Abstract
Malattie che colpiscono l'integrità dei neuroni motori del midollo spinale sono tra le condizioni neurologiche più debilitanti. Durante gli ultimi decenni, lo sviluppo di diversi modelli animali di questi disturbi neuromuscolari ha fornito alla comunità scientifica con differenti scenari terapeutiche volte a ritardare o invertire la progressione di queste condizioni. Sfruttando la macchina retrograda dei neuroni, uno di questi approcci è stata quella di indirizzare i muscoli scheletrici, al fine di navetta geni terapeutici in corrispondenti motoneuroni del midollo spinale. Anche se una volta promettente, il successo dell'approccio consegna tale gene è stata ostacolata dal numero non ottimale dei motoneuroni trasdotte che finora ha dimostrato di cedere. Piastre terminali Motor (MEP) sono regioni altamente specializzati sulla muscolatura scheletrica che sono in contatto sinaptico diretto al midollo spinale α motoneuroni. A questo proposito, è importante notare che, finora, gli sforzi per retrogradotrasferimento di geni in neuroni motori sono stati effettuati senza riferimento alla posizione della regione MEP nei muscoli mirati. Qui, descriviamo un semplice protocollo 1) per rivelare la posizione esatta dei deputati sulla superficie dei muscoli scheletrici e 2) di utilizzare queste informazioni per guidare la consegna intramuscolare e successivo trasporto retrogrado ottimale di traccianti retrogradi in neuroni motori. Ci auguriamo di poter utilizzare i risultati di questi esperimenti che tracciano in ulteriori studi in indagando trasporto retrogrado di geni terapeutici per spinale neuroni motori cavo attraverso la destinazione dei deputati.
Introduction
La perdita di controllo del movimento volontario che deriva da condizioni neurologiche come la malattia del motoneurone e spinal- nonché Duchenne atrofia muscolare è una condizione debilitante che ha un impatto elevato e duraturo sulla vita quotidiana di individui affetti. Negli ultimi dieci anni, gli sforzi di ricerca volti a fermare o almeno ritardare gli effetti deleteri di queste malattie neuromuscolari è stata una priorità per molti medici e scienziati di tutto il mondo. A questo proposito, la recente generazione di modelli animali che imitano queste malattie neuromuscolari è stato determinante per ottenere intuizioni fondamentali sui meccanismi fisiologici alla base dello sviluppo e la progressione di queste condizioni 1-13. Il trattamento di queste malattie neuromuscolari richiede l'accesso diretto al midollo spinale e può essere ottenuto mediante iniezioni spinali 14,15. I recenti progressi nella terapia genica hanno mirato i muscoli striati del superiore earti inferiori a navetta geni terapeutici ai corrispondenti motoneuroni α che si trovano all'interno del corno ventrale del midollo spinale 1,9-13. Tuttavia, questa strategia una volta promettente non è riuscita a migliorare il risultato di queste condizioni neurologiche. Mentre è giusto concludere che questi poveri risultati potrebbero essere, almeno in parte, essere attribuibile alla bassa efficacia di questi geni protettivi, non si può escludere la scarsa efficacia di questi metodi di trasferimento genico.
Piastre laterali del motore (deputati) sono regioni specializzate delle miofibre scheletriche che sono rientrati dai terminali degli assoni di fibre motorie periferiche di grandi dimensioni provenienti da α motoneuroni. Insieme, le terminazioni delle fibre nervose periferiche e gli eurodeputati formano la giunzione neuromuscolare, cioè il luogo in cui gli impulsi sinaptici sono attivati dal rilascio anterograda del neurotrasmettitore, l'acetilcolina. È importante sottolineare che il rapporto tra le fibre nervose periferiche e gli eurodeputati è bi-tivazionale, anche se diversi motori sono responsabili per il trasporto di molecole e organelli verso e via dal neurone somata 16-18. Alla luce di queste considerazioni anatomiche, i deputati sembrano essere gli obiettivi di scelta per la consegna e il successivo trasporto retrogrado di materiale genetico alle corrispondenti motoneuroni. In questo contesto, non è sorprendente che il successo del motoneurone trasduzione dipende molto dalla distanza tra l'iniezione intramuscolare di vettori virali e europei del muscolo 19-20. Sorprendentemente, tuttavia, la posizione esatta delle zone MEP sulle miofibre di ratto e topo di laboratorio, le due specie di scelta per modellare malattie neuromuscolari, non erano disponibili fino a poco tempo.
Abbiamo prodotto le mappe complete della regione MEP per diversi muscoli degli arti anteriori nel ratto e nel topo 21-22. Più di recente, abbiamo mostrato i dettagli dell'organizzazione del deputato rEgion per diversi muscoli della arti posteriori del mouse 23 e stiamo attualmente analizzando le caratteristiche dei deputati sulla arti posteriori del ratto. Nelle nostre mani, iniezioni intramuscolari di traccianti retrogradi diretti alle intere zone MEP in questi muscoli hanno dato luogo a neuroni motori più marcati che si abbracciano segmenti del midollo spinale di più di quanto precedentemente riportato. Presentiamo qui il protocollo che è stato sviluppato negli ultimi anni per rivelare la posizione dei deputati sulla superficie esterna e per tutto lo spessore e hindlimb forelimb muscoli sia nel topo e nel ratto.
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Protocol
Tutte le procedure sperimentali qui descritte conformi alla Cura e Comitato Etico degli animali di UNSW Australia e sono stati eseguiti in conformità con il Servizio Sanitario Nazionale e il Medical Research Council of Australia regolamenti per la sperimentazione animale. Tutte le procedure di questo protocollo devono essere effettuate in conformità ai requisiti del proprio comitato Animal Care and Ethics.
1. Acetilcolinesterasi istochimica colorazione
- Preparare la miscela di reazione Acetilcolinesterasi
- Aggiungere 290 mg di acetiltiocolina ioduro a 200 ml di tampone fosfato 0,1 M (PB). Mescolare con un agitatore magnetico a 900 rpm.
- Aggiungere 600 mg di glicina sotto continua agitazione.
- Aggiungere lentamente 420 mg di solfato di rame alla miscela di reazione sotto agitazione continua fino a quando il prodotto è completamente sciolto.
- Togliere la pelle sulla carcassa animale (ottenuto attraverso la condivisione dei tessuti) facendo incisioninella pelle di un ratto o topo perfuso, afferrando la pelle dalla zona del collo e tirandolo oltre i suoi piedi. Assicurarsi che la fascia che copre ogni muscolo o è rimosso o significativamente forato per garantire un'ampia esposizione delle fibre muscolari alla soluzione di reazione.
- Immergere l'intero corpo o di un arto di interesse nella miscela di reazione e incubare O / N a 4 ° C.
- Lavare la carcassa per 2 minuti in acqua distillata. Nota: In questa fase, i muscoli mostrano una colorazione blu e le piastre terminali del motore (MEP) possono essere visti come punti bianchi.
- Esporre la carcassa ad una soluzione di solfuro di ammonio 10% per 3-5 sec.
Nota: Le fibre muscolari saranno ben presto diventano marroni e gli eurodeputati saranno osservabili come punti neri macchiati. Se la reazione avviene troppo rapidamente, e le fibre muscolari sono macchiati troppo buio per distinguere tra i deputati e le fibre muscolari provare utilizzando basse concentrazioni di soluzione di solfuro di ammonio (per esempio, 5%). Il tempo di reazione per ottenere laottimale contrasto tra i deputati e le fibre muscolari varia da un campione all'altro. Pertanto è difficile definire il tempo di esposizione esatta al reagente. La reazione deve essere attentamente monitorata e si fermò quando il contrasto è ritenuto adeguato. - Lavare la carcassa per due volte, con l'agitazione in acqua distillata e tamponare delicatamente la carcassa secca.
- Fotografia sia gli aspetti laterale e mediale degli arti, assicurando che i deputati europei per tutti i muscoli di interesse vengono catturati.
2. intramuscolare iniezioni alle piastre Motor End
- Tirare micropipette di vetro con un estrattore micropipetta (l'uso di micropipette graduate con pistoni è consigliato). Con l'aiuto di un microscopio da dissezione, rompere le punte delle micropipette con un paio di pinze in modo tale che il diametro interno del lume della micropipetta è circa 0,5 mm.
- Assicurarsi che tutti gli strumenti chirurgici utilizzati sono appena sterilizzati in autoclave e thnella zona chirurgica è sterile.
- Riempire le micropipette con Fluoro-oro (5% in acqua distillata).
- Induce anestetizzare l'animale in una camera di induzione con isofluorano (4% in O 2). Verificare la presenza di riflesso di raddrizzamento e di garantire la sua assenza prima di rimuoverlo dalla camera di induzione. Fissare un cono sul muso del topo e fornire isofluorano (2% in O 2) per il mantenimento dell'anestesia. Pinch dita dei piedi degli animali e toccare delicatamente gli occhi dell'animale per garantire che sia il ritiro del pedale e i riflessi corneali sono assenti. Nota: Una miscela di ketamina e xylazil può essere utilizzato anche (80 e 10 mg / kg, rispettivamente, trasportato via intraperitoneale). La ketamina è un allegato 8 ("Controllo"), di droga e protocolli necessari connessi con l'acquisto, l'uso, lo stoccaggio e lo smaltimento del farmaco dovrà essere rispettato.
- Applicare lubrificante occhio per evitare l'essiccazione degli occhi nel corso del procedimento.
- Shave il tarto argeted e uso garza per pulire la zona rasata con tre scrub alternati di clorexidina e il 70% di alcol. Trasferire l'animale per l'area chirurgica.
- Posto l'animale su un underpad pulito e posizionarla in modo appropriato per garantire un buon accesso al muscolo (s) mirato.
- Utilizzare un paio di pinze con le prese dente per sollevare la pelle sopra il muscolo mirato dalla muscolatura sottostante e fare un'incisione nella pelle con le forbici chirurgiche. Assicurarsi che l'incisione è abbastanza grande per esporre completamente i muscoli (s) di interesse. Assicurarsi che vi sia il minimo disturbo per la fascia.
- Utilizzare le fotografie MEP per trasporre mentalmente la posizione e la forma della regione MEP sul muscolo (s).
Nota: un pennarello multa potrebbe aiutare a riprodurre la regione eurodeputato dalla fotografia sul muscolo (s) di interesse. - Eseguire iniezioni multiple lungo la lunghezza della regione MEP (per Fluoro-Gold, 3 o 4 iniezioni di 1-2 ml ogni should essere sufficiente). Pulire delicatamente il muscolo (s) per rimuovere eventuali infiltrazioni.
- Portare le due estremità della pelle incisa ravvicinati con una pinza smussato e chiudere la ferita con clips chirurgiche. Infiltrarsi 0,1 ml Bupivacaine (0,5% in acqua) (o altri anestetici locali) lungo l'intero arco della ferita.
- Spegnere la macchina anestetico fuori e monitorare l'animale fino a quando non è completamente ripreso dall'anestesia.
- Attendere per 14 giorni tra la somministrazione delle iniezioni intra-muscolare e la perfusione degli animali.
3. perfusione
- Somministrare una dose letale di soluzione di sodio pentobarbitone (es Lethabarb; 150 mg / kg) per l'animale mediante iniezione intraperitoneale.
- Strettamente monitorare l'animale fino a raggiungere un livello profondo di anestesia, come confermato dall'assenza di ritiro pedale e riflessi corneali.
- Posizionare l'animale sulla sua schiena su una tavola di dissezione posto sopra un perfusion lavandino.
- Utilizzare un paio di pinze con le prese dente per sollevare la pelle che ricopre la base dello sterno. Fai una piccola incisione cutanea con un paio di forbici chirurgiche forti immediatamente sotto lo sterno e poi usare il forcipe per afferrare la cartilagine xifoideo dello sterno. Tenendo la cartilagine xifoide, allargare l'incisione su entrambi i lati della cavità toracica, dallo sterno alle ascelle.
- Tagliare il diaframma per esporre il cuore.
- Iniettare 0.ml di eparina direttamente nella punta del cuore per evitare la coagulazione del sangue.
- Tagliare il vertice per consentire l'inserimento di una cannula nel ventricolo sinistro, e quindi serrare rapidamente la cannula in posizione con l'ausilio di un emostatico.
- Fare un'incisione nell'atrio destro con un paio di forbici fini e iniziare immediatamente la pompa peristaltica. Profumato con 0,1 M PB finché il liquido in uscita dell'atrio è quasi privo di sangue e il colore del fegato diventa marrone chiaro. Poi, profumato con una soluzione di paraformaldeide (4% in 0.1 M PB) finché l'intero corpo dell'animale diventa rigida.
4. cervicale midollo spinale Dissection e preparazione per Istologia
- Posare la carcassa animale sul suo addome.
- Tagliare la pelle in linea mediana del corpo con un bisturi e rifletterla dalla base del cranio al livello dell'osso iliaco.
- Tagliare e riflettere i muscoli paravertebrali per esporre la parte dorsale della colonna vertebrale.
- Identificare il processo spinoso ossea di Atlante, il secondo segmento cervicale (cioè, C2), e rimuoverlo con un paio di pinze chirurgiche o rongeurs per individuare la radice dorsale sottostante corrispondente.
- Identificare il diritto radice C2 e colorare con un pennarello permanente.
- Rimuovere il prossimo vertebre uno per uno e contrassegnare le radici dorsali destra con colori alternati (cioè, C2, C4, C6, C8 e può essere colorato in verde e C3, C5, C7, T1 può essere colORed in blu).
- Usare un piccolo ago chirurgico (ad es, 30 G ago calibro) per forare delicatamente attraverso la dura copre l'estremità inferiore del midollo spinale. Con la smussatura dell'ago rivolto verso l'alto, sollevare la dura madre dal cavo mentre si muove l'ago rostrally per fare una fessura longitudinale.
- Riflettere la dura.
- Tagliare il trasversalmente midollo spinale in blocchi uno o due segmenti con una nuova lama di bisturi.
- Lasciare i segmenti del midollo spinale in situ e, per ciascun blocco, fare attenzione un piccolo segno fiducial sul lato sinistro di ciascun blocco con metà strada tra due bisturi radici adiacenti. Assicurarsi che il marchio fiducial è abbastanza profonda attraverso il tessuto da essere visibili dalla faccia ventrale dei blocchi. Trasformare il marchio fiducial con un angolo di circa 45 °, indicando sia anteriormente o posteriormente rispetto alla anatomia animale, per facilitare l'orientamento del segmento tissutale conseguente dissezione.
- Raccogliere i singoli blocchi in piccoli flaconi chiaramente etichettate contenenti una soluzione di paraformaldeide (4% in 0.1 M PB) e lasciare a RT O / N.
- Trasferire i blocchi in puliti, bottiglie etichettate chiaramente contenenti una soluzione di saccarosio (30% in 0.1 M PB) e conservare a 4 ° C per almeno due giorni.
- Posizionare i segmenti in crio-stampi e ricoperto con terreno di congelamento dei tessuti. Per la preparazione longitudinale istologica, orientare i blocchi con la parte dorsale rivolto verso l'alto e utilizzare il marchio fiduciale per orientare il blocco nella crio-stampi.
- Congelare le crio-stampi a -20 ° C e tagliare con un criostato in 50 sezioni micron di spessore. Nota: Le sezioni possono essere montati direttamente su vetrini da microscopio adesione e lasciati asciugare O / N. In alternativa, le sezioni possono essere galleggiare in piastre 48 pozzetti riempiti con 0.1 M PB e successivamente montati usando il marchio fiduciale di orientare le sezioni di tessuto nelle diapositive.
5. vertebrale lombare Cord dissezione e preparazione per Istologia
- Posare la carcassa animale sulla sua schiena.
- Eseguire un'incisione mediana lungo l'addome dell'animale e rimuovere le viscere. Sezionare i muscoli della parete addominale posteriore per esporre la parte ventrale della colonna vertebrale.
- Individuare il breve costola caudale-più e la sua adiacente T13 vertebra dove la T13 radice ventrale esce l'osso.
- Consecutivamente rimuovere uno per uno rostrale due o tre vertebre a T13 (cioè, T12, T11 e, se necessario, T10) con sottili Rongeurs chirurgici per seguire il T13 radice ventrale fino al suo punto di entrata nella parte ventrale del cavo ventrale segnare con un pennarello permanente.
- Da questo punto in poi, ripetere la stessa procedura per identificare la posizione dei punti di ingresso della radice ventrale per L1, L2, L3, L4, L5, L6 e S1, li colorazione con colori alternati.
- Seguire la stessa procedura descritta nella sezione 4,5-4,10 per lumbar dissezione del midollo spinale.
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Representative Results
Acetilcolinesterasi colorazione istochimica rivela la posizione delle piastre terminali del motore attraverso l'ampiezza dei muscoli. La Figura 1 illustra i risultati di tale colorazione eseguita su un intero zampa anteriore di ratto. Si suggerisce di ottimizzare la concentrazione della soluzione di solfuro di ammonio (ad es., 5-7% invece del 10%) e il momento in cui il campione viene immerso nella soluzione se lo sfondo non specifico macchie sulle fibre muscolari è troppo eccessiva. figura 2 illustra una colonna di motoneuroni marcate nel midollo spinale cervicale dopo un'iniezione retrograda tracciante neuronale lungo la lunghezza della regione terminale del motore piatto di un mouse tricipite brachiale. I neuroni motori retrogrado etichettati tipicamente formano una colonna longitudinale che si estende su più segmenti del midollo spinale. Figura 3 illustra il diverso numero di etichettate spinale neuroni motori cavo che è stato ottenuto tramite selcace Fluoro-Gold mira della regione placca motrice in tricipiti brachiale. Assorbimento massimo è stato osservato dopo l'erogazione nell'intero arco di regione MEP, al contrario di mira compartimenti specifici della regione MEP.
Figura 1: Vista laterale zampa anteriore del ratto dopo Acetilcolinesterasi istochimica colorazione per le piastre Motor End prima (A) e dopo (B) L'esposizione al solfuro di ammonio soluzione. In (A), le piastre terminali del motore sono evidenti come punti punteggiati bianchi che formano una linea continua che attraversa l'intera larghezza del muscolo mentre le fibre muscolari adottano un colore verde-blu. In (B), la stessa forelimb è presentato dopo immersione nella soluzione di solfuro di ammonio. Dopo lo sviluppo della soluzione di solfuro di ammonio, le piastre terminali del motore tunero rn sopra le fibre muscolari marroni. Le frecce in entrambe le parti delle figure indicano la posizione delle piastre di estremità del motore per (1) Acromiotrapezius, (2) Spinodeltoideus e (3) tricipite brachiale.
Figura 2:. Microfotografie di 50 micron sezione longitudinale del ventrale Corno del midollo spinale a livelli cervicali Rivelando Fluoro-oro-marcato Motor Neurons WM rappresenta la sostanza bianca e GM rappresenta la materia grigia del midollo spinale. La linea tratteggiata indica il limite tra la materia grigia e bianca nella sezione del midollo spinale osservato in figura. La microfotografia è stata scattata con un obiettivo 10X sotto il filtro DAPI mentre l'inserto è stata presa con l'obiettivo 20X sotto lo stesso filtro. In entrambi i pannelli, etichettatura Fluoro-oro può essere osservato nel neurone citoplasma motore così come assone prossimale / dendritiprocessi c. Dato relativo originariamente pubblicato nel Tosolini et al. (2013) Targeting la Figura intera delle regioni di targa del motore End nella zampa anteriore del mouse Aumenta l'assorbimento di fluoro-oro in corrispondente Spinal Cord Motor Neurons anteriore. Neurol. 04:58. doi: 10,3389 / fneur.2013.00058
Figura 3:. Selective fluoro-Gold Targeting della piastra Regione Motor End nel tricipite brachiale e l'etichettatura conseguente il midollo spinale motore Neuroni (A) è una rappresentazione schematica della posizione dei fondelli motore sulle fibre tricipiti brachiale. Le tre diverse sezioni della regione MEP cui era prevista singolarmente sono rappresentati dai punti verdi, rossi e blu. I puntini verdi e rossi rappresentano anteriore e posteriore metà di tutta la regione eurodeputato, rispettivamente, mentre i punti blu RAPPRESEnt la posizione del bolo di FG nel ventre del muscolo. La freccia a due punte orienta il muscolo in un asse anteriore-posteriore. (B) è un diagramma che illustra l'etichettatura composito ottenuto seguente selettiva il targeting delle diverse sezioni della regione MEP del tricipite brachiale, come indicato in (A). Ogni punto in (B) rappresenta un singolo neurone motore etichettati. La colonna nera rappresentativa etichettatura tipico osservato dopo l'iniezione di FG in tutto l'arco della regione MEP del muscolo. La colonna motoneuroni rosso è ottenuto dopo iniezioni FG nella metà posteriore del muscolo, mentre si ottiene colonna motoneurone verde dopo iniezioni FG nella metà anteriore del muscolo. Iniezioni limitate al "pancia" del muscolo ceduti motoneuroni solo in un piccolo numero di segmenti del midollo spinale, come dimostrato dalla colonna blu. Dato relativo originariamente pubblicareed in Tosolini et al. (2013) Targeting la Figura intera delle regioni di targa del motore End nella zampa anteriore del mouse Aumenta l'assorbimento di fluoro-oro in corrispondente Spinal Cord Motor Neurons anteriore. Neurol. 04:58. doi: 10,3389 / fneur.2013.00058
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Discussion
Il targeting intramuscolare e successivo trasferimento retrograda di transgeni terapeutici ai corrispondenti motoneuroni α per il trattamento sperimentale condizione neuromuscolare non è una nuova strategia. Per esempio, questo metodo di consegna è stato utilizzato per ritardare la degenerazione neuromuscolare in diverse fasi della progressione ALS in topi e ratti 1,9-12 SOD1 nonché nei topi con SMA 13. Mentre promettente, l'efficacia di questi scenari di terapia genica è stata limitata. A questo proposito, si propone che l'assorbimento dei transgeni da spinale neuroni motori cavo potrebbe essere migliorata targeting selettivo delle piastre terminali del motore sulle fibre muscolari. È importante notare che, negli studi sopra menzionati, le iniezioni intramuscolari di vettori virali sono stati eseguiti senza riferimento alla posizione della regione MEP nei muscoli mirati.
Durante le nostre analisi della distribuzione delle piastre terminali del motore(MEP) di arti posteriori e la zampa anteriore, sono emersi alcuni principi. Innanzitutto, la regione MEP estende attraverso l'intera larghezza di un muscolo. Inoltre, i deputati sono costantemente allineati ortogonalmente rispetto alla direzione delle miofibre. In particolare, la regione MEP non è sempre situato nella porzione più spessa del muscolo, un'area spesso denominato 'ventre' e che è spesso oggetto di iniezioni intramuscolari bolo. Vale la pena notare che le attuali analisi sono state condotte su C57Bl6 topo 22-23 e il Long Evans ratto 21 e si è riscontrato che la distribuzione dei deputati è conservato all'interno di ciascuno di questi due ceppi di animali. Tuttavia, anche se non la distribuzione MEP è conservata tra i diversi ceppi di animali all'interno della stessa specie ancora da documentare.
Originariamente, abbiamo documentato la posizione della regione MEP per diversi muscoli dell'arto anteriore e arti posteriori per guidare piccolo, multiple iniezioni intramuscolari di retrogrado tracciante neuronale Fluoro-Gold. Queste mappe MEP possono essere utilizzati per i transgeni navetta in neuroni motori. In tal caso, tuttavia, è importante regolare il volume di iniezione in funzione del tipo di virus usato (ad es., Adenovirus, lentivirus, etc.) la sua sierotipo così come il suo titolo. Mantenere la fascia intatti è un buon modo per mantenere il virus confinata entro i limiti del muscolo (s) di interesse. Un altro modo per evitare trasfezione spurie dei motoneuroni che innervano i muscoli vicini è quello di pulire la superficie del muscolo dolcemente dopo le iniezioni. Queste precauzioni potrebbero essere irrilevanti in alcuni progetti sperimentali in cui raggiungere elevati livelli di trasduzione potrebbe essere più rilevante che contiene all'interno del pool di motoneuroni che alimentano il muscolo mirato. Tuttavia, essi sono una buona pratica per ovvi motivi di sicurezza. Se hanno bisogno di essere iniettato più di muscoli isolati, potrebbe essere saggio, se possibile, di scegliereun gruppo di muscoli che sono vicini l'uno all'altro per minimizzare la dimensione della incisione cutanea. Ratti e topi hanno la pelle molto allentata (es., Non collegato ai muscoli), quindi è relativamente facile da indirizzare diversi muscoli senza dover eseguire enormi incisioni cutanee.
Terapia genica efficace per la SLA e le altre malattie neuromuscolari che utilizzano il meccanismo retrogrado dei neuroni rimane una sfida come, idealmente, tale terapia sarebbe trasferire geni benefici su tutta la popolazione di neuroni motori spinali spinale. Tuttavia, non è necessario per indirizzare tutti i neuroni motori per raggiungere livelli sostenibili di trasduzione se il gene terapeutico di interesse viene codifica una proteina secretoria come un neurotrofine. Motoneuroni Infatti, non trasdotte in prossimità di quelli che sono stati trasdotti sono stati indicati per internalizzare molecole esogene di neurotrofine attraverso un meccanismo paracrino 24. Questo 'effetto astante' migliora notevolmente le efficacia di intramuscolare targeting secretoria navetta geni codificanti proteine in corrispondenti motoneuroni. D'altra parte, dato il fatto che la perdita di controllo respiratorio è la causa ultima della morte nella SLA, iniezioni intramuscolari di costrutti virali terapeutici possono essere effettuate in muscoli intercostali 1 o intrapleurally 25 per proteggere i motoneuroni coinvolti nella respirazione. Descrivendo un metodo per evidenziare facilmente la posizione e l'organizzazione dei deputati sui muscoli scheletrici, il presente protocollo si rivelerà uno strumento prezioso per esplorare nuove strategie di terapia genica per disfunzioni neuromuscolari. Questo protocollo fornisce anche un modo minimamente invasivo per preservare l'integrità della giunzione neuromuscolare in queste malattie motoneurone.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da un Centro di Ricerca Nazionale Salute e medicina (NHMRC) progetto di sovvenzione a RM
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluoro-Gold | Fluorochrome, LLC | Nil | Diluted to 5% |
| Drummond PCR Micropipets 1-10 µl | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | accompanied with plungers |
| Acetylthiocholine Iodide | Sigma Life Science | A5751-25G | |
| Copper(II) Sulfate Anhydrous | Sigma-Aldrich | 61230-500G-F | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Glycine | Ajax Finechem | 1083-500G | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin | Life Technologies | D-3312 | Diliuted in distilled water |
| Isothesia | Provet | ISOF00 | 1000 mg/g Isoflurane inhalation vapour |
| Autoclip 9 mm Wound Clips | Texas Scientific Instruments, LLC | 205016 | |
| Lethabarb Enthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd. | LETHA450 | |
| Formaldehyde Solution | Ajax Finechem | A809-2.5L PL | |
| SuperFrost Plus glass slides | Menzel-Glaser | J1800AMNZ | |
| Ammonium Sulphide | Sigma-Aldrich | A1952 | Diluted to 10% |
| Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride) | Astrazenca | Diluted to 0.25% |
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