio non vicino, e poi, dopo pochi minuti, si muoveva toa foglia vicino di casa e tagliare pure. Considerando che la prima ferita nella foglia non prossimo indotto solo una depolarizzazione transitoria lenta, la seconda ferita nella foglia vicina indotto il segnale elettrico completo che contiene un lento e una depolarizzazione veloce, coerentemente con precedenti esperimenti 1. Questi dati mostrano che un elemento forato può rilevare più eventi ferimento inflitte ad altre foglie, trasportato entro minuti una dall'altra.
Figura 3. Registrazioni intracellulari di segnali elettrici ferita indotta da elementi setaccio (SES) nelle vene marginali con EPG-elettrodi. Electrical Penetrazione Graph (EPG) segmento della fase floema-alimentare del brassicae afide Brevicoryne segnale. L'afide EPG-registrato stava alimentando da una SE situato in una vena marginale della foglia # 8 (Arabidopsis thaliana, Wild type), mostrato nel cartone animato a sinistra. Il segnale EPG mostra una lenta onda di depolarizzazione nel marginale SE poco dopo il taglio di un foglio vicino di casa prossimale (foglia # 3). I, piccoli, verso il basso componenti dei segnali veloci ritmiche rappresentano le potenzialità di streaming derivanti dalla ascesa ritmico della linfa lungo il canale alimentare del mandrino durante la fase di assunzione (forma d'onda E2). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Più risposte elettriche a ferendo stimoli elementi setaccio (SES) acquisite con EPG-elettrodi La robustezza del afide-impianto (Brevicoryne brassicae - Arabidopsis thaliana). Interazione e la stabilità delle stiletti afide SE-inseriti sono importanti proprietà di EPG-electrodes che consentono l'acquisizione di lunghe registrazioni EPG (ore). Qui abbiamo approfittato di queste proprietà di indagare se una SE può rispondere a due stimoli ferimento remoti. Un pannello mostra le risposte di un SE a due eventi ferimento artificiali (foglia di taglio con forbici) consecutivamente inflitte due prossimo diverso lascia. C'è un intervallo di circa 17 min tra i due stimoli. Pannello B mostra le risposte di una SE a due eventi ferimento naturali consecutivi. A 4 ° instar bruco della farfalla cavolo (Pieris brassicae) è stato utilizzato in questo esperimento. Il bruco prima tagliare un foglio non prossimo (in relazione con la foglia registrata EPG), inducendo un lento, depolarizzazione transitoria. Poi, circa 7 minuti più tardi, il bruco tagliato un'altra foglia vicino di casa, che ha innescato un doppio segnale di depolarizzazione (vale a dire, che contiene una lenta e una veloce depolarizzazioni transitori) nella SE registrata afide-. Le frecce indicano il tempo in cui le feritesono state inflitte. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per rendere elettrico Penetrazione Graph (EPG) registrazioni. La tecnica EPG è ben definito, con 100-200 utenti attivi in tutto il mondo, ed è stato implementato per molti studi su diversi argomenti, ad esempio: a) la resistenza pianta ospite di afidi e altri insetti stiletto-cuscinetto 13; b) impianti e virus patogeni meccanismi di trasmissione 14; c) Modalità di insetticida di azione, (tossicità e comportamento cambia) 15; d) EPG sono stati anche utili a dimostrare che le lotte di afidi sono vantaggiose per il vincitore in quanto aumenta la sua efficienza di alimentazione 16.
Imparare a collegare gli insetti per la registrazione EPG non è difficile, ma richiede pazienza e l'esperienza pratica da padroneggiare. Da rendendo elettrodi alla insetto cablato finale, si raccomanda un periodo di pratica di una o due settimane. Durante questo tempo, il ricercatore familiarizzarsi / se stesso con la manipolazione del presceltospecie di insetti e di procedere attraverso tutti i passi con successo. Passaggi critici sono: a saldare correttamente, accuratamente agitando il flaconcino colla d'argento prima di prendere una goccia di colla della giusta misura - né troppo piccolo né troppo grande - garantire il corretto collegamento elettrico e meccanico, e mettendo il filo d'oro all'interno della goccia d'argento sull'addome dell'insetto in un modo che non si limitare i movimenti di insetti. Non riuscendo a eseguire questa procedura correttamente si provocherebbe un calo delle connessioni elettriche, che si tradurrà in dati di scarsa qualità o inaccettabili. All'atto della insetti accesso cablato all'impianto, è importante per loro controllare visivamente durante la prima mezz'ora della registrazione. Durante questo periodo, gli afidi sono sempre abituati al filo, e possono allontanarsi dal luogo di registrazione desiderato, o scendere la pianta. Pertanto, si può avere bisogno di riposizionare gli afidi in questo periodo. In caso di obiettivi comportamentali, senza riposizionamento dovrebbe essere fatto dopo la prima half ora per evitare che le grandi differenze tra le repliche. Scarsamente posizionati o individui cadute-off devono essere eliminati.
Oltre a fornire un protocollo per la registrazione EPG, questo articolo riassume le caratteristiche del circuito EPG rilevanti per la sua applicazione come un metodo in pianta elettrofisiologia intracellulare (Figura 1). La caratteristica principale di EPG-elettrodi è che sono gli elettrodi altamente specifici delle cellule che consentono registrazioni intracellulari precise da SE. Nel normale amplificatore EPG, la resistenza di ingresso è relativamente basso, 1 GΩ (10 9 Ω). In pratica, ciò significa che le variazioni della resistenza durante la registrazione influenzano il potenziale misurato. Questo non è un problema in convenzionale elettrofisiologia intracellulare con elettrodi di vetro, che utilizzano in genere più alti amplificatori di resistenza di ingresso. Si può correggere le variazioni di resistenza derivanti dalla membrana plasmatica e da altre fonti, utilizzando calibrlegumi ation, come in Salvador-Recatalà et al. 1. Un'altra opzione è quella di aumentare la resistenza di ingresso regolare del preamplificatore EPG, da 1 GΩ a 1,5 TΩ (1,5 x 10 12 Ω) o anche 1 PΩ (10 15 Ω, a seconda del pre-amplificatore operazionale), che corrisponde alla resistenza di ingresso in amplificatori regolari per la registrazione intracellulare. L'amplificatore EPG con una maggiore resistenza di ingresso è indicato qui come il sistema "fem modalità EPG". In questo amplificatore, un interruttore disabilita l'amplificatore EPG normale modalità (vedi Figura 1). In fem-mode, il metodo EPG elettrodi registra le potenzialità delle cellule vegetali come accuratamente come amplificatori regolari utilizzate in elettrofisiologia intracellulare. L'unico disturbo lasciato nel EPG in fem-mode deriva dalle componenti EMF del afidi durante l'allattamento SE, ma questi sono piuttosto bassa e non compromettere la precisione delle misure. Se il ricercatore desidera registrare simultaneamente lareazione del afidi a fattori di stress ambientali (per esempio, cambiamenti nella salivazione e ingestione) e le informazioni del potenziale di membrana SE, allora viene consigliato il normale modalità della EPG. In tal caso, applicando l'impulso calibrato fornisce accettabili, approssimativi del potenziale di membrana.
La mancanza di metodi appropriati per l'acquisizione di risposte elettriche della vascolatura floema in vivo limita attualmente il tipo e il numero di domande relative a risposte allo stress ambientali di piante. I ricercatori hanno implementato elettrodi in vetro 3 e elettrodi vetro-stiletto 4 per l'acquisizione delle registrazioni intracellulari a Ses nel midvein. In contrasto con questi due tipi di elettrodi, EPG-elettrodi possono essere posizionati praticamente su qualsiasi parte aerea della pianta (e anche di radici, utilizzando afidi radice). Pertanto, i EPG-elettrodi agevoleranno studi più completi in impianti elettrofisiologia. Anotsuo vantaggio di EPG elettrodi oltre elettrodi convenzionali è che il primo consentono di periodi di registrazione estesa, che rende possibile indagare le risposte di singoli SE a vari stimoli. Si tratta di una importante caratteristica biofisico, e può fornire informazioni interessanti su come SE integrare le informazioni provenienti da diversi stimoli ambientali. Infatti, i dati riportati qui dimostra che SE rispondono a vari stimoli dannosi (figura 4), che giustifica ulteriori ricerche su questa caratteristica biofisica importante di SE.
Il numero di studi elettrofisiologici delle SE è troppo piccolo per fare confronti tra i dati acquisiti con EPG-elettrodi e i dati ottenuti con elettrodi di vetro tradizionali. In realtà, a nostra conoscenza non ci sono dati in letteratura su segnali elettrici di stimolo indotto a Ses di Arabidopsis, acquisiti con un metodo tradizionale, sia elettrodi in vetro o elettrodi vetro-stylet. Utilizzando elettrodi di vetro, Rodi ecollaboratori 3 hanno scoperto che il calore induce azione picchi potenziale come nei SE di piante di pomodoro. La depolarizzazione veloce che hanno mostrato aveva una grandezza di circa 70 mV, che si verificano in cima ad una piccola, la depolarizzazione lenta. Ciò è coerente con i nostri segnali elettrici acquisiti dai EPG elettrodi 1, anche se occorre prestare attenzione quando si confrontano i segnali elettrici da due specie di piante diverse, e indotta da diversi tipi di stimoli.
L'elettrodo EPG è uno strumento versatile ed elegante per studiare le risposte elettrofisiologiche di cellule floema a vari tipi di stimoli.
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Acknowledgments
VSR è stato sostenuto da una sovvenzione Marie Curie IIF (FERITE IN TERRA, acronimo di: ferita indotta segnali elettrici in Arabidopsis thaliana).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brass connector pins | EPG Systems/hardw.shop | Φ 1.2 mm | |
| Thin copper wire | EPG Systems/hardw.shop | approx. Φ 0.2 mm | |
| Thin gold wire | EPG Systems | Φ 18 µm | |
| Soldering fluid | hardware shop | matching the soldering wire | |
| Resin-cored soldering wire | hardware shop | ||
| Styrofoam | any | ||
| Water-based silver glue | EPG Systems | recipe in: www.epgsystems.eu | |
| Paper wipes | Kimberly-Clark | 5511 | |
| Soldering bolt | any | ||
| Stereomicroscope | Hund Wetzlar | minimum magnification is 10X | |
| Small scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10050-00 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Vortex | A. Hartenstein | L46 | |
| Watercolor brushes | any | Number 1 or 2 | |
| Air suction device | see description in: www.epgsystems.eu | ||
| Insect pins | any | No. 1 or 2 | |
| Solid table | |||
| Faraday cage | Hand made | ||
| Computer | Fujitsu Siemens | ||
| Data acquisition software | EPG Systems | Stylet+d | |
| Giga-4 (-8) Complete System | EPG Systems | ||
| includes the following: | |||
| Main control box with USB output | Di155/Di710 | 12/14 bit, rate 100 Hz (softw. fixed) | |
| EPG probes 4 (8) | 50x DC pre-amplifier | ||
| Swivel clamps on rod | |||
| DC power adaptor | bipolar, 230/115 VAC to -/+8 VDC | ||
| Plant electrodes and cables | |||
| Additional test and ground cables |
References
- Salvador-Recatalà, V., Tjallingii, W. F., Farmer, E. E. Real-time, in vivo. intracellular recordings of caterpillar-induced depolarization waves in sieve elements using aphid electrodes. New Phytologist. 203 (2), 674-684 (2014).
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