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Neuroscience

मोटर एंड प्लेट्स साथ intramuscular इंजेक्शन: सीधे मोटर न्यूरॉन्स में शटल tracers करने के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव दृष्टिकोण

Published: July 13, 2015 doi: 10.3791/52846
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Translational Neuroscience Facility, School of Medical Sciences, University of New South Wales
* These authors contributed equally

Abstract

रीढ़ की हड्डी की मोटर न्यूरॉन्स की अखंडता को प्रभावित रोगों सबसे दुर्बल मस्तिष्क संबंधी शर्तों में से हैं। पिछले दशकों में, इन न्यूरोमस्कुलर विकारों के कई पशु मॉडल के विकास में देरी या इन शर्तों की प्रगति के पीछे के उद्देश्य से विभिन्न चिकित्सकीय स्थितियों के साथ वैज्ञानिक समुदाय प्रदान की गई है। न्यूरॉन्स की प्रतिगामी मशीनरी का लाभ लेने से, इन तरीकों में से एक रीढ़ की हड्डी मोटर न्यूरॉन्स इसी में शटल चिकित्सकीय जीन के क्रम में कंकाल की मांसपेशियों को लक्षित करने के लिए किया गया है। एक बार होनहार हालांकि, इस तरह के जीन डिलीवरी दृष्टिकोण की सफलता यह अब तक की उपज के लिए दिखाया गया है transduced मोटर न्यूरॉन्स के उप इष्टतम संख्या के द्वारा बाधा उत्पन्न की गई है। मोटर अंत प्लेट (MEPs) मोटर न्यूरॉन्स α रीढ़ की हड्डी को सीधा अन्तर्ग्रथनी संपर्क में हैं कि कंकाल मांसलता पर अति विशिष्ट क्षेत्रों के हैं। इस संबंध में, यह ध्यान रखें कि महत्वपूर्ण है, अब तक के प्रयासों प्रतिगमनपूर्वक करने के लिएमोटर न्यूरॉन्स में स्थानांतरण जीन लक्षित मांसपेशियों में एमईपी क्षेत्र के स्थान के संदर्भ के बिना किए गए थे। यहाँ, हम एक सरल प्रोटोकॉल 1) कंकाल की मांसपेशियों की सतह पर MEPs की सटीक स्थान प्रकट करने के लिए और 2) मोटर न्यूरॉन्स में इंट्रामस्क्युलर वितरण और प्रतिगामी tracers के बाद इष्टतम प्रतिगामी परिवहन मार्गदर्शन करने के लिए इस जानकारी का उपयोग करने के लिए का वर्णन है। हम MEPs की लक्ष्य-निर्धारण के माध्यम से रीढ़ की हड्डी मोटर न्यूरॉन्स के लिए चिकित्सकीय जीन की प्रतिगामी परिवहन की जांच में आगे के अध्ययन में इन अनुरेखण प्रयोगों से परिणाम का उपयोग करने की उम्मीद है।

Introduction

ऐसे मोटर न्यूरॉन बीमारी के रूप में मस्तिष्क संबंधी स्थितियों से परिणाम और spinal- कि स्वैच्छिक आंदोलन के रूप में अच्छी तरह से Duchenne पेशी शोष के नियंत्रण के नुकसान से प्रभावित व्यक्तियों के हर दिन के जीवन पर उच्च और लंबे समय तक चलने प्रभाव है कि एक गंभीर स्थिति है। पिछले दशक के दौरान, बंद या कम से कम इन न्यूरोमस्कुलर रोगों के हानिकारक प्रभाव में देरी करने के लिए लक्ष्य अनुसंधान प्रयासों दुनिया भर के कई चिकित्सकों और वैज्ञानिक के लिए एक प्राथमिकता रही है। इस संबंध में इन न्यूरोमस्कुलर रोगों की नकल है कि पशु मॉडलों की हाल की पीढ़ी इन शर्तों 1-13 के विकास और प्रगति अंतर्निहित शारीरिक तंत्र में मौलिक अंतर्दृष्टि प्राप्त करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। इन neuromuscular रोग के उपचार के लिए रीढ़ की हड्डी तक सीधी पहुंच की आवश्यकता है और रीढ़ की हड्डी में इंजेक्शन 14,15 के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। जीन थेरेपी में हाल के अग्रिमों भी ऊपरी की धारीदार मांसपेशियों को लक्षित किया है औररीढ़ की हड्डी 1,9-13 के उदर सींग के भीतर स्थित हैं कि इसी α मोटर न्यूरॉन्स के लिए शटल चिकित्सकीय जीन के निचले अंगों। बहरहाल, यह एक बार आशाजनक रणनीति इन स्नायविक शर्तों के परिणाम में सुधार करने के लिए विफल रही है। यह इन गरीब परिणामों हो सकता है कि समाप्त करने के लिए उचित है, कम से कम आंशिक रूप से, इन सुरक्षात्मक जीन की कम प्रभावकारिता के कारण हो, इनमें से एक जीन प्रसव के तरीके की कम प्रभावकारिता को अलग नहीं कर सकते हैं।

मोटर अंत प्लेट (MEPs) मोटर न्यूरॉन्स α से होने वाले बड़े परिधीय मोटर तंतुओं के अक्षतंतु टर्मिनलों से इंडेंट रहे हैं कि कंकाल myofibres के विशेष क्षेत्रों के हैं। साथ में, परिधीय तंत्रिका फाइबर अंत और MEPs यानी neuromuscular जंक्शन, अन्तर्ग्रथनी आवेगों न्यूरोट्रांसमीटर की अग्रगामी रिहाई, एसीटाइलकोलीन से शुरू हो रहे हैं, जहां साइट के रूप में। महत्वपूर्ण बात है, परिधीय तंत्रिका तंतुओं और MEPs के बीच के रिश्ते को द्वि-निदेशक हैराष्ट्रीय, विभिन्न मोटर्स के साथ ही दूर न्यूरॉन से की दिशा में अणुओं और organelles के परिवहन के लिए जिम्मेदार हैं, हालांकि 16-18 somata। इन संरचनात्मक विचारों के प्रकाश में, MEPs के लिए इसी मोटर न्यूरॉन्स के लिए वितरण और आनुवंशिक सामग्री के बाद प्रतिगामी परिवहन के लिए विकल्प का लक्ष्य होना दिखाई देते हैं। इस संदर्भ में, यह मोटर न्यूरॉन पारगमन की सफलता बहुत वायरल वैक्टर और मांसपेशियों की MEPs के 19-20 की इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के बीच की दूरी पर निर्भर करता है कि आश्चर्य की बात नहीं है। हैरानी की बात है, हालांकि, प्रयोगशाला चूहा और माउस के myofibres पर एमईपी क्षेत्रों का सही स्थान है, पसंद की दो प्रजातियों न्यूरोमस्कुलर रोगों मॉडल करने के लिए, हाल ही में जब तक उपलब्ध नहीं थे।

हम चूहा और माउस 21-22 में कई forelimb की मांसपेशियों के लिए एमईपी क्षेत्र का व्यापक नक्शे का उत्पादन किया है। हाल ही में, हम एमईपी आर के संगठन के विवरण से पता चला हैमाउस hindlimb 23 के कई मांसपेशियों के लिए egion और हम वर्तमान में चूहे hindlimb पर MEPs की सुविधाओं का विश्लेषण कर रहे हैं। हमारे हाथ में, इन मांसपेशियों में पूरे एमईपी क्षेत्रों के लिए निर्देशित प्रतिगामी tracers का इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के पहले की रिपोर्ट से भी अधिक रीढ़ की हड्डी खंडों फैले हैं कि अधिक से लेबल मोटर न्यूरॉन्स को जन्म दिया है। यहाँ हम बाहरी सतह पर और साथ ही hindlimb की गहराई भर MEPs के स्थान का पता चलता है और माउस और चूहे दोनों में मांसपेशियों forelimb करने के लिए पिछले कुछ वर्षों में विकसित किया गया है कि प्रोटोकॉल उपस्थित थे।

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Protocol

यहाँ वर्णित सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं UNSW ऑस्ट्रेलिया के पशु की देखभाल और आचार समिति के साथ पालन किया और राष्ट्रीय स्वास्थ्य और पशु प्रयोगों के लिए चिकित्सा अनुसंधान परिषद ऑस्ट्रेलिया के नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया। इस प्रोटोकॉल में सभी प्रक्रियाओं प्रासंगिक पशु की देखभाल और आचार समिति की आवश्यकता के अनुसार किया जाना चाहिए।

1. एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ histochemical धुंधला

  1. एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें
    1. 0.1 एम फॉस्फेट बफर (पंजाब) के 200 मिलीलीटर के लिए Acetylthiocholine आयोडाइड की 290 मिलीग्राम जोड़ें। 900 rpm पर एक चुंबकीय उत्तेजक साथ मिलाएं।
    2. निरंतर क्रियाशीलता के तहत ग्लाइसिन के 600 मिलीग्राम जोड़ें।
    3. उत्पाद पूरी तरह से भंग कर रहा है धीरे धीरे जब तक निरंतर क्रियाशीलता के तहत प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए कॉपर सल्फेट के 420 मिलीग्राम जोड़ें।
  2. पशु शव पर त्वचा निकालें चीरों बनाकर (ऊतक बंटवारे के माध्यम से प्राप्त)एक perfused चूहे या माउस की त्वचा, गर्दन क्षेत्र से त्वचा लोभी और अपने पैरों अतीत इसे खींच में। प्रत्येक पेशी को कवर प्रावरणी हटा दिया है या काफी प्रतिक्रिया समाधान के लिए मांसपेशी फाइबर की पर्याप्त प्रदर्शन सुनिश्चित करने के लिए छिद्रित है कि या तो सुनिश्चित करें।
  3. प्रतिक्रिया मिश्रण में पूरे शरीर या हित के अंग को विसर्जित कर दिया और 4 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते हैं।
  4. आसुत जल में 2 मिनट के लिए शव को धो लें। नोट: इस स्तर पर, मांसपेशियों को एक नीले रंग की रंगाई और मोटर अंत प्लेट (MEPs) सफेद डॉट्स के रूप में देखा जा सकता है दिखा रहे हैं।
  5. 3-5 सेकंड के लिए एक 10% अमोनियम सल्फाइड समाधान के लिए शव को बेनकाब।
    नोट: मांसपेशी फाइबर तेजी से भूरे रंग बदल जाएगी और MEPs काले धब्बेदार डॉट्स के रूप में नमूदार हो जाएगा। प्रतिक्रिया भी जल्दी होता है, और मांसपेशी फाइबर अमोनियम सल्फाइड समाधान (जैसे, 5%) की कम सांद्रता उपयोग करने की कोशिश MEPs और मांसपेशी फाइबर के बीच भेद करने के लिए भी अंधेरा दाग रहे हैं। प्रतिक्रिया समय प्राप्त करने के लिएMEPs और मांसपेशी फाइबर के बीच इष्टतम विपरीत एक नमूना से दूसरे से भिन्न होती है। इसलिए यह अभिकर्मक करने के लिए सही लोगों तक पहुंचाने के समय को परिभाषित करना कठिन है। प्रतिक्रिया बारीकी से नजर रखी है और इसके विपरीत पर्याप्त समझा जाता है जब बंद कर दिया जाना चाहिए।
  6. आसुत जल में आंदोलन के साथ, शव दो बार धोएं और धीरे शव पॅट सूखी।
  7. तस्वीर हित के सभी मांसपेशियों के लिए MEPs के कब्जा कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के अंग के पार्श्व और औसत दर्जे का पहलुओं, दोनों।

2. intramuscular इंजेक्शन मोटर समाप्ति प्लेट्स पर

  1. एक micropipette खींचने के साथ कांच micropipettes खींचो (plungers के साथ वर्गीकृत micropipettes के उपयोग की सिफारिश की है)। एक विदारक माइक्रोस्कोप की मदद से, micropipette की लुमेन के आंतरिक व्यास लगभग 0.5 मिमी है कि इस तरह के संदंश की एक जोड़ी के साथ micropipettes के सुझावों को तोड़ने।
  2. प्रयुक्त सभी शल्य चिकित्सा उपकरण हौसले autoclaved और वें रहे हैं कि यह सुनिश्चित करेंशल्य चिकित्सा के क्षेत्र में बाँझ है।
  3. फ्लोरो-गोल्ड (आसुत जल में 5%) के साथ micropipettes भरें।
  4. Isofluorane (ओ 2 में 4%) के साथ एक प्रेरण कक्ष में पशु में चतनाशून्य करना प्रेरित। पलटा को ठीक करने के लिए जाँच करें और प्रेरण कक्ष से हटाने से पहले अपनी अनुपस्थिति सुनिश्चित करते हैं। चूहे के थूथन पर एक नाक शंकु को सुरक्षित और संज्ञाहरण के रखरखाव के लिए isofluorane (ओ 2 में 2%) देने के लिए। जानवर के पैर की उंगलियों चुटकी और धीरे पेडल वापसी और corneal सजगता दोनों अनुपस्थित रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए पशु की आंख को छूने। नोट: ketamine और xylazil का एक मिश्रण का भी इस्तेमाल किया जा सकता है (80 और 10 मिलीग्राम / किग्रा, क्रमशः intraperitoneally दिया)। Ketamine एक अनुसूची 8 ("नियंत्रित") दवा और का पालन करना होगा दवा की खरीद, उपयोग, भंडारण और निपटान के साथ जुड़े आवश्यक प्रोटोकॉल है।
  5. प्रक्रिया के दौरान आंखों के सूखने को रोकने के लिए नेत्र स्नेहक लागू करें।
  6. टी दाढ़ीargeted अंग और उपयोग धुंध तीन chlorhexidine की बारी scrubs और 70% शराब के साथ मुंडा क्षेत्र साफ करने के लिए। शल्य चिकित्सा के क्षेत्र के लिए पशु स्थानांतरण।
  7. एक साफ Underpad पर पशु रखें और लक्षित मांसपेशी (एस) के लिए अच्छा उपयोग सुनिश्चित करने के लिए उचित रूप से यह स्थिति।
  8. दूर अंतर्निहित मांसलता से लक्षित पेशी पर त्वचा उठा और शल्य कैंची के साथ त्वचा में एक चीरा बनाने के लिए दांत पकड़ के साथ संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें। चीरा पूरी तरह से ब्याज की मांसपेशी (ओं) को बेनकाब करने के लिए काफी बड़ी है कि सुनिश्चित करें। प्रावरणी के लिए न्यूनतम विघटन है कि वहाँ सुनिश्चित करें।
  9. मानसिक रूप से पेशी (एस) पर एमईपी क्षेत्र का स्थान और आकार स्थानांतरित करने के लिए एमईपी तस्वीरों का प्रयोग करें।
    नोट: एक ठीक लगा मार्कर ब्याज की मांसपेशी (एस) पर तस्वीर से एमईपी क्षेत्र को पुन: पेश करने के लिए सहायता कर सकता है।
  10. प्रत्येक एस 1-2 μl के 3 से 4 इंजेक्शन, फ्लोरो-गोल्ड के लिए (एमईपी क्षेत्र की पूरी लंबाई के साथ कई इंजेक्शन सम्पन्नHould) के लिए पर्याप्त हो। धीरे किसी भी टपका को दूर करने के लिए पेशी (एस) के पोंछे।
  11. करीब एक साथ कुंद संदंश के साथ छिन्न त्वचा के दोनों सिरों को ले आओ और शल्य क्लिप के साथ घाव बंद कर दें। घाव की संपूर्ण अवधि के साथ 0.1 मिलीलीटर Bupivacaine (पानी में 0.5%) (या अन्य स्थानीय निश्चेतक) घुसपैठ।
  12. बंद संवेदनाहारी मशीन चालू करें और यह पूरी तरह से संज्ञाहरण से बरामद किया है जब तक कि जानवर की निगरानी।
  13. इंट्रा-पेशी इंजेक्शन के प्रशासन और जानवरों के छिड़काव के बीच 14 दिनों के लिए प्रतीक्षा करें।

3. Perfusions

  1. Intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा पशु करने के लिए, (150 मिलीग्राम / किग्रा जैसे Lethabarb) pentobarbitone सोडियम समाधान का एक घातक खुराक प्रशासन।
    1. पेडल वापसी के अभाव और corneal सजगता से इसकी पुष्टि के रूप में संज्ञाहरण के एक गहरे स्तर तक पहुँच जाता है जब तक बारीकी से पशु की निगरानी।
  2. एक perfusio पर रखा एक विदारक बोर्ड पर अपनी पीठ पर पशु स्थित करेंएन सिंक।
  3. उरोस्थि के आधार कवर त्वचा लिफ्ट करने के लिए दांत पकड़ के साथ संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें। तुरंत उरोस्थि के नीचे मजबूत शल्य कैंची की एक जोड़ी के साथ एक छोटे से त्वचा चीरा और फिर पकड़ के लिए उरोस्थि के असिरूप उपास्थि संदंश का उपयोग करें। असिरूप उपास्थि धारण करते हुए, कांख के लिए उरोस्थि से, छाती गुहा के दोनों किनारों पर चीरा बढ़ाना है।
  4. दिल को बेनकाब करने के लिए डायाफ्राम काटें।
    1. रक्त की जमावट को रोकने के लिए सीधे दिल के शीर्ष में हेपरिन की 0.ml इंजेक्षन।
    2. बाएं वेंट्रिकल में एक प्रवेशनी की प्रविष्टि की अनुमति के लिए सुप्रीम काटा, और फिर जल्दी से एक haemostat की सहायता के साथ जगह में प्रवेशनी दबाना।
    3. ठीक कैंची की एक जोड़ी के साथ सही प्रांगण में एक चीरा और तुरंत क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप शुरू करते हैं। अलिंद से बाहर बहने तरल रक्त के लगभग स्वतंत्र है और जिगर का रंग हल्के भूरे रंग हो जाता है जब तक 0.1 एम पंजाब के साथ छिड़कना। फिर, एक समाधान के साथ छिड़कनापशु के पूरे शरीर जब तक paraformaldehyde (0.1 एम पंजाब में 4%) की tion के कठोर हो जाता है।

4. ग्रीवा रीढ़ की हड्डी विच्छेदन और प्रोटोकॉल के लिए तैयारी

  1. अपने पेट पर पशु शव निर्धारित करना।
  2. एक स्केलपेल के साथ शरीर की midline पर त्वचा में कटौती और श्रोणि अस्थि के स्तर पर खोपड़ी के आधार से यह दर्शाते हैं।
  3. के माध्यम से कट और कशेरुका स्तंभ के पृष्ठीय पहलू का पर्दाफाश करने के paravertebral मांसपेशियों को दर्शाते हैं।
  4. एटलस, दूसरा ग्रीवा खंड (यानी, सी 2) की बोनी spinous प्रक्रिया को पहचानें, और इसी अंतर्निहित पृष्ठीय रूट का पता लगाने के लिए शल्य चिकित्सा Rongeurs या संदंश की एक जोड़ी के साथ इसे हटा दें।
    1. एक स्थायी लगा मार्कर के साथ यह रंग से सही सी 2 जड़ को पहचानें।
    2. एक एक करके अगले कशेरुकाओं एक निकालें और रंग से रंग (यानी, सी 2, सी 4, सी 6, सी 8 और हरे और सी 3 में रंग का हो सकता है के साथ सही पृष्ठीय जड़ों के निशान, सी 5, सी 7, T1 के कर्नल किया जा सकता हैored नीले रंग में)।
  5. एक छोटी सी शल्य चिकित्सा सुई का प्रयोग करें (उदाहरण के लिए, 30 ग्राम गेज सुई) को धीरे पियर्स रीढ़ की हड्डी के निचले सिरे को कवर ड्यूरा के माध्यम से। एक अनुदैर्ध्य भट्ठा बनाने के लिए rostrally सुई घूम रहा है, जबकि सामना करना पड़ रहा सुई के उठाव के साथ, हड्डी से दूर ड्यूरा उठा।
    1. ड्यूरा दर्शाते हैं।
  6. एक नए स्केलपेल ब्लेड के साथ एक या दो खंड ब्लॉकों में रीढ़ की हड्डी transversally काटें।
    1. ध्यान से दो आसन्न जड़ों के बीच स्केलपेल ब्लेड से आधे रास्ते के साथ प्रत्येक ब्लॉक के बाईं ओर एक छोटा सा मापकला छाप बनाने, प्रत्येक ब्लॉक के लिए, बगल में रीढ़ की हड्डी खंडों छोड़ दो और। ब्लॉक के उदर पहलू से दिखाई करने के लिए के रूप में मापकला निशान ऊतकों के माध्यम से काफी गहरी है कि सुनिश्चित करें। विच्छेदन निम्नलिखित ऊतक खंड के अभिविन्यास में सहायता करने के लिए, पशु शरीर रचना विज्ञान के संबंध में या तो पूर्व से या पीछे की ओर इशारा करते हैं, लगभग 45 डिग्री के कोण पर मापकला निशान बनाओ।
  7. Paraformaldehyde (0.1 एम पंजाब में 4%) का एक समाधान युक्त छोटे, स्पष्ट रूप से लेबल की बोतलों में अलग-अलग ब्लॉक लीजिए और आर टी ओ / एन पर छोड़ दें।
  8. सुक्रोज (0.1 एम पंजाब में 30%) का एक समाधान युक्त साफ, स्पष्ट रूप से लेबल की बोतलों में ब्लॉक स्थानांतरण और कम से कम दो दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं।
  9. क्रायो-नए नए साँचे में खंडों प्लेस और ऊतक ठंड माध्यम के साथ उन्हें कवर किया। अनुदैर्ध्य ऊतकीय तैयारी के लिए, ऊपर का सामना करना पड़ पृष्ठीय पहलू के साथ ब्लॉक पूरबी और क्रायो-नए नए साँचे में ब्लॉक उन्मुख करने के लिए मापकला निशान का उपयोग करें।
  10. -20 डिग्री सेल्सियस पर क्रायो-नए साँचे रुक और 50 माइक्रोन मोटी वर्गों में एक cryostat के साथ काटा। नोट: वर्गों सीधे आसंजन खुर्दबीन स्लाइड पर घुड़सवार और / एन ओ सुखाने के लिए छोड़ा जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, वर्गों 0.1 एम पंजाब के साथ भरा 48 अच्छी तरह से प्लेट में जारी किया जा सकता है और बाद में स्लाइड पर ऊतक वर्गों उन्मुख करने के लिए मापकला चिह्न का उपयोग मुहिम शुरू की।

5. काठ का रीढ़ की सहआरडी विच्छेदन और प्रोटोकॉल के लिए तैयारी

  1. यह वापस आ गया है पर पशु शव निर्धारित करना।
  2. जानवर के पेट के साथ एक midline चीरा प्रदर्शन और विसरा को हटा दें। कशेरुका स्तंभ के उदर पहलू का पर्दाफाश करने के पीछे पेट की दीवार की मांसपेशियों को काटना।
  3. T13 उदर जड़ हड्डी बाहर निकल जाता है, जहां कम दुम सबसे पसली और उसके आसपास T13 बांस का पता लगाएँ।
    1. लगातार T13 के लिए एक से दो या तीन कशेरुकाओं व्याख्यान चबूतरे वाला एक को दूर (यानी, T12, T11 और यदि आवश्यक हो तो, T10) ठीक शल्य Rongeurs साथ उदर की हड्डी के उदर पहलू में प्रवेश की अपनी बात तक T13 उदर रूट का पालन करने के लिए और एक स्थायी लगा मार्कर के साथ यह निशान।
    2. पर इस बिंदु से, रंग से रंग के साथ उन्हें रंग, L1, L2, L3, L4, L5, L6 के और S1 के लिए उदर जड़ प्रवेश बिंदुओं के स्थान की पहचान करने के लिए एक ही प्रक्रिया दोहराएँ।
  4. Lum के लिए धारा 4.5-4.10 में वर्णित के रूप में एक ही प्रक्रिया का पालन करेंरीढ़ की हड्डी विच्छेदन बार।

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Representative Results

एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ histochemical धुंधला मांसपेशियों की चौड़ाई में मोटर अंत प्लेटों के स्थान का पता चलता है। 1 एक पूरी चूहा forelimb पर प्रदर्शन ऐसे धुंधला के परिणाम दिखाता है चित्रा। यह अमोनियम सल्फाइड समाधान की एकाग्रता का अनुकूलन करने के लिए सुझाव दिया है (उदाहरण के लिए।, 5-7% के बदले 10%) के रूप में अच्छी तरह से नमूना समाधान में डूब जाता है समय के रूप में की मांसपेशियों तंतुओं पर गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि धुंधला भी अगर अत्यधिक। चित्रा 2 एक माउस ट्राइसेप्स पेशी पेशी के मोटर अंत थाली क्षेत्र की लंबाई के साथ पतित न्यूरोनल ट्रेसर का एक इंजेक्शन के बाद गर्भाशय ग्रीवा रीढ़ की हड्डी में लेबल मोटर न्यूरॉन्स के एक स्तंभ दिखाता है। प्रतिगमनपूर्वक लेबल वाली मोटर न्यूरॉन्स आम तौर पर। रीढ़ की हड्डी के कई क्षेत्रों में फैली हुई है कि एक अनुदैर्ध्य स्तंभ फार्म 3 एसईएल के माध्यम से प्राप्त किया गया था कि लेबल वाली रीढ़ की हड्डी मोटर न्यूरॉन्स के विभिन्न संख्या दिखाता है चित्राट्राइसेप्स पेशी में मोटर अंत प्लेट क्षेत्र के लक्षित कर ective फ्लोरो-गोल्ड। एमईपी क्षेत्र के विशिष्ट डिब्बों को लक्षित करने के लिए विरोध के रूप में अधिक से अधिक तेज, एमईपी क्षेत्र की संपूर्ण अवधि में प्रसव के बाद मनाया गया।

चित्र 1
चित्रा 1: मोटर समाप्ति प्लेटों के लिए एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ histochemical धुंधला के बाद चूहा के पार्श्व forelimb के दृश्य (ए) के पहले और अमोनियम सल्फाइड समाधान करने के लिए (बी) के प्रदर्शन के बाद। (ए) में, मोटर अंत प्लेटें मांसपेशी फाइबर एक हरे-नीले रंग को अपनाने, जबकि मांसपेशियों की पूरी चौड़ाई को पार कि एक सतत लाइन फार्म कि सफेद धब्बेदार डॉट्स के रूप में स्पष्ट कर रहे हैं। (बी) में, एक ही forelimb अमोनियम सल्फाइड समाधान में विसर्जन के बाद प्रस्तुत किया है। अमोनियम सल्फाइड समाधान में विकास के बाद, मोटर अंत प्लेटें टीयूभूरे रंग की मांसपेशी फाइबर अधिक आर.एन. काला। आंकड़ों के दोनों भागों में तीर (1) Acromiotrapezius, (2) Spinodeltoideus और (3) Triceps पेशी के लिए मोटर अंत प्लेटों के स्थान को इंगित।

चित्र 2
चित्रा 2:। फ्लोरो-गोल्ड लेबल मोटर न्यूरॉन्स WM खुलासा सरवाइकल स्तर पर रीढ़ की हड्डी के उदर हॉर्न के माध्यम से 50 माइक्रोन अनुदैर्ध्य धारा की photomicrographs सफेद पदार्थ का प्रतिनिधित्व करता है और जीएम रीढ़ की हड्डी के ग्रे मैटर का प्रतिनिधित्व करता है। धराशायी लाइन आकृति में मनाया रीढ़ की हड्डी अनुभाग के भीतर ग्रे और सफेद पदार्थ के बीच सीमा को इंगित करता है। इनसेट ही फिल्टर के तहत 20X उद्देश्य से लिया गया था जबकि सूक्ष्मदर्शीफ़ोटोग्राफ़ DAPI के फिल्टर के तहत एक 10x उद्देश्य के साथ लिया गया था। दोनों पैनलों में, फ्लोरो-गोल्ड लेबलिंग समीपस्थ अक्षतंतु / dendriti के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मोटर न्यूरॉन कोशिका द्रव्य में मनाया जा सकता हैसी प्रक्रियाओं। के रूप में मूल रूप से Tosolini एट अल में प्रकाशित आंकड़ा। माउस Forelimb में मोटर अंत प्लेट क्षेत्र की पूरी लंबाई का लक्ष्य निर्धारण (2013) रीढ़ की हड्डी मोटर न्यूरॉन्स मोर्चा इसी में फ्लोरो-गोल्ड के तेज बढ़ जाती है। न्यूरोल। 04:58। Doi: 10.3389 / fneur.2013.00058

चित्र तीन
चित्रा 3:। चयनात्मक फ्लोरो-गोल्ड Triceps brachii में मोटर अंत प्लेट क्षेत्र और रीढ़ की हड्डी मोटर न्यूरॉन्स में जिसके परिणामस्वरूप लेबलिंग का लक्ष्य निर्धारण (ए) ट्राइसेप्स पेशी तंतुओं पर मोटर अंत प्लेटों के स्थान के एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व है। व्यक्तिगत रूप से निशाना बनाया गया है कि एमईपी क्षेत्र के तीन अलग अलग वर्गों, हरे, लाल और नीले रंग की डॉट्स द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। नीले डॉट्स represe whilst के हरे और लाल डॉट्स, क्रमश: पूरे एमईपी क्षेत्र के पूर्वकाल और कूल्हों हिस्सों का प्रतिनिधित्वपेशी के पेट में FG की सांस में इंजेक्शन के स्थान NT। दो सिरों वाले तीर एक पूर्वकाल-पीछे अक्ष में पेशी orientates। (बी) (ए) में संकेत के रूप में, ट्राइसेप्स पेशी के एमईपी क्षेत्र के विभिन्न वर्गों के चुनिंदा लक्ष्य-निर्धारण निम्न प्राप्त लेबलिंग illustrating एक समग्र चित्र है। (बी) में प्रत्येक डॉट एक एकल लेबल वाली मोटर न्यूरॉन का प्रतिनिधित्व करता है। काला स्तंभ ठेठ लेबलिंग के प्रतिनिधि पेशी के एमईपी क्षेत्र की संपूर्ण अवधि में FG के निम्नलिखित इंजेक्शन मनाया जाता है। हरे रंग की मोटर न्यूरॉन स्तंभ पेशी के पूर्वकाल छमाही में FG के इंजेक्शन निम्नलिखित प्राप्त है जबकि लाल मोटर न्यूरॉन स्तंभ, मांसपेशियों के पीछे आधे में FG के इंजेक्शन निम्नलिखित प्राप्त की है। नीले स्तंभ के द्वारा प्रदर्शन के रूप में पेशी के "पेट" के लिए प्रतिबंधित इंजेक्शन, रीढ़ की हड्डी क्षेत्रों में से केवल एक छोटी संख्या में मोटर न्यूरॉन्स झुकेंगे। मूल रूप से प्रकाशित कर के रूप में चित्राTosolini एट अल में एड। माउस Forelimb में मोटर अंत प्लेट क्षेत्र की पूरी लंबाई का लक्ष्य निर्धारण (2013) रीढ़ की हड्डी मोटर न्यूरॉन्स मोर्चा इसी में फ्लोरो-गोल्ड के तेज बढ़ जाती है। न्यूरोल। 04:58। Doi: 10.3389 / fneur.2013.00058

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Discussion

Intramuscular लक्ष्य-निर्धारण और neuromuscular हालत की प्रयोगात्मक उपचार के लिए इसी α मोटर न्यूरॉन्स के लिए चिकित्सकीय transgenes के बाद प्रतिगामी स्थानांतरण एक नई रणनीति नहीं है। उदाहरण के लिए, इस वितरण पद्धति SOD1 चूहों और चूहों 1,9-12 में ए एल एस प्रगति के विभिन्न चरणों में हैं और साथ ही एसएमए 13 के साथ चूहों में न्यूरोमस्कुलर अध: पतन देरी करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। होनहार जबकि, इन जीन थेरेपी परिदृश्यों की प्रभावकारिता सीमित किया गया है। इस संबंध में, हम रीढ़ की हड्डी मोटर न्यूरॉन्स द्वारा transgenes की तेज मांसपेशी फाइबर पर मोटर अंत प्लेटों के चुनिंदा लक्ष्यीकरण द्वारा सुधार किया जा सकता है कि प्रस्ताव। यह उपर्युक्त अध्ययन में, वायरल वैक्टर इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन लक्षित मांसपेशियों में एमईपी क्षेत्र के स्थान के संदर्भ के बिना प्रदर्शन किया गया, कि नोट करना महत्वपूर्ण है।

मोटर अंत प्लेटों के वितरण के हमारे विश्लेषण के दौरानHindlimb और forelimb के (MEPs), कुछ सिद्धांतों में उभरा है। सबसे पहले, एमईपी क्षेत्र एक मांसपेशी की पूरी चौड़ाई में फैला है। इसके अलावा, MEPs के लगातार myofibres की दिशा के संबंध के साथ orthogonally गठबंधन कर रहे हैं। विशेष रूप से, एमईपी क्षेत्र हमेशा मांसपेशियों की बड़ी से बड़ी हिस्से के भीतर स्थित नहीं है, एक क्षेत्र को अक्सर 'पेट' के रूप में करने के लिए भेजा और कहा कि अक्सर सांस में इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन का लक्ष्य है। यह वर्तमान विश्लेषण 21 चूहे C57BL6 माउस 22-23 और लांग इवांस पर आयोजित की गई और यह MEPs की वितरण जानवरों के इन दो नस्लों में से प्रत्येक के भीतर संरक्षित है कि पाया गया था कि ध्यान देने योग्य है। हालांकि, एमईपी वितरण एक ही प्रजाति के भीतर जानवरों के विभिन्न प्रकारों के बीच संरक्षित है या नहीं, प्रलेखित किया जाना बाकी है।

मूल रूप से, हम छोटे, एमयूएल का मार्गदर्शन करने के क्रम में forelimb और hindlimb के कई मांसपेशियों के लिए एमईपी क्षेत्र के पांच दस्तावेज हैपतित न्यूरोनल ट्रेसर फ्लोरो-गोल्ड की tiple इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन। ये एमईपी नक्शे मोटर न्यूरॉन्स में शटल ट्रांसजीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस तरह के उदाहरण में, हालांकि, यह प्रयोग किया जाता वायरस के प्रकार (उदाहरण के लिए।, Adenovirus, lentivirus, आदि) अपनी सीरोटाइप साथ ही इसकी अनुमापांक के अनुसार इंजेक्शन की मात्रा समायोजित करने के लिए महत्वपूर्ण है। प्रावरणी बरकरार रखते हुए ब्याज की मांसपेशी (एस) की सीमा के भीतर ही सीमित वायरस रखने के लिए एक अच्छा तरीका है। मोटर न्यूरॉन्स के नकली अभिकर्मक से बचने के लिए एक अन्य तरीका पड़ोसी की मांसपेशियों धीरे इंजेक्शन के बाद मांसपेशियों की सतह साफ करने के लिए है innervating। लक्षित मांसपेशी की आपूर्ति मोटर न्यूरॉन्स के पूल के भीतर यह युक्त तुलना में अधिक प्रासंगिक हो सकता है पारगमन के उच्च स्तर को प्राप्त करने में जहां इन सावधानियों कुछ प्रयोगात्मक डिजाइन में अप्रासंगिक हो सकता है। फिर भी, वे स्पष्ट सुरक्षा कारणों के लिए अच्छा अभ्यास कर रहे हैं। एक से अधिक पृथक मांसपेशियों को इंजेक्ट किया जा करने की जरूरत है, तो यह संभव हो, का चयन करने के लिए, बुद्धिमान हो सकते हैंत्वचा चीरा के आकार को कम करने के लिए एक दूसरे के करीब हैं कि मांसपेशियों के एक समूह। चूहों और चूहों (, नहीं की मांसपेशियों से जुड़ी अर्थात।) बहुत ढीली त्वचा है, तो यह बहुत बड़ा त्वचा चीरों प्रदर्शन करने के लिए बिना कई मांसपेशियों को लक्षित करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है।

आदर्श रूप में, इस तरह के चिकित्सा रीढ़ की हड्डी मोटर न्यूरॉन्स की पूरी आबादी को भर में लाभकारी जीन स्थानांतरण होगा, के रूप में न्यूरॉन्स की प्रतिगामी मशीनरी का उपयोग कर ए एल एस और अन्य न्यूरोमस्कुलर स्थितियों के लिए प्रभावी जीन थेरेपी एक चुनौती बनी हुई है। हालांकि, यह इस तरह के एक Neurotrophins के रूप में ब्याज की चिकित्सीय जीन एक स्रावी प्रोटीन कोडिंग है अगर पारगमन के सतत स्तर को प्राप्त करने के लिए सभी मोटर न्यूरॉन्स को लक्षित करने के लिए आवश्यक नहीं है। Transduced किया गया है कि उन लोगों के पास दरअसल, गैर transduced मोटर न्यूरॉन्स एक पैराक्राइन तंत्र 24 के माध्यम से Neurotrophins की बहिर्जात अणुओं भली दिखाया गया है। इस 'दर्शक' प्रभाव बहुत effi को बढ़ाता हैमोटर न्यूरॉन्स इसी में शटल स्रावी प्रोटीन एन्कोडिंग जीनों को लक्षित कर इंट्रामस्क्युलर की cacy। दूसरी ओर, श्वसन नियंत्रण के नुकसान ए एल एस में मौत का परम कारण है कि इस तथ्य को देखते हुए चिकित्सीय वायरल निर्माणों की इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन पसलियों के बीच मांसपेशियों 1 में प्रदर्शन किया जा सकता है या intrapleurally 25 सांस लेने में शामिल मोटर न्यूरॉन्स की रक्षा के लिए। आसानी से कंकाल की मांसपेशियों पर MEPs के स्थान और संगठन को उजागर करने के लिए एक विधि का वर्णन करके, वर्तमान प्रोटोकॉल न्यूरोमस्कुलर रोग के लिए उपन्यास जीन थेरेपी रणनीतियों का पता लगाने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण साबित होगा। इस प्रोटोकॉल भी इन निचले मोटर न्यूरॉन रोगों में neuromuscular जंक्शन की अखंडता की रक्षा करने के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव तरीका प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा।

Acknowledgments

इस काम के आरएम करने के लिए एक राष्ट्रीय स्वास्थ्य व चिकित्सा अनुसंधान केंद्र (NHMRC) परियोजना अनुदान द्वारा समर्थित किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluoro-Gold Fluorochrome, LLC Nil Diluted to 5%
Drummond PCR Micropipets 1-10 µl Drummond Scientific 5-000-1001-X10 accompanied with plungers
Acetylthiocholine Iodide Sigma Life Science A5751-25G
Copper(II) Sulfate Anhydrous Sigma-Aldrich 61230-500G-F
Tissue-Tek O.C.T Compound Sakura Finetek 25608-930
Glycine Ajax Finechem 1083-500G
Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin Life Technologies D-3312 Diliuted in distilled water
Isothesia Provet ISOF00 1000 mg/g Isoflurane inhalation vapour
Autoclip 9 mm Wound Clips Texas Scientific Instruments, LLC 205016
Lethabarb Enthanasia Injection Virbac (Australia) Pty Ltd. LETHA450
Formaldehyde Solution Ajax Finechem A809-2.5L PL
SuperFrost Plus glass slides Menzel-Glaser J1800AMNZ
Ammonium Sulphide Sigma-Aldrich A1952 Diluted to 10%
Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride) Astrazenca Diluted to 0.25%

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तंत्रिका जीव विज्ञान अंक 101 मोटर न्यूरॉन्स मोटर अंत प्लेटें प्रतिगामी परिवहन धारीदार मांसपेशियों माउस चूहा hindlimb forelimb
मोटर एंड प्लेट्स साथ intramuscular इंजेक्शन: सीधे मोटर न्यूरॉन्स में शटल tracers करने के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव दृष्टिकोण
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Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons. J. Vis. Exp. (101), e52846, doi:10.3791/52846 (2015).

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