Abstract
Болезни, влияющие на целостность спинного мозга двигательных нейронов являются одними из самых изнурительных неврологических заболеваний. За последние десятилетия, разработка нескольких моделей животных этих расстройств нервно-мышечных предоставил научное сообщество с различных терапевтических сценариев, направленных на затягивание или обратить вспять прогрессирование этих условиях. Воспользовавшись ретроградной техники нейронов, один из этих подходов в том, чтобы предназначаться скелетные мышцы для того, чтобы челночных терапевтических генов в соответствующие спинного мозга двигательные нейроны. Хотя когда-то перспективным, успех таких генов подхода доставка была затруднена суб-оптимальным количеством преобразованных двигательных нейронов, что до сих пор, показанных на выход. Со стороны двигателя пластины (MEPS) являются узкоспециализированными области на скелетной мускулатуры, которые находятся в непосредственном контакте с синаптической спинного мозга α моторных нейронов. В связи с этим, важно отметить, что до сих пор усилия, чтобы ретроградноГены передачи в моторных нейронов были сделаны без ссылки на положения региона MEP в целевых мышцах. Здесь мы опишем простой протокол 1), чтобы показать точное местоположение Европарламента на поверхности скелетных мышц и 2) использовать эту информацию, чтобы направлять внутримышечной доставки и последующего оптимального ретроградного транспорта ретроградных индикаторов в моторных нейронов. Мы надеемся, что использовать результаты этих экспериментов розыска в дальнейших исследованиях в расследовании ретроградного транспорта терапевтических генов в нейронах спинного мозга двигательных через адресности Европарламента.
Introduction
Потеря контроля добровольного движения, что приводит от неврологических заболеваний, таких как болезни двигательных нейронов и spinal-, а также мышечной атрофии Дюшенна является изнурительных условие, которое имеет высокую и длительную влияние на каждый день жизни пострадавших лиц. За последнее десятилетие, научно-исследовательские усилия, направленные, чтобы остановить или, по крайней мере задержать пагубные последствия этих нервно-мышечными заболеваниями была приоритетом для многих клиницистов и ученых по всему миру. В связи с этим, в последнее поколение животных моделях, которые имитируют эти нервно-мышечных заболеваний играет важную роль в получении фундаментальных понимание физиологических механизмов, лежащих в основе развития и прогрессирования этих условиях 1-13. Лечение этих нервно-мышечных заболеваний требует прямого доступа к спинного мозга и может быть достигнуто путем инъекций спинного мозга 14,15. Последние достижения в области генной терапии также направлены поперечно-полосатой мышцы верхней инижние конечности челночной терапевтических генов к соответствующим α двигательных нейронов, которые расположены в вентральном роге спинного мозга 1,9-13. Тем не менее, в этот раз перспективной стратегией не удалось улучшить результат этих неврологических заболеваний. В то время как это справедливо заключить, что эти бедные результаты могут быть, по крайней мере, частично, быть связано с низкой эффективности этих защитных генов, нельзя исключать низкую эффективность этих методов доставки генов.
Со стороны двигателя пластины (MEPS) специализированные регионы скелетных миофибрилл, которые отступом от аксонов терминалов крупных периферических двигательных волокон, происходящих из α моторные нейроны. Вместе периферийные окончания нервных волокон и депутаты Европарламента образуют нервно-мышечного соединения, то есть место, где синаптические импульсы вызваны антероградной выпуска нейротрансмиттера ацетилхолина,. Важно отметить, что отношения между периферических нервных волокон и MEPs би-Direcных, хотя различные двигатели отвечают за переноса молекул и органелл к, а также от нейрона somata 16-18. В свете этих соображений анатомических, депутаты Европарламента, кажется, быть целями выбора для доставки и последующего ретроградного транспорта генетического материала в соответствующих моторных нейронов. В этом контексте, это не удивительно, что успех двигательного нейрона трансдукции в значительной степени зависит от расстояния между внутримышечной инъекции вирусных векторов и Европарламента мышцы в 19-20. Удивительно, однако, точное расположение инженерных зон на миофибрилл в лабораторной крысы и мыши, два вида выбора модели нервно-мышечных заболеваний, не были доступны до недавнего времени.
Мы подготовили подробные карты региона MEP в течение нескольких мышц передних конечностей у крыс и мышей 21-22. Совсем недавно мы показали, детали организации MEP гEgion в течение нескольких мышц задней конечности мыши 23, и мы в настоящее время анализа особенностей Европарламента на крыс задней конечности. В наших руках, внутримышечные инъекции ретроградных индикаторов, направленных на целых зон инженерных в этих мышц привело к более меченых мотонейронов, которые, охватывающих более сегментов спинного мозга, чем сообщалось ранее. Здесь мы представляем протокол, который был разработан в течение последних нескольких лет, чтобы выявить расположение Европарламента по внешней поверхности, а также по всей глубине задней конечности и передних конечностей мышцы как мыши и крысы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры, описанные здесь, выполнил уход и комитет по этике животных в Австралии и UNSW были проведены в соответствии с Национальным здравоохранения и Совета по медицинским исследованиям Австралии правил экспериментов на животных. Все процедуры в этом протоколе должны быть выполнены в соответствии с требованиями соответствующего ухода за животными и комитет по этике.
1. Ацетилхолинэстераза Гистохимический Окрашивание
- Подготовка ацетилхолинэстеразы реакционной смеси
- Добавить 290 мг иодида Acetylthiocholine к 200 мл 0,1 М фосфатном буфере (PB). Смешайте с помощью магнитной мешалки при 900 оборотах в минуту.
- Добавить 600 мг глицина при непрерывном перемешивании.
- Медленно добавляют 420 мг сульфата меди к реакционной смеси при непрерывном перемешивании, пока продукт не растворится полностью.
- Снимите кожу туши животного (полученный путем обмена тканей), сделав надрезыв коже перфузии крысы или мыши, схватив кожу от области шеи и тянет его мимо его ног. Убедитесь, что панель, покрывающую каждый мускул либо удалены или значительно перфорированной, чтобы обеспечить достаточное воздействие мышечных волокон к реакционному раствору.
- Погружают все тело или конечность интерес к реакционной смеси и инкубируют O / N при 4 ° С.
- Промыть тушку в течение 2 мин в дистиллированной воде. Примечание: На этом этапе, мышцы обладают синее окрашивание и конечные двигателя пластины (MEPS) можно рассматривать как белые точки.
- Expose тушу на 10% раствора сульфида аммония в течение 3-5 сек.
Примечание: мышечные волокна будут быстро буреют и депутаты Европарламента будет наблюдаться как черные пестрыми точками. Если реакция происходит слишком быстро, и мышечные волокна окрашивают слишком темным, чтобы различать MEPs и мышечных волокон пытаются использовать более низкие концентрации раствора сульфида аммония (например, 5%). Время реакции, чтобы получитьоптимальный контраст между MEPs и мышечных волокон изменяется от одного образца к другому. Поэтому трудно определить точное время экспозиции реагента. Реакция должна быть тщательно контролируется и остановился, когда контраст считается адекватным. - Вымойте тушку два раза, при перемешивании на дистиллированной воде и осторожно промокните насухо каркаса.
- Фотография оба боковые и медиальные аспекты конечности, гарантируя, что депутаты Европарламента для всех мышц интерес в плен.
2. Внутримышечные инъекции в пластинах двигателя End
- Потяните стеклянных микропипетки с микропипетки съемник (использование градуированных микропипеток с плунжерами рекомендуется). С помощью вскрытии микроскопом, разбить кончики микропипетки с парой щипцов, так что внутренний диаметр просвета микропипетка примерно 0,5 мм.
- Убедитесь, что все хирургические инструменты, используемые свеже в автоклаве и йв хирургическом области стерильна.
- Заполните микропипетки с фтор-Gold (5% в дистиллированной воде).
- Вызвать обезболить у животного в индукционной камере с изофлуораном (4% в O 2). Проверьте рефлекса и обеспечить его отсутствие перед удалением его из камеры индукции. Безопасный носовой конус над мордой крысы и доставить изофлуораном (2% в O 2) для поддержания анестезии. Зажмите пальцы животного и аккуратно трогать глаз животного, чтобы убедиться, что оба педали изъятие и роговицы рефлексы отсутствуют. Примечание: Смесь кетамина и xylazil также может быть использован (80 и 10 мг / кг, соответственно, поставляться внутрибрюшинно). Кетамин Расписание 8 ("Контролируемые") наркотиков и необходимые протоколы, связанные с покупкой, использования, хранения и утилизации препарата должны быть соблюдены.
- Применение смазки глаз, чтобы предотвратить высыхание глаз в ходе процедуры.
- Бритье тargeted конечностей и использование марли, чтобы протереть бритая площадь с трех чередующихся скрабы хлоргексидина и 70% спирта. Передача животное хирургической области.
- Поместите животное на чистую лежащей снизу и расположить его должным образом, чтобы гарантировать хороший доступ к адресной мышцы (ов).
- Используйте пару щипцов с захватами зубов, чтобы снять кожу за целевым мышцы от основной мускулатуры и сделать надрез в коже с хирургическими ножницами. Убедитесь, что разрез является достаточно большим, чтобы полностью раскрыть мышцы (ы), представляющий интерес. Убедитесь, что есть минимальным ущербом для фасции.
- Используйте фотографии MEP мысленно перенести расположение и форму области MEP на мышцы (ов).
Примечание: в порядке войлок маркер может помочь воспроизвести область MEP из фотографии на мышцы (ов), представляющие интерес. - Выполнение многократных инъекций по всей длине области MEP (для фтор-Gold, от 3 до 4 инъекции 1-2 мкл каждого Should быть достаточно). Аккуратно протрите мышцы (ы), чтобы удалить просачивание.
- Принесите два концы надрезанные кожи близко друг к другу с тупыми щипцами и закрыть рану хирургических зажимов. Инфильтрат 0,1 мл бупивакаина (0,5% в воде) (или другие местные анестетики) вдоль всего периода раны.
- Поверните обезболивающий машину и контролировать животное, пока оно не будет полностью оправился от наркоза.
- Подождите в течение 14 дней между администрацией внутримышечных инъекций и перфузии животных.
3. перфузии
- Администрирование смертельную дозу пентобарбитоном раствора натрия (например Lethabarb; 150 мг / кг) животному путем внутрибрюшинной инъекции.
- Тщательно контролировать животное, пока глубокий уровень анестезии не будет достигнуто, как это было подтверждено отсутствие педали вывода и роговицы рефлексы.
- Расположите животное на спину на вскрытии борту помещенном над perfusioп раковина.
- Используйте пару щипцов с помощью ручек зубных поднять кожу, покрывающую основание грудины. Сделайте небольшой разрез кожи с парой сильных хирургическими ножницами сразу ниже грудины, а затем использовать щипцы для захвата мечевидного хряща грудины. Удерживая мечевидного хряща, увеличить разрез на обеих сторонах грудной полости, от грудины к области подмышек.
- Вырезать диафрагму выставить сердце.
- Вводят 0.ml гепарина непосредственно в верхушке сердца, чтобы предотвратить свертывание крови.
- Вырезать вершины, чтобы позволить вставку канюлю в левый желудочек, а затем быстро зажим канюлю на месте с помощью haemostat.
- Сделайте надрез в правом предсердии с парой тонких ножниц и немедленно начать перистальтического насоса. Заливать 0,1 М PB, пока жидкость течет из предсердия не является почти свободным от крови и цвет печени становится светло-коричневого цвета. Затем, заливать с Солуние параформальдегида (4% в 0,1 М PB) до всего тела животного становится жесткой.
4. шейного отдела спинного мозга Препарирование и подготовка к гистологии
- Положите тушку животного на его животе.
- Порезать кожу на средней линии тела скальпелем и отражают его от основания черепа до уровня подвздошной кости.
- Разрезать и отражают паравертебральных мышц, чтобы разоблачить спинной части позвоночного столба.
- Определить костный остистый отросток Атласа, второго шейного сегмента (т.е., C2), и снимите его с парой хирургических щипцов или кусачек, чтобы найти соответствующие лежащие в основе корень спинной.
- Определить правильный корень C2 по окраске его постоянного войлочной маркера.
- Удалить следующий позвонков по одному и отметьте правильные спинной корни с чередованием цвета (то есть, С2, С4, С6, С8 и могут быть окрашены в зеленый и С3, С5, С7, T1 может быть колонкаORed синим цветом).
- С помощью небольшой хирургическую иглу (например, 30 G игла) осторожно прокалывают через твердой мозговой оболочки, покрывающей нижний конец спинного мозга. С скос иглы вверх, поднимите твердую мозговую оболочку от мозга во время перемещения иглы рострально сделать продольный разрез.
- Отражение твердую мозговую оболочку.
- Вырезать спинного мозга трансверсально в одно- или двух-сегмента блоков с новым лезвием скальпеля.
- Оставьте сегментов спинного мозга в месте, и для каждого блока, тщательно сделать небольшой FIDUCIAL знак на левой стороне каждого блока с лезвием скальпеля полпути между двумя соседними корнями. Убедитесь, что доверительное знак достаточно глубоко через ткань, чтобы быть видимым от вентральной блоков. Сделать отметку нулевых точек под углом приблизительно 45 °, указывая либо спереди или сзади по отношению к анатомии животных, чтобы помочь в ориентации участка ткани следующим вскрытия.
- Сбор отдельных блоков в маленькие, четко обозначенные как флаконы, содержащие раствор параформальдегида (4% в 0,1 М PB) и оставить при комнатной температуре O / N.
- Передача блоков в чистые, четко обозначенные бутылок, содержащих раствор сахарозы (30% в 0,1 М PB) и держать при температуре 4 ° С в течение не менее двух дней.
- Поместите сегменты в крио-форм и покрыл их среде замораживания тканей. Для продольной гистологического препарата, ориентировать блоки с дорсальной вверх и использовать в качестве координатной знак ориентироваться блок в крио-форм.
- Замораживание крио-формы при температуре -20 ° С и сократить с помощью криостата в 50 мкм толстых секций. Примечание: секции могут устанавливаться непосредственно на адгезию микроскопа и оставляют сохнуть O / N. Кроме того, участки можно плавал в 48-луночных планшетах, заполненных 0,1М ПБ, а затем монтируется с помощью FIDUCIAL знак ориентироваться срезах тканей на слайдах.
5. поясничного отдела спинного Сой Вскрытие и подготовка к гистологии
- Положите тушку животного на заднюю.
- Выполните срединный разрез вдоль живота животного и удалить внутренности. Рассеките из мышцы задней брюшной стенки, чтобы разоблачить вентральной части позвоночного столба.
- Найдите короткий хвостовой-самых ребро и прилегающих к нему T13 позвонка, где Т13 брюшной корень выходит из кости.
- Последовательно удалить по одному на два или три позвонка ростральнее Т13 (т.е. T12, T11 и, при необходимости, Т10) с мелкими хирургическими кусачек не следовать T13 вентральной корень до его точки входа в вентральной части брюшной мозг и пометить его с постоянным войлочной маркера.
- С этой точки зрения, повторите ту же процедуру, чтобы определить расположение точек вентральной корень входа для L1, L2, L3, L4, L5, L6 и S1, окраска их с разными цветами.
- Выполните ту же процедуру, как описано в разделе 4.5-4.10 для люмбар спинного рассечение шнур.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ацетилхолинэстеразы гистохимические окрашивание показывает расположение конечных двигателя пластин по ширине мышц. Рисунок 1 иллюстрирует результаты такого окрашивания выполненной по целому крыс передней конечности. Предлагается оптимизировать концентрацию раствора сульфида аммония (например., 5-7% вместо 10%), а также время образец погружают в раствор при неспецифическое окрашивание фона на мышечных волокон слишком чрезмерным. Рисунок 2 иллюстрирует колонки меченых мотонейронов в шейного отдела спинного мозга после инъекции ретроградной нейронной метки вдоль длины пластины области торцевой электродвигатель мыши трехглавой мышцы плеча. В ретроградно меченных моторные нейроны, как правило, образуют продольный столбец, который проходит через несколько сегментов спинного мозга. Рисунок 3 иллюстрирует различные количества меченых нейронов спинного мозга двигательных, которая была получена с помощью SELective фтор-золото адресности пластины области конечного мотор трицепс плеча. Максимального потребления наблюдалось после родов в весь период области MEP, в отличие от ориентированных на конкретные отсеки области MEP.
Рисунок 1: Вид на боковой передней конечности Крысы после ацетилхолинэстеразной гистохимические окрашивание Плиты двигателя конца, прежде (А) и после (б) воздействия на аммония сульфидных решения. В (а), со стороны двигателя пластины очевидно, как белый пятнистая точек, которые образуют непрерывную линию, пересекающую всю ширину мышцы в то время как мышечные волокна принять зеленый-синий оттенок. В (Б), то же самое передних конечностей представлен после погружения в раствор сульфида аммония. После развития в растворе сульфида аммония, конечные двигателя пластины Втр-н черный над коричневыми мышечных волокон. Стрелки в обеих частях фигур указывают на расположение конечных двигателя пластины для (1) Acromiotrapezius, (2) Spinodeltoideus и (3) трехглавой мышцы плеча.
Рисунок 2: Микрофотографии. 50 мкм продольный разрез брюшной Рога спинного мозга в шейных уровней выявления фтор-золото-меченого двигательных нейронов WM представляет собой белое вещество и ГМ представляет серое вещество спинного мозга. Пунктирная линия указывает на границу между серым и белым веществом в секции спинного мозга наблюдается на рисунке. Микрофотография была взята с целью 10X под DAPI фильтр в то время как вставка была сделана с целью 20X под тот же фильтр. В обоих панелей, фтор-Gold маркировка может наблюдаться в цитоплазме нейрона двигателя, а также проксимальных аксонов / dendritiC процессы. Рисунок, как первоначально опубликовано в Tosolini др. (2013) Ориентация всей длине пластины регионов двигателя конца в мышь передних конечностей Увеличивает поглощение фтор-Gold в соответствующие спинного мозга двигательных нейронов фронт. Neurol. 4:58. DOI: 10,3389 / fneur.2013.00058
Рисунок 3:. Селективный фтор-золото Ориентация двигателя торцевую пластину области в трехглавой мышцы плеча и в результате маркировки в спинном мозге двигательных нейронов () является схематическое представление расположения конечных двигателя пластин на трехглавой мышцы плеча волокон. Три различные участки области MEP, которые были целевые индивидуально представлены зелеными, красными и синими точками. Зеленые и красные точки представляют передние и задние половинки всего региона MEP соответственно, в то время как синие точки represeнт расположение болюсной инъекции FG в живот мышцы. Двуглавая стрелка ориентируется мышцы в передне-задней оси. (В) представляет собой композиционный схема, иллюстрирующая маркировки получены после селективного нацеливания на разных участках MEP области трехглавой мышцы плеча, как указано в (А). Каждая точка в (B) представляет собой один меченый мотонейрона. Черный столб является представителем типичного маркировки наблюдается после инъекции FG в весь период МООС области мышцы. Колонка красный двигательных нейронов получают следующие FG инъекции в задней половине мышцы, в то время как зеленый колонка двигательных нейронов получают следующие FG вливаний в передней половине мышцы. Инъекции ограничивается "живота" мышцы дали двигательные нейроны лишь в небольшом количестве сегментов спинного мозга, как показано синей колонке. Рисунок, как первоначально опубликоватьред в Tosolini др. (2013) Ориентация всей длине пластины регионов двигателя конца в мышь передних конечностей Увеличивает поглощение фтор-Gold в соответствующие спинного мозга двигательных нейронов фронт. Neurol. 4:58. DOI: 10,3389 / fneur.2013.00058
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Внутримышечное таргетинг и последующее ретроградная передача терапевтических трансгенов в соответствующих α моторных нейронов для экспериментального лечения нервно-мышечной состоянии не новая стратегия. Например, этот способ доставки был использован для задержки нервно-мышечную дегенерацию на различных этапах прогрессии БАС в SOD1 мышей и крыс 1,9-12, а также у мышей с SMA 13. Несмотря на то, перспективным, эффективность этих сценариев генной терапии была ограничена. В связи с этим, мы полагаем, что поглощение трансгенов по нейронов спинного мозга двигательных может быть улучшена путем селективного нацеливания стороны двигателя пластин на мышечных волокон. Важно отметить, что в указанных выше исследований, внутримышечные инъекции вирусные векторы были проведены без ссылки на расположение области MEP в целевых мышцах.
На протяжении нашего анализа распределения конечных двигателя пластин(Депутаты) на задней конечности и передних конечностей, несколько принципов появились. Во-первых, область MEP охватывает по всей ширине мышцы. Кроме того, евродепутаты последовательно выровнены ортогонально по отношению к направлению миофибрилл. Следует отметить, что область MEP не всегда расположен в самой толстой части мышцы, площадь часто называют как "живот", и это часто мишенью внутримышечных инъекций болюса. Стоит отметить, что текущие анализы проводили на C57BL6 мыши 22-23 и крысы Long Evans 21, и было найдено, что распределение MEPs сохраняется в пределах каждого из этих двух штаммов животных. Тем не менее, или не сохраняется распределение MEP между различными штаммами животных в пределах того же вида остается быть документированы.
Первоначально, мы зафиксировали расположение региона MEP в течение нескольких мышц передней конечности и задней конечности, чтобы направлять небольшой, MULtiple внутримышечные инъекции ретроградной нейронов трассирующими фтор-Gold. Эти MEP карты могут быть использованы для трансгенов челночных в моторные нейроны. В таком случае, однако, важно, чтобы регулировать объемы инъекций в зависимости от типа вируса, используемого (например., Аденовирус, лентивирусов, и т.д.) его серотипа, а также его титр. Ведение панель нетронутыми это хороший способ держать вирус заключены в пределах мышцы (ов), представляющие интерес. Еще один способ избежать ложных трансфекции моторных нейронов, иннервирующих мышцы соседа, чтобы протереть поверхность мышцы мягко после инъекции. Эти меры предосторожности могут быть значения в некоторых экспериментальных конструкций, где достижения высоких уровней трансдукции может быть более актуальным, чем содержащие его в пул моторных нейронов, обеспечивающих целевое мышцы. Тем не менее, они являются хорошей практикой, по понятным причинам безопасности. Если более чем один изолированный мышцы должны быть введены, это может быть мудрым, если это возможно, чтобы выбратьгруппа мышц, которые близки друг к другу, чтобы свести к минимуму размер разреза кожи. Крысы и мыши имеют очень свободную кожу (т.е.., Не прилагается к мышцам), так что это довольно легко цели несколько мышцы без необходимости выполнения больших разрезов кожи.
Эффективная терапия ген АЛС и других нервно-мышечных условиях с использованием ретроградной техники нейронов остается проблемой, поскольку, в идеале, такая терапия будет передавать выгодные гены по всей популяции нейронов спинного мозга двигателя. Тем не менее, это не является необходимым, чтобы все целевые моторные нейроны, чтобы достичь устойчивых уровней трансдукции, если терапевтический интерес ген кодирования белок секреторную такой как нейротропинов. Действительно, без трансдуцированных двигательных нейронов в непосредственной близости от тех, которые были трансдуцированных было показано, что экзогенные интернализации молекулы нейротрофических через паракринному механизма 24. Это «эффект свидетеля» значительно усиливает Эффитивность внутримышечного, направленные на белок-кодирующий гены секреторных трансфер в соответствующие двигательные нейроны. С другой стороны, учитывая тот факт, что потеря контроля дыхания является конечной причиной смерти в БАС, внутримышечные инъекции лечебных вирусных конструкций могут быть выполнены в межреберных мышц 1 или внутриплеврально 25 для защиты моторных нейронов, участвующих в дыхании. Описывая метод легко выделить место и организацию Европарламента по скелетных мышц, присутствует протокол оказаться ценным инструментом для изучения новых стратегий генной терапии для нервно-мышечных дисфункций. Этот протокол также обеспечивает минимально инвазивный способ сохранить целостность нервно-мышечного соединения в этих низших нейронных заболеваний двигателя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальной медицинской и медицинского исследовательского центра (NHMRC) проекта гранта РМ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluoro-Gold | Fluorochrome, LLC | Nil | Diluted to 5% |
| Drummond PCR Micropipets 1-10 µl | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | accompanied with plungers |
| Acetylthiocholine Iodide | Sigma Life Science | A5751-25G | |
| Copper(II) Sulfate Anhydrous | Sigma-Aldrich | 61230-500G-F | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Glycine | Ajax Finechem | 1083-500G | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin | Life Technologies | D-3312 | Diliuted in distilled water |
| Isothesia | Provet | ISOF00 | 1000 mg/g Isoflurane inhalation vapour |
| Autoclip 9 mm Wound Clips | Texas Scientific Instruments, LLC | 205016 | |
| Lethabarb Enthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd. | LETHA450 | |
| Formaldehyde Solution | Ajax Finechem | A809-2.5L PL | |
| SuperFrost Plus glass slides | Menzel-Glaser | J1800AMNZ | |
| Ammonium Sulphide | Sigma-Aldrich | A1952 | Diluted to 10% |
| Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride) | Astrazenca | Diluted to 0.25% |
References
- Kaspar, B. K. Retrograde Viral Delivery of IGF-1 Prolongs Survival in a Mouse ALS Model. Science. 301 (5634), (2003).
- Ishiyama, T., Okada, R., Nishibe, H., Mitsumoto, H., Nakayama, C. Riluzole slows the progression of neuromuscular dysfunction in the wobbler mouse motor neuron disease. Brain Res. 1019 (1-2), 226-236 (2004).
- Turner, B. J., Parkinson, N. J., Davies, K. E., Talbot, K. Survival motor neuron deficiency enhances progression in an amyotrophic lateral sclerosis mouse model. Neurobiol Dis. 34 (3), 511-517 (2009).
- Wegorzewska, I., Bell, S., Cairns, N. J., Miller, T. M., Baloh, R. H. TDP-43 mutant transgenic mice develop features of ALS and frontotemporal lobar degeneration. P Natl Acad Sci USA. 106 (44), 18809-18814 (2009).
- Kimura, E., Li, S., Gregorevic, P., Fall, B. M., Chamberlain, J. S. Dystrophin delivery to muscles of mdx mice using lentiviral vectors leads to myogenic progenitor targeting and stable gene expression. Mol Ther. 18 (1), 206-213 (2009).
- Van Den Bosch, L. Genetic rodent models of amyotrophic lateral sclerosis. J Biomed Biotechnol. 2011 (6), 348765–11 (2011).
- Pratt, S. J. P., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles. J Physiol. 591 (Pt 2), 559-570 (2013).
- Garrett, C. A., et al. DYNC1H1 mutation alters transport kinetics and ERK1/2-cFos signalling in a mouse model of distal spinal muscular atrophy). Brain. 137 (Pt 7), 1883-1893 (2014).
- Bordet, T., et al. Protective effects of cardiotrophin-1 adenoviral gene transfer on neuromuscular degeneration in transgenic ALS mice). Hum Mol Gen. 10 (18), 1925-1933 (2001).
- Acsadi, G., et al. Increased survival and function of SOD1 mice after glial cell-derived neurotrophic factor gene therapy. Hum Gene Ther. 13 (9), 1047-1059 (2002).
- Azzouz, M., et al. VEGF delivery with retrogradely transported lentivector prolongs survival in a mouse ALS model. Nature. 429 (6990), 413-417 (2004).
- Suzuki, M., et al. Direct muscle delivery of GDNF with human mesenchymal stem cells improves motor neuron survival and function in a rat model of familial ALS. Mol Ther. 16 (12), 2002-2010 (2008).
- Benkhelifa-Ziyyat, S., et al. Intramuscular scAAV9-SMN Injection Mediates Widespread Gene Delivery to the Spinal Cord and Decreases Disease Severity in SMA Mice. Mol Ther. 21 (2), 282-290 (2013).
- Azzouz, M., Hottinger, A., Paterna, J. C., Zurn, A. D., Aebischer, P., Büeler, H. Increased motoneuron survival and improved neuromuscular function in transgenic ALS mice after intraspinal injection of an adeno-associated virus encoding Bcl-2. Hum Mol Gen. 9 (5), (2000).
- Lepore, A. C., Haenggeli, C., et al. Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS. Brain Res. 1185, 256-265 (2007).
- Schnapp, B. J., Reese, T. S. Dynein is the motor for retrograde axonal transport of organelles. Proc Natl Acad Sci USA. 86 (5), 1548-1552 (1989).
- Vale, R. D. The Molecular Motor Toolbox for Intracellular Transport. Cell. 112 (4), 467-480 (2003).
- Schiavo, G., Fainzilber, M. Cell biology: Alternative energy for neuronal motors. Nature. 495 (7440), 178-180 (2013).
- Gracies, J. -M., Lugassy, M., Weisz, D. J., Vecchio, M., Flanagan, S., Simpson, D. M. Botulinum Toxin Dilution and Endplate Targeting in Spasticity. A Double-Blind Controlled Study. Arch Phys Med Rehabil. 90 (1), 9-16 (2009).
- Van Campenhout, A., Molenaers, G. Localization of the motor endplate zone in human skeletal muscles of the lower limb: anatomical guidelines for injection with botulinum toxin. Dev Med Child Neurol. 53 (2), 108-119 (2011).
- Tosolini, A. P., Morris, R. Spatial characterization of the motor neuron columns supplying the rat forelimb. Neuroscience. 200, 19-30 (2012).
- Tosolini, A. P., Mohan, R., Morris, R. Targeting the full length of the motor end plate regions in the mouse forelimb increases the uptake of fluoro-gold into corresponding spinal cord motor neurons. Front Neurol. 4, 58 (2013).
- Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport. Neuroscience. 274, 318-330 (2014).
- Baumgartner, B. J., Shine, H. D. Neuroprotection of spinal motoneurons following targeted transduction with an adenoviral vector carrying the gene for glial cell line-derived neurotrophic factor. Exp Neurol. 153 (1), 102-112 (1998).
- Gransee, H. M., Zhan, W. -Z., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Targeted delivery of TrkB receptor to phrenic motoneurons enhances functional recovery of rhythmic phrenic activity after cervical spinal hemisection. PLoS ONE. 8 (5), e64755 (2013).
