Abstract
מחלות התוקפות את השלמות של תאי עצב מוטוריים בחוט השדרה הן בין תנאי נוירולוגיות המתישות ביותר. בעשורים האחרונים, בפיתוח של מספר מודלים של בעלי חיים של הפרעות העצבית-שרירית אלה סיפק את הקהילה המדעית עם תרחישים טיפוליים שונים שמטרתם לעכב או היפוך ההתקדמות של תנאים אלה. על ידי ניצול של המכונות המדרדר של נוירונים, אחד מהגישות אלה היה למקד את שרירי שלד כדי גנים טיפוליים הסעות למתאימות הנוירונים מוטוריים בחוט השדרה. למרות שפעם אחת מבטיח, ההצלחה של גישת מסירת גן כזה כבר הקשתה על ידי המספר תת-אופטימלי של תאי עצב מוטורי transduced זה עד כה הוכיח להניב. צלחות הסוף מוטורי (חברי הפרלמנט האירופי) הן אזורים מאוד מיוחדים על שרירי השלד שנמצאים בקשר הסינפטי ישיר לחוט השדרה α הנוירונים מוטוריים. בהקשר זה, חשוב לשים לב כי, עד כה, המאמצים לretrogradelyגני העברה לתוך הנוירונים מוטוריים נעשו ללא התייחסות למיקומו של אזור MEP בשרירים הממוקדים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט 1) כדי לחשוף את המיקום המדויק של חברי הפרלמנט האירופי על פני השטח של שרירי שלד ו- 2) להשתמש במידע זה כדי להנחות את המשלוח תוך שרירית והתחבורה מדרדר אופטימלית הבאה של קליעים נותבים מדרדר לתוך הנוירונים מוטוריים. אנו מקווים לנצל את התוצאות מניסויי התחקות אלה במחקרים נוספים לחקירת תחבורה מדרדר של גנים טיפוליים לנוירונים מוטוריים בחוט השדרה באמצעות המיקוד של חברי הפרלמנט האירופי.
Introduction
אובדן השליטה של תנועה רצונית, הנובעת מבעיות נוירולוגיות כגון מחלת הנוירון מוטורי ושדרה, כמו גם ניוון שרירים דושן הוא מצב של חולשה שיש השפעה מתמשכת גבוהה וארוכה בחייו של כל יום של אנשים מושפעים. בעשור האחרון, מאמצי מחקר במטרה לעצור או לפחות לעכב את ההשפעות המזיקות של מחלות העצבית-שרירית אלה היו בראש סדר עדיפויות לרופאים רבים ומדען ברחבי העולם. בהקשר זה, הדור האחרון של מודלים של בעלי חיים המחקים מחלות עצבית-שרירית אלה כבר סייעו בהשגת תובנות בסיסיות למנגנונים הפיסיולוגיים העומדים בבסיס ההתפתחות וההתקדמות של תנאים אלה 1-13. טיפול במחלה העצבית-שרירית אלה דורש גישה ישירה לחוט השדרה ויכולה להיות מושגת על ידי זריקות חוט השדרה 14,15. גם התקדמות בטיפול גנטי ממוקדת השרירים המשורטטים של העליון וגפיים התחתונים לגנים טיפוליים הסעות לתאי העצב המוטוריים α המתאים, הממוקמים בתוך קרן הגחון של חוט השדרה 1,9-13. עם זאת, אסטרטגיה פעם מבטיחה זה לא הצליחה לשפר את התוצאה של תנאי נוירולוגיות אלה. אמנם זה הוגן להסיק שתוצאות גרועות אלה יכולים להיות, לפחות בחלקו, להיות מיוחס ליעילות הנמוכה של גני מגן אלה, אחד לא יכול לשלול את היעילות הנמוכה של שיטות משלוח גן אלה.
צלחות הסוף מוטורי (חברי הפרלמנט האירופי) הן אזורים מיוחדים של myofibres שלד שמסוכסך על ידי מסופי האקסון של סיבים מוטוריים היקפיים גדולים שמקורם α הנוירונים מוטוריים. יחד, קצות עצבי סיבים ההיקפיים וחברי הפרלמנט האירופיים מהווים את הצומת העצבית-שרירית, כלומר, האתר שבו דחפים הסינפטי מופעלים על ידי שחרור אנטרוגרדית של מוליך עצבי, אצטילכולין. חשוב לציין, את מערכת היחסים בין סיבי עצב היקפיים וחברי הפרלמנט האירופיים היא דו-directional, למרות שמנועים שונים אחראים להובלה של מולקולות ואברונים כיוון, כמו גם מתא העצב somata 16-18. לאור שיקולים אנטומיים אלה, חברי הפרלמנט האירופי להיראות המטרות של בחירה עבור המשלוח והתחבורה מדרדר הבאה של חומר גנטי לתאי העצב המוטוריים המקבילים. בהקשר זה, אין זה מפתיע שההצלחה של התמרה הנוירון מוטורית מאוד תלויה במרחק בין הזריקה תוך שרירית של וקטורים ויראליים וחברי הפרלמנט אירופי של השריר 19-20. באופן מפתיע, עם זאת, את המיקום המדויק של אזורי חבר הפרלמנט האירופי על myofibres של עכברוש המעבדה ועכבר, שני המינים של בחירת מודל מחלות עצבית-שרירית, לא היו זמינים עד לאחרונה.
יש לנו יצרנו מפות מקיפות של אזור חבר הפרלמנט האירופי לכמה שרירי forelimb בחולדה והעכבר 21-22. לאחרונה, שהראינו את הפרטים של הארגון של r חבר הפרלמנט האירופילאגיון לכמה שרירים של hindlimb העכבר 23 ואנחנו כרגע ניתוח התכונות של חברי הפרלמנט האירופי בhindlimb החולדה. בידיים שלנו, זריקות לשריר של קליעים נותבים מדרדר מופנים לכל האזורים חבר הפרלמנט האירופי, בשרירים אלה הולידו הנוירונים מוטוריים יותר שכותרת המשתרעים על פני מגזרי חוט השדרה יותר מאשר דווח בעבר. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול שפותחו בשנים האחרונות כדי לחשוף את המיקום של חברי הפרלמנט האירופי על פני השטח החיצוניים כמו גם ברחבי עומק hindlimb וforelimb שרירים בשני העכבר והחולדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הליכי הניסוי המתוארים כאן עמדו בועדה לטיפול בבעלי חיים והאתיקה של UNSW אוסטרליה ובוצעו בהתאם לבריאות הלאומית ותקנות המועצה למחקר רפואי של אוסטרליה לניסויים בבעלי חיים. כל הנהלים בפרוטוקול זה צריכים להתבצע בהתאם לדרישה של ועדת טיפול בבעלי חיים ואתיקה הרלוונטית.
1. acetylcholinesterase histochemical מכתים
- מכין את תערובת תגובת acetylcholinesterase
- להוסיף 290 מ"ג של יודיד Acetylthiocholine 200 מיליליטר של 0.1 מ 'חיץ פוספט (PB). מערבבים עם בוחש מגנטי ב 900 סל"ד.
- להוסיף 600 מ"ג של גליצין בבחישה מתמדת.
- לאט לאט להוסיף 420 מ"ג של גופרת נחושת לתערובת התגובה תחת בחישה מתמדת עד שהמוצר הוא נמס לגמרי.
- הסר את העור על פגר החיה (שהושג באמצעות שיתוף רקמות) על ידי ביצוע חתכיםלתוך העור של עכברים או עכבר perfused, לתפוס את העור מאזור הצוואר ומושך את זה בעבר רגליה. ודא שfascia מכסה כל שריר הוא או שהוסר או מחורר באופן משמעותי כדי להבטיח חשיפה נרחבת של סיבי השריר לפתרון התגובה.
- לטבול את כל הגוף או איבר של עניין לתערובת תגובת דגירה O / N ב 4 ° C.
- שטוף את הפגר למשך 2 דקות במים מזוקקים. הערה: בשלב זה, את שרירי תערוכה צבע כחול וצלחות סוף מנוע (חברי הפרלמנט האירופי) ניתן לראות בנקודות הלבנות.
- לחשוף את הפגר לפתרון גפרתי אמוניום 10% במשך 3-5 שניות.
הערה: סיבי השריר במהירות יהפכו חומים וחברי הפרלמנט האירופיים יהיו נצפים כנקודות מנומרות שחורות. אם התגובה מתרחשת מהר מדי, והסיבים השריר מוכתמים כהים מדי להבחין בין חברי הפרלמנט האירופי והסיבים השריר מנסים באמצעות ריכוזים נמוכים יותר של פתרון אמוניום גפרתי (למשל, 5%). זמן התגובה כדי לקבל אתלעומת זאת אופטימלי בין חברי הפרלמנט האירופי והסיבים השריר משתנה ממדגם אחד למשנהו. לכן קשה להגדיר את זמן חשיפה המדויק למגיב. התגובה צריכה להיות במעקב הדוק ועצרה כאשר לעומת זאת נחשב נאות. - שטוף את הפגר שתי פעמים, עם תסיסה במים מזוקקים וללטף בעדינות היבשה הפגר.
- צילום שני היבטים לרוחב והמדיאלי של הגפה, על מנת להבטיח כי חברי הפרלמנט האירופי לכל השרירים של עניין נלכדים.
2. תוך שרירית זריקות בצלחות מוטורית הסוף
- משוך micropipettes זכוכית עם חולץ micropipette (השימוש בmicropipettes מדורג עם בוכנות מומלצת). בעזרת מיקרוסקופ לנתח, לשבור את הטיפים של micropipettes עם זוג המלקחיים כך שהקוטר הפנימי של לומן של micropipette הוא כ 0.5 מ"מ.
- ודא שכל מכשירי הניתוח נעשו בם שימוש טרי autoclaved והבאזור הניתוח הוא סטרילי.
- מלא את micropipettes עם Fluoro-זהב (5% במים מזוקקים).
- לגרום לְאַלחֵשׁ בבעלי החיים בתא אינדוקציה עם isofluorane (4% בO 2). בדוק ליישר רפלקס ולהבטיח היעדרו לפני הסרתו מתא האינדוקציה. Secure חרטום על החוטם של החולדה ולספק isofluorane (2% בO 2) לתחזוקה של הרדמה. לצבוט את אצבעות רגליו של בעל החיים ולגעת בעדינות את העין של בעלי החיים על מנת להבטיח ששתי נסיגת הדוושה ורפלקסים קרני נעדרות. הערה: גם תערובת של קטמין וxylazil יכולה לשמש (80 ו -10 מ"ג / קילוגרם בהתאמה, נמסרו intraperitoneally). קטמין הוא לוח זמנים 8 ("מבוקר") סמים ופרוטוקולים נחוצים הקשורים לרכישה, שימוש, האחסון וסילוק של התרופה יהיה חייב להיות דבק.
- החל סיכה עין כדי למנוע התייבשות של העיניים במהלך ההליך.
- לגלח את tאיבר argeted וגזת שימוש כדי לנגב את האזור המגולח עם שלושה סקראבס לסירוגין של chlorhexidine ואלכוהול 70%. מעבירים את החיה לאזור הניתוח.
- מניחים את החיה על underpad נקי ולמקם אותו כראוי, כדי להבטיח גישה טובה לשריר (ים) הממוקד.
- השתמש זוג מלקחיים עם נקודות אחיזה שן להרים מהשרירים הבסיסיים העור מעל השריר הממוקד ולעשות חתך בעור עם מספריים כירורגיות. ודא שהחתך הוא גדול מספיק כדי לחשוף את השריר (ים) של עניין לחלוטין. ודא שיש הפרעה מזערית לfascia.
- השתמש בתמונות MEP ללשרבב נפשי מיקום וצורה של האזור חבר הפרלמנט האירופי על השריר (ים).
הערה: סמן הרגיש בסדר יכול לסייע לשחזר את אזור MEP מהתצלום על גבי השרירים (ים) של עניין. - לבצע זריקות מרובות לאורך כל אורכו של אזור חבר הפרלמנט האירופי (לFluoro-זהב, 3 עד 4 זריקות של 1-2 μl כל זהhould יספיק). נגב בעדינות את השרירים (ים) כדי להסיר כל חלחול.
- להביא את שני הקצוות של העור חרות קרוב יחד עם מלקחיים בוטים ולסגור את הפצע עם קליפים כירורגית. לחדור 0.1 מיליליטר Bupivacaine (0.5% במים) (או הרדמה מקומית אחרת) לאורך כל תוחלת של הפצע.
- כבה את מכשיר ההרדמה ומלפקח על בעלי החיים עד שהוא התאושש לחלוטין מן ההרדמה.
- חכה 14 ימים בין הממשל של זריקות תוך-שרירי והטפטוף של בעלי החיים.
3. זילופים
- לנהל מנה קטלנית של פתרון נתרן pentobarbitone (למשל Lethabarb; 150 מ"ג / קילוגרם) לבעלי החיים על ידי זריקת intraperitoneal.
- באופן הדוק לפקח על בעלי החיים עד שהגיעה לרמה עמוקה של הרדמה, כפי שאושר על ידי היעדר נסיגת הדוושה ורפלקסים של הקרנית.
- מקם את החיה על הגב שלה על לוח לנתח ממוקם מעל perfusioכיור n.
- השתמש זוג מלקחיים עם נקודות אחיזה שן להרים את העור המכסה את הבסיס של עצם החזה. לעשות חתך קטן בעור עם זוג מספריים כירורגיות חזקים מייד מתחת לעצם החזה ולאחר מכן להשתמש במלקחיים כדי אחיזת סחוס xiphoid של עצם החזה. בעוד מחזיק את סחוס xiphoid, להגדיל את החתך בשני הצדדים של חלל החזה, מעצם החזה לבתי השחי.
- חותך את הסרעפת כדי לחשוף את הלב.
- הזרק 0.ml של הפרין ישירות לשיא של הלב כדי למנוע קרישה של הדם.
- חותך את השיא כדי לאפשר ההחדרה של צינורית לתוך החדר השמאלי, ולאחר מכן מהדק במהירות את הצינורית במקום בעזרת haemostat.
- עושה חתך באטריום תקין עם זוג המספריים קנס ומייד להתחיל את משאבת peristaltic. Perfuse עם 0.1 מ 'PB עד שהנוזלים זורמים החוצה של אטריום הוא כמעט חופשיים של דם והצבע של הכבד הופך חום בהיר. לאחר מכן, perfuse עם solution של paraformaldehyde (4% ב 0.1 M PB) עד שכל גופו של בעל החיים הופך להיות נוקשה.
4. חוט השדרה הצווארי Dissection והכנה להיסטולוגיה
- הנח את פגר החיה על הבטן שלה.
- חותך את העור בקו האמצע של הגוף עם אזמל ולשקף אותו מבסיס הגולגולת עד לרמה של עצם הכסל.
- לחתוך ומשקפים את השרירים ליד חוליות עמוד השדרה על מנת לחשוף את היבט הגב של עמוד השדרה.
- זהה את תהליך spinous הגרמי של אטלס, מגזר צוואר הרחם השני (כלומר, C2), ולהסיר אותו עם זוג rongeurs או מלקחיים כירורגיים לאתר את השורש הגבי מקביל יסוד.
- זהה את שורש C2 תקין על ידי צביעתו עם סמן הרגיש קבוע.
- הסר את החוליות הבאות בזה אחר זה ולסמן את שורשי גב תקין עם צבעים מתחלפים (כלומר, C2, C4, יכול להיות בצבע C6, וC8 בירוק וC3, C5, C7, T1 יכול להיות colכבדתי בכחול).
- שימוש במחט כירורגית קטנה (למשל, 30 G מחט מד) לעדינות פירס דרך הדורה המכסה את הקצה התחתון של חוט השדרה. עם השיפוע של המחט פונה כלפי מעלה, להרים את הדורה מהכבל תוך כדי תנועת המחט rostrally לעשות חריץ אורכי.
- משקף את הדורה.
- חותך את חוט השדרה transversally לגושים אחת או שתיים קטע עם להב סכין מנתחים חדש.
- השאר את מגזרי חוט השדרה באתר ו, עבור כל בלוק, להפוך בזהירות סימן fiducial קטן בצד השמאל של כל בלוק עם מחצית דרך להב סכין מנתחים בין שני שורשים סמוכים. ודא שסימן fiducial הוא עמוק מספיק דרך הרקמה כלהיות גלוי מהיבט הגחון של בלוקים. הפוך את סימן fiducial בזווית של 45 מעלות כ, מצביע גם anteriorly או בדיעבד ביחס לאנטומיה של בעלי חיים, כדי לסייע בכיוון של מגזר הרקמה הבא לנתיחה.
- לאסוף את אבני הפרט לבקבוקים קטנים, שכותרתו ברורה המכילים פתרון של paraformaldehyde (4% ב 0.1 M PB) ולהשאיר על RT O / N.
- העבר את אבני לתוך בקבוקים נקיים, שכותרתו ברורה המכילים פתרון של סוכרוז (30% ב 0.1 M PB) ולשמור על 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות יומיים.
- מניחים את הפלחים בcryo-תבניות וכיסה אותם במדיום הקפאת רקמה. להכנת היסטולוגית אורך, כוון את הלוקים בהיבט הגב פונה כלפי מעלה ולהשתמש בסימן fiducial כדי לכוון את הבלוק בcryo-התבניות.
- להקפיא את cryo-התבניות ב -20 ° C ולחתוך עם cryostat ב -50 סעיפים מיקרומטר בעובי. הערה: החלקים יכולים להיות מותקן ישירות על שקופיות מיקרוסקופ ההידבקות והשאירו לייבוש O / N. לחלופין, ניתן ריחפו הסעיפים ב 48-גם צלחות מלאות ב0.1 M PB ולאחר מכן רכובים באמצעות סימן fiducial כדי לכוון את סעיפי רקמות על השקופיות.
5. מותני השדרה CoRD Dissection והכנה להיסטולוגיה
- הנח את פגר החיה על זה בחזרה.
- לבצע חתך קו האמצע לאורך הבטן של החיה ולהסיר את הקרביים. לנתח את השרירים של דופן בטן האחורית לחשוף את היבט הגחון של עמוד השדרה.
- אתר את הצלע הקצרה הזנב-ביותר וחולית T13 הסמוך בי שורש הגחון T13 יוצא העצם.
- ברצף להסיר אחד אחד מקורי שתיים או שלוש חוליות לT13 (כלומר, T12, T11 ו, במידת הצורך, T10) עם rongeurs כירורגית העדין לעקוב שורש הגחון T13 עד הנקודה של כניסה בהיבט הגחון של חוט הגחון ו לסמן אותו עם סמן הרגיש קבוע.
- מנקודה זו ואילך, לחזור על אותה הפרוצדורה לזהות את המיקום של נקודות כניסת שורש הגחון לL1, L2, L3, L4, L5, S1 וL6, צביעתם עם צבעים מתחלפים.
- בצע את אותו ההליך כאמור בסעיף 4.5-4.10 ללוםבר נתיחת חוט השדרה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
צביעת histochemical acetylcholinesterase חושפת את המיקום של צלחות סוף המנוע לרוחב של השרירים. איור 1 מדגים את התוצאות של מכתים כזה מבוצע על forelimb עכברוש כולה. הוא הציע כדי לייעל את הריכוז של הפתרון גפרתי אמוניום (למשל., 5-7% במקום 10%), כמו גם את זמן הדגימה היא שקועה בפתרון אם מכתים הרקע שאינו ספציפי בסיבי השרירים הוא גם מוגזם. באיור 2 טור של הנוירונים מוטוריים שכותרתו בחוט השדרה הצווארי לאחר הזרקה של נותב עצבי המדרדר לאורכו של אזור צלחת סוף המנוע של היד אחורית עכבר שרירים כופפים. הנוירונים המוטוריים שכותרת retrogradely בדרך כלל בצורת עמודת אורך המשתרעת על פני מגזרים שונים של חוט השדרה. איור 3 ממחישים את המספרים השונים של נוירונים מוטוריים בחוט השדרה שכותרתו שהושג באמצעות SELFluoro-זהב קפה, פועל מיקוד של אזור צלחת סוף המנוע בכופפי היד האחורי. ספיגה מקסימלי נצפתה לאחר לידה לכל אורכו של האזור חבר הפרלמנט האירופי, בניגוד למיקוד תאים ספציפיים של אזור חבר הפרלמנט האירופי.
איור 1: צפה בForelimb הרוחב של העכברוש לאחר acetylcholinesterase histochemical מכתים לצלחות מוטורי הסוף לפני () ואחרי חשיפה (ב) לאמוניום גפרתי הפתרון. ב (א), צלחות הסוף המוטורי ניכרות כנקודות מנומרות לבנים שיוצרות קו רציף שחוצה את כל הרוחב של השריר בזמן סיבי השריר לאמץ גוון ירוק-כחול. ב( ב '), באותו forelimb מוצג לאחר הטבילה בפתרון גפרתי אמוניום. לאחר פיתוח בפתרון גפרתי אמוניום, צלחות סוף מנוע tuשחור rn על סיבי שריר החום. החיצים בשני החלקים של הנתונים מצביעים על מיקומו של צלחות סוף מנוע ל( 1) Acromiotrapezius, (2) Spinodeltoideus ו( 3) Triceps כופפים.
איור 2:. Photomicrographs של 50 מיקרומטר חתך לאורך דרך קרן הגחון של חוט השדרה ברמות חשיפת צוואר הרחם שכותרת Fluoro-זהב מנוע נוירונים WM מייצג את החומר הלבן וGM מייצג את החומר האפור של חוט השדרה. הקו המקווקו מציין את הגבול בין החומר האפור ולבן בתוך קטע חוט השדרה נצפה בדמות. Photomicrograph נלקח עם מטרת 10X תחת מסנן DAPI בעוד הבלעה נלקחה במטרה 20X תחת אותו המסנן. בשני הלוחות, תיוג Fluoro-זהב ניתן לצפות בציטופלסמה הנוירון המוטורית, כמו גם האקסון הפרוקסימלי / dendritiתהליכי ג. דמות כפי שפורסם במקור בet al Tosolini. (2013) מיקוד באורך המלא של אזורי פלייט מוטורי הסוף בForelimb העכבר מגדיל את ספיגת Fluoro-הזהב לתוך מקבילים חוט השדרה מנוע נוירונים שפתוחה. Neurol. 04:58. doi: 10.3389 / fneur.2013.00058
איור 3:. סלקטיבי Fluoro-זהב מיקוד של האזור מוטורי סוף פלייט בTriceps הכופפים ותוויות וכתוצאה מכך בחוט השדרה מנוע נוירונים () הוא ייצוג סכמטי של המיקום של צלחות סוף מנוע בסיבי כופפי היד אחורית. שלושה חלקים שונים של אזור חבר הפרלמנט האירופי שהיו ממוקדים באופן אינדיבידואלי מיוצגים על ידי הנקודות הירוקות, אדום וכחולה. הנקודות הירוקות ואדומות מייצגות את חצאים הקדמי והאחוריים של האזור כולו חבר הפרלמנט האירופי, בהתאמה, בעוד שהנקודות הכחולות represent המיקום של הזרקת בולוס של FG לבטנו של השריר. החץ דו-ראשי orientates השריר בציר קדמי-אחורית. (ב) הוא תרשים מרוכבים הממחיש את התיוג שהושג בעקבות מיקוד סלקטיבית של החלקים השונים של אזור MEP של כופפי היד האחורי, כפי שצוין ב(). כל נקודה ב( B) מייצגת הנוירון מוטורי שכותרת אחת. הטור השחור הוא נציג של תיוג טיפוסי נצפה ההזרקה של FG הבא לכל אורכו של אזור MEP של השריר. טור הנוירון מוטורי האדום מתקבל הבאים זריקות מהשדה במחצית האחורית של השריר, בעוד טור הנוירון מוטורי הירוק מתקבל הבא זריקות מהשדה במחצית הקדמית של השריר. זריקות מוגבלות ל" הבטן "של השריר הניבו הנוירונים מוטוריים במספר קטן בלבד של מגזרי חוט השדרה, כפי שהודגמו על ידי העמודה הכחולה. דמות כמו במקור לפרסםאד בTosolini et al. (2013) מיקוד באורך המלא של אזורי פלייט מוטורי הסוף בForelimb העכבר מגדיל את ספיגת Fluoro-הזהב לתוך מקבילים חוט השדרה מנוע נוירונים שפתוחה. Neurol. 04:58. doi: 10.3389 / fneur.2013.00058
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מיקוד תוך שרירית והעברת מדרדר הבאה של transgenes הטיפולי לתאי העצב המוטוריים α המתאימים לטיפול הניסיוני של מצב עצבית-שרירית אינה אסטרטגיה חדשה. לדוגמא, שיטת משלוח זו נעשתה שימוש כדי לעכב ניוון עצבית-שרירית בשלבים שונים של התקדמות ALS בSOD1 לעכברים וחולדות 1,9-12 כמו גם בעכברים עם 13 SMA. בעוד מבטיח, את היעילות של הטיפול גנטי תרחישים אלה הייתה מוגבלת. בהקשר זה, אנו מציעים כי הספיגה של transgenes ידי נוירונים מוטוריים בחוט השדרה יכולה להיות משופרת על ידי המיקוד סלקטיבי של צלחות סוף מנוע בסיבי השריר. חשוב לציין כי, במחקרים שהוזכרו לעיל, הזריקות לשריר של וקטורים ויראליים בוצעו ללא התייחסות למיקומו של אזור MEP בשרירים הממוקדים.
לאורך הניתוחים של חלוקת צלחות הסוף המוטורי שלנו(חברי הפרלמנט האירופי) של hindlimb וforelimb, כמה עקרונות צמחו. ראשית, אזור MEP משתרע על פני כל הרוחב של שריר. יתר על כן, חברי הפרלמנט האירופי מיושרים באופן עקבי orthogonally לגבי הכיוון של myofibres. יש לציין, אזור MEP לא תמיד ממוקם בחלק העבה ביותר של השריר, אזור המכונה לעתים קרובות "הבטן" ושלעתים קרובות היעד של זריקות לשריר בולוס. ראוי לציין כי הניתוחים הנוכחיים נערכו על C57BL6 עכבר 22-23 והארוך אוונס להלשין 21 ונמצא כי חלוקת חברי הפרלמנט האירופי נשמרת בתוך כל אחד משני זנים של בעלי חיים אלה. עם זאת, אם לא חלוקת חבר הפרלמנט האירופי, נשמרת בין זנים השונים של בעלי חיים בתוך אותו המין נשאר להיות מתועדים.
במקור, יש לנו תיעדנו את המיקום של אזור חבר הפרלמנט האירופי לכמה שרירים של forelimb וhindlimb כדי להנחות קטן, מולזריקות לשריר טייפל של נותב עצבי Fluoro-זהב מדרדר. מפות חבר הפרלמנט האירופי, אלה יכולים לשמש לtransgenes הסעות לתאי עצב מוטורי. במקרה כזה, עם זאת, חשוב להתאים את הכרכים של זריקות בהתאם לסוג של וירוס המשמש סרוטיפ, כמו גם בכותר שלה (לדוגמא., אדנווירוס, lentivirus, וכו '). שמירה על fascia שלם היא דרך טובה לשמור על הווירוס המוגבל בגבולות של השריר (ים) של עניין. דרך נוספת להימנע מtransfection המזויף של הנוירונים מוטוריים innervating שרירי השכן הוא לנגב את פני השטח של השרירים בעדינות לאחר הזריקות. אמצעי זהירות אלה עשויות להיות לא רלוונטי בכמה עיצובים ניסיוניים שבי השגת רמות גבוהות של התמרה יכולה להיות רלוונטי יותר מזה המכיל בתוך הבריכה של הנוירונים מוטוריים אספקת השרירים הממוקדים. עם זאת, הם למעשה טובים מטעמי בטיחות ברורה. אם שרירים יותר מפעם אחת בודדים צריכים להיות מוזרקים, זה יכול להיות חכם, ואם אפשר, כדי לבחורקבוצה של שרירים הנמצאים קרובים זה לזה כדי לצמצם את הגודל של החתך בעור. יש חולדות ועכברים עור רופף מאוד (כלומר., אינו מחוברת לשרירים), ולכן קל יחסית למקד כמה שרירים מבלי לבצע חתכים בעור ענקיים.
ריפוי גנטי יעיל לחולי ALS ותנאים עצבית-שרירית אחרות באמצעות המכונות המדרדר של נוירונים עדיין מהווה אתגר כ, באופן אידיאלי, טיפול כזה יעביר גנים מועילים בכל האוכלוסייה של נוירונים מוטוריים בחוט השדרה. עם זאת, אין זה הכרחי כדי למקד את כל הנוירונים המוטוריים להשיג רמות ברות קיימא של התמרה אם הגן הטיפולי של ריבית קידוד חלבון הפרשה כגון neurotrophins. הנוירונים מוטוריים אכן, לא transduced בקרבתם של אלה שכבר transduced הוכחו להפנים מולקולות אקסוגני של neurotrophins באמצעות מנגנון אוטוקריני 24. זה "אפקט עובר אורח" משפר באופן משמעותי אפיcacy של שריר מיקוד לגנים המקודדים חלבוני הפרשת הסעות למתאימים הנוירונים מוטוריים. מצד השני, בהתחשב בעובדה שאובדן השליטה בדרכי הנשימה היא הסיבה האולטימטיבית של מוות בחולי ALS, זריקות לשריר של מבנים נגיפיים טיפוליים ניתן לבצעו בשרירי צלע 1 או intrapleurally 25 כדי להגן על תאי העצב המוטוריים המעורבים בנשימה. בתיאור שיטה כדי להדגיש את המיקום וארגון של חברי הפרלמנט האירופי שברירי שלד בקלות, הפרוטוקול הנוכחי יהיה להוכיח להיות כלי רב ערך כדי לחקור אסטרטגיות ריפוי גנטי חדשניות לתפקוד עצבית-שרירית. פרוטוקול זה גם מספק דרך פולשנית לשמור על השלמות של הצומת העצבית-שרירית במחלות הנוירון המוטורי אלה נמוכים יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי לאומי לבריאות ורפואה מרכז מחקר (NHMRC) מענק פרויקט לRM
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluoro-Gold | Fluorochrome, LLC | Nil | Diluted to 5% |
| Drummond PCR Micropipets 1-10 µl | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | accompanied with plungers |
| Acetylthiocholine Iodide | Sigma Life Science | A5751-25G | |
| Copper(II) Sulfate Anhydrous | Sigma-Aldrich | 61230-500G-F | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Glycine | Ajax Finechem | 1083-500G | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin | Life Technologies | D-3312 | Diliuted in distilled water |
| Isothesia | Provet | ISOF00 | 1000 mg/g Isoflurane inhalation vapour |
| Autoclip 9 mm Wound Clips | Texas Scientific Instruments, LLC | 205016 | |
| Lethabarb Enthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd. | LETHA450 | |
| Formaldehyde Solution | Ajax Finechem | A809-2.5L PL | |
| SuperFrost Plus glass slides | Menzel-Glaser | J1800AMNZ | |
| Ammonium Sulphide | Sigma-Aldrich | A1952 | Diluted to 10% |
| Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride) | Astrazenca | Diluted to 0.25% |
References
- Kaspar, B. K. Retrograde Viral Delivery of IGF-1 Prolongs Survival in a Mouse ALS Model. Science. 301 (5634), (2003).
- Ishiyama, T., Okada, R., Nishibe, H., Mitsumoto, H., Nakayama, C. Riluzole slows the progression of neuromuscular dysfunction in the wobbler mouse motor neuron disease. Brain Res. 1019 (1-2), 226-236 (2004).
- Turner, B. J., Parkinson, N. J., Davies, K. E., Talbot, K. Survival motor neuron deficiency enhances progression in an amyotrophic lateral sclerosis mouse model. Neurobiol Dis. 34 (3), 511-517 (2009).
- Wegorzewska, I., Bell, S., Cairns, N. J., Miller, T. M., Baloh, R. H. TDP-43 mutant transgenic mice develop features of ALS and frontotemporal lobar degeneration. P Natl Acad Sci USA. 106 (44), 18809-18814 (2009).
- Kimura, E., Li, S., Gregorevic, P., Fall, B. M., Chamberlain, J. S. Dystrophin delivery to muscles of mdx mice using lentiviral vectors leads to myogenic progenitor targeting and stable gene expression. Mol Ther. 18 (1), 206-213 (2009).
- Van Den Bosch, L. Genetic rodent models of amyotrophic lateral sclerosis. J Biomed Biotechnol. 2011 (6), 348765–11 (2011).
- Pratt, S. J. P., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles. J Physiol. 591 (Pt 2), 559-570 (2013).
- Garrett, C. A., et al. DYNC1H1 mutation alters transport kinetics and ERK1/2-cFos signalling in a mouse model of distal spinal muscular atrophy). Brain. 137 (Pt 7), 1883-1893 (2014).
- Bordet, T., et al. Protective effects of cardiotrophin-1 adenoviral gene transfer on neuromuscular degeneration in transgenic ALS mice). Hum Mol Gen. 10 (18), 1925-1933 (2001).
- Acsadi, G., et al. Increased survival and function of SOD1 mice after glial cell-derived neurotrophic factor gene therapy. Hum Gene Ther. 13 (9), 1047-1059 (2002).
- Azzouz, M., et al. VEGF delivery with retrogradely transported lentivector prolongs survival in a mouse ALS model. Nature. 429 (6990), 413-417 (2004).
- Suzuki, M., et al. Direct muscle delivery of GDNF with human mesenchymal stem cells improves motor neuron survival and function in a rat model of familial ALS. Mol Ther. 16 (12), 2002-2010 (2008).
- Benkhelifa-Ziyyat, S., et al. Intramuscular scAAV9-SMN Injection Mediates Widespread Gene Delivery to the Spinal Cord and Decreases Disease Severity in SMA Mice. Mol Ther. 21 (2), 282-290 (2013).
- Azzouz, M., Hottinger, A., Paterna, J. C., Zurn, A. D., Aebischer, P., Büeler, H. Increased motoneuron survival and improved neuromuscular function in transgenic ALS mice after intraspinal injection of an adeno-associated virus encoding Bcl-2. Hum Mol Gen. 9 (5), (2000).
- Lepore, A. C., Haenggeli, C., et al. Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS. Brain Res. 1185, 256-265 (2007).
- Schnapp, B. J., Reese, T. S. Dynein is the motor for retrograde axonal transport of organelles. Proc Natl Acad Sci USA. 86 (5), 1548-1552 (1989).
- Vale, R. D. The Molecular Motor Toolbox for Intracellular Transport. Cell. 112 (4), 467-480 (2003).
- Schiavo, G., Fainzilber, M. Cell biology: Alternative energy for neuronal motors. Nature. 495 (7440), 178-180 (2013).
- Gracies, J. -M., Lugassy, M., Weisz, D. J., Vecchio, M., Flanagan, S., Simpson, D. M. Botulinum Toxin Dilution and Endplate Targeting in Spasticity. A Double-Blind Controlled Study. Arch Phys Med Rehabil. 90 (1), 9-16 (2009).
- Van Campenhout, A., Molenaers, G. Localization of the motor endplate zone in human skeletal muscles of the lower limb: anatomical guidelines for injection with botulinum toxin. Dev Med Child Neurol. 53 (2), 108-119 (2011).
- Tosolini, A. P., Morris, R. Spatial characterization of the motor neuron columns supplying the rat forelimb. Neuroscience. 200, 19-30 (2012).
- Tosolini, A. P., Mohan, R., Morris, R. Targeting the full length of the motor end plate regions in the mouse forelimb increases the uptake of fluoro-gold into corresponding spinal cord motor neurons. Front Neurol. 4, 58 (2013).
- Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport. Neuroscience. 274, 318-330 (2014).
- Baumgartner, B. J., Shine, H. D. Neuroprotection of spinal motoneurons following targeted transduction with an adenoviral vector carrying the gene for glial cell line-derived neurotrophic factor. Exp Neurol. 153 (1), 102-112 (1998).
- Gransee, H. M., Zhan, W. -Z., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Targeted delivery of TrkB receptor to phrenic motoneurons enhances functional recovery of rhythmic phrenic activity after cervical spinal hemisection. PLoS ONE. 8 (5), e64755 (2013).
