Abstract
Sykdommer som påvirker integriteten til ryggmargen motoriske nevroner er blant de mest ødeleggende nevrologiske tilstander. I løpet av de siste tiårene, har utviklingen av flere dyremodeller av disse nevromuskulære sykdommer gitt det vitenskapelige samfunn med ulike terapeutiske scenarier som tar sikte på å forsinke eller reversere utviklingen av disse forholdene. Ved å benytte seg av den retrograde maskineri av nerveceller, har en av disse metodene vært mot skjelettmusklene i orden til skyt terapeutiske gener til tilsvarende ryggmargs motoriske nerveceller. Selv om en gang lovende, har lykkes med en slik genavlevering tilnærming blitt hemmet av sub-optimale antallet transduserte motoriske nevroner det har så langt vist seg å gi. Motor endeplater (MEPS) er høyt spesialiserte områder på skjelettmuskulatur som er i direkte synaptisk kontakt til ryggmargen α motoriske nerveceller. I denne forbindelse er det viktig å merke seg at, så langt, arbeidet med å retrogradoverføring av gener i motoriske neuroner ble gjort uten hensyn til plasseringen av MEP regionen i de målrettede muskler. Her beskriver vi en enkel protokoll 1) for å avsløre den nøyaktige plasseringen av parlamentsmedlemmer på overflaten av skjelettmuskulatur og 2) å bruke denne informasjonen til å veilede intramuskulær levering og påfølgende optimal retrograd transport av retrograd tracere i motoriske nevroner. Vi håper å utnytte resultatene fra disse tracing eksperimenter i videre studier til å undersøke retrograd transport av terapeutiske gener til ryggmargen motoriske nevroner gjennom målretting av parlamentsmedlemmer.
Introduction
Tap av kontroll over viljestyrte bevegelser som skyldes nevrologiske tilstander som motor neuron sykdom og spinal- samt Duchenne muskelatrofi er en ødeleggende tilstand som har høy og langvarig innvirkning på hverdagen til berørte personer. I løpet av det siste tiåret har forskningen som mål å stoppe eller i det minste forsinke de skadelige effektene av disse nevromuskulære sykdommer vært en prioritet for mange klinikere og forskere over hele verden. I denne forbindelse har den siste generasjonen av dyremodeller som etterligner disse nevromuskulære sykdommer vært medvirkende i å få grunnleggende innsikt i de fysiologiske mekanismene bak utvikling og progresjon av disse forholdene 1-13. Behandling av disse nevromuskulær sykdom krever direkte adgang til ryggmargen, og kan oppnås ved ryggmarg injeksjoner 14,15. Nylige fremskritt innen genterapi har også målrettet tverrstripet musklene i øvre ogunderekstremitetene til skyt terapeutiske gener til de tilsvarende α motoriske nerveceller som ligger innenfor den ventral horn av ryggmarg 1,9-13. Imidlertid har dette en gang lovende strategi for klart å forbedre resultatet av disse nevrologiske tilstander. Selv om det er rimelig å konkludere med at disse dårlige resultater kan være, i hvert fall delvis, tilskrives den lave effekten av disse beskyttende gener, kan man ikke utelukke lav effekt av disse genet leveringsmåte.
Motor endeplater (MEPS) er spesialiserte områder av skjelettmuskelfibrene som er innrykket av axon terminaler i store perifere motoriske fibre stammer fra α motoriske nerveceller. Sammen de perifere nerveender og parlamentsmedlemmer danne nevromuskulære krysset, dvs. stedet der synaptiske impulser er utløst av antero frigjøring av signalstoffet, acetylkolin. Viktigere er bi-ret forholdet mellom perifere nervefibre og parlamentsmedlemmerelle, selv om ulike motorer er ansvarlig for transport av molekyler og organeller mot så vel som borte fra nervecellen somata 16-18. I lys av disse anatomiske betraktninger, parlamentsmedlemmer synes å være målene for valg om levering og påfølgende retrograd transport av genetisk materiale til de tilsvarende motoriske nerveceller. I denne sammenheng er det ikke overraskende at suksessen til motoriske nervecellen transduksjon i stor grad avhenger av avstanden mellom intramuskulær injeksjon av virale vektorer og musklenes MEPs 19-20. Overraskende, men den nøyaktige plasseringen av MEP soner på muskelfibrene i laboratoriet rotte og mus, de to arter av valget mellom å modellere neuromuskulære sykdommer, var ikke tilgjengelig før nylig.
Vi har produsert omfattende kart over MEP regionen i flere forbena muskler i rotte og mus 21-22. Mer nylig har vi vist detaljene i organiseringen av MEP region for flere muskler i mus bakben 23 og vi er nå analysere funksjoner av parlamentsmedlemmene på rotte bakben. I våre hender, intramuskulære injeksjoner av retrograd tracere rettet til hele MEP soner i disse musklene ga opphav til flere merkede motoriske nevroner som spenner over mer ryggmargssegmenter enn tidligere rapportert. Her presenterer vi protokollen som har blitt utviklet i løpet av de siste årene for å avsløre plasseringen av parlamentsmedlemmene på den ytre overflaten samt hele dybden av bakben og forbena muskler i både mus og rotter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer beskrevet her holdt Animal Care og etikkomiteen av UNSW Australia og ble utført i samsvar med National Health and Medical Research Council of Australia regler for dyreforsøk. Alle prosedyrer i denne protokollen skal utføres i samsvar med kravet til relevant Animal Care and Ethics Committee.
1. Acetylcholinesterase histokjemiske Farging
- Forbered Acetylcholinesterase reaksjonsblandingen
- Legg 290 mg Acetylthiocholine jodid i 200 ml 0,1 M fosfatbuffer (PB). Bland med en magnetrører ved 900 opm.
- Legg 600 mg glycin under kontinuerlig omrøring.
- Tilsett langsomt 420 mg kobbersulfat til reaksjonsblandingen under kontinuerlig omrøring inntil produktet er fullstendig oppløst.
- Fjern skinnet på dyreskrott (oppnådd gjennom vev deling) ved å gjøre innsnittinn i huden på en perfusert rotte eller mus, fatte hud fra nakken og dra den forbi føttene. Kontroller at fascia dekker hver muskel er enten fjernet eller vesentlig perforert for å sikre god eksponering av muskelfibre til reaksjonsløsningen.
- Dyppe hele kroppen eller lem av interesse i reaksjonsblandingen og ruge O / N ved 4 ° C.
- Vask skrotten i 2 minutter i destillert vann. Merk: På dette stadiet, musklene utviser en blå farge og motor endeplater (MEPS) kan ses som hvite prikker.
- Expose kadaveret til en 10% ammonium sulfid løsning for 3-5 sek.
Merk: muskelfibre vil raskt bli brun og parlamentsmedlemmer vil være observerbar som svarte flekkete prikker. Hvis reaksjonen skjer for raskt, og muskelfibrene er farget for mørkt for å skille mellom MEPs og muskelfibrene prøver å bruke lavere konsentrasjoner av ammonium sulfid-løsning (for eksempel 5%). Reaksjonstiden for å fåoptimal kontrast mellom MEPs og muskelfibrene, varierer fra den ene prøve til den andre. Derfor er det vanskelig å definere nøyaktig eksponeringstiden overfor reagensen. Reaksjonen bør overvåkes nøye og stoppet når kontrasten anses tilstrekkelig. - Vask carcass to ganger, med omrøring i destillert vann og klapp forsiktig skrotten tørr.
- Foto både laterale og mediale deler av lem, noe som sikrer at parlamentsmedlemmene for alle musklene i området er tatt til fange.
2. intramuskulære injeksjoner på motorsiden Plates
- Trekk glass mikropipetter med en mikropipette avtrekker (bruk av graderte mikropipetter med stempler anbefales). Med hjelp av et disseksjonsmikroskop, bryte tuppen av mikropipetter med en pinsett, slik at den indre diameter av hulrommet i den mikropipette er omtrent 0,5 mm.
- Sikre at alle kirurgiske instrumenter som brukes er ferske autoklaveres og thpå det kirurgiske området er sterile.
- Fyll mikropipetter med Fluor-gull (5% i destillert vann).
- Indusere bedøve i dyret i en induksjons kammer med isofluorane (4% i O 2). Sjekk for rettende refleks og sikre dens fravær før du fjerner den fra induksjonskammeret. Sikre en nesekonus over snuten av rotte og levere isofluorane (2% i O 2) for opprettholdelse av anestesi. Knip dyrets tær og trykk forsiktig dyrets øye for å sikre at både pedal tilbaketrekning og hornhinnen reflekser er fraværende. Merk: En blanding av ketamin og xylazil kan også brukes (80 og 10 mg / kg henholdsvis levert intraperitonealt). Ketamin er et Schedule 8 ("Kontrollert") narkotika og nødvendige protokoller forbundet med kjøp, bruk, lagring og avhending av stoffet vil måtte følges.
- Påfør øye smøremiddel for å unngå uttørking av øynene i løpet av prosedyren.
- Barbere targeted lem og bruk gasbind til å tørke det barberte området med tre vekslende skrubb av klorheksidin og 70% alkohol. Overfør dyret til det kirurgiske området.
- Plasser dyret på en ren underlags og plasser den riktig for å sikre god tilgang til målrettede muskelen (e).
- Bruk en pinsett med tann grep for å løfte huden over målrettet muskel fra den underliggende muskulaturen og gjør et snitt i huden med kirurgisk saks. Pass på at snittet er stor nok til å fullstendig utsette muskelen (e) av interesse. Sørg for at det er minimalt avbrudd til fascien.
- Bruk MEP fotografier for å transponere mentalt plasseringen og formen på MEP region på muskelen (e).
Merk: Et fint filt markør kan bidra til å reprodusere MEP-regionen fra fotografiet på muskelen (r) av interesse. - Utføre multiple injeksjoner langs hele lengden av MEP region (for fluor-Gold, 3 til 4 injeksjoner av 1-2 ul hver should være tilstrekkelig). Tørk forsiktig av muskelen (e) for å fjerne eventuelle sigevann.
- Ta de to endene av radert huden tett sammen med butt pinsett og lukke såret med kirurgiske klipp. Infiltrere 0,1 ml Bupivakain (0.5% i vann) (eller andre lokalanestetika) langs hele utstrekningen av såret.
- Snu bedøvelse maskinen av og overvåke dyret før den har er fullt restituert fra anestesi.
- Vent i 14 dager mellom administrasjon av intramuskulære injeksjoner og perfusjon av dyrene.
3. perfusjoner
- Administrere en dødelig dose av pentobarbiton natrium-oppløsning (f.eks Lethabarb; 150 mg / kg) til dyret ved intraperitoneal injeksjon.
- Følge nøye dyret helt til et dypt nivå av anestesi er nådd, noe som bekreftes ved fravær av pedalen tilbaketrekning og hornhinnen på ballen.
- Plasser dyret på ryggen på en dissekere bord plassert over en perfusion vasken.
- Bruk en pinsett med tann grep for å løfte huden som dekker undersiden av brystbenet. Lag et lite snitt i huden med et par sterke kirurgisk saks rett under brystbenet og deretter bruke pinsett til å gripe xifoid brusken i brystbenet. Mens du holder xiphoid brusk, forstørre snitt på begge sider av brysthulen, fra brystbenet til armhulene.
- Kutt membranen for å avsløre hjertet.
- Injiser 0.ml av heparin direkte inn i toppen av hjertet for å hindre koagulering av blodet.
- Kutt apex til å tillate innsetting av en kanyle inn i den venstre ventrikkel, og deretter raskt klemme kanylen på plass ved hjelp av en haemostat.
- Lag et snitt i høyre atrium med et par gode saks og umiddelbart starte den peristaltiske pumpen. Perfuse med 0,1 M PB, inntil væsken strømmer ut av atrium er nesten fri for blod og fargen av leveren blir lys brun. Deretter perfuse med Solusjon av paraformaldehyd (4% i 0,1 M PB) inntil hele kroppen til dyret blir stiv.
4. Cervical Spinal Cord Dissection og forberedelse til histologi
- Lå dyret kadaver på buken.
- Kutt i huden ved kroppens midtlinjen med en skalpell og reflektere det fra bunnen av hodeskallen til nivået av hoftebenet.
- Skjære gjennom og reflektere den paravertebrale muskler for å eksponere den dorsale del av ryggraden.
- Identifisere den benete spinous prosessen med Atlas, den andre cervical-segmentet (dvs. C2), og ta det med et par kirurgiske Rongeurs eller tang for å finne tilsvarende underliggende rygg roten.
- Finne de riktige C2 roten ved å farge det med en permanent filt markør.
- Fjern neste ryggvirvlene én etter én og markere de rette Dorsalrøttene med vekslende farger (dvs. C2, C4, C6 og C8 kan være farget i grønt og C3, C5, C7, T1 kan være colELLER-behandlet i blått).
- Bruke et lite kirurgisk nål (for eksempel 30 G gauge nål) til forsiktig Pierce gjennom dura som dekker den nedre enden av ryggmargen. Med skråkant av nålen vender opp, løfter dura bort fra ledningen mens du beveger nålen rostrally å lage en langsgående spalte.
- Reflektere dura.
- Skjær ryggmargen på tvers inn i en- eller to-segmentet blokker med en ny skalpell blad.
- La ryggmargssegmenter in situ og, for hver blokk, forsiktig lage en liten avlesningsmerke på venstre side av hver blokk med skalpellblad halvveis mellom to nærliggende røtter. Kontroller at avlesningsmerke er dypt nok inn i vevet som skal være synlig fra den ventrale del av blokkene. Gjør avlesningsmerke i en vinkel på omtrent 45 °, som peker enten anteriort og posteriort i forhold til dyr anatomi, for å hjelpe til med orienteringen av vevet segment etter disseksjon.
- Samle de enkelte blokker i små, tydelig merket flasker som inneholder en løsning av Paraformaldehyde (4% i 0,1 M PB) og la på RT O / N.
- Overfør blokkene på rent, klart merkede flasker inneholdende en oppløsning av sakkarose (30% i 0,1 M PB) og holde ved 4 ° C i minst to dager.
- Plasser segmentene i kryo-muggsopp og dekket dem med vev frysing medium. For langsgående histologisk forberedelse, orientere blokker med rygg aspektet vendt opp og bruke fiducial mark å orientere blokken i kryo-formene.
- Fryse kryo-former ved -20 ° C og kuttet med en kryostat i 50 um tykke seksjoner. Merk: Delene kan monteres direkte på vedheft objektglass og tørkes O / N. Alternativt kan seksjonene være fløt i 48-brønners plater som er fylt med 0,1 M PB og deretter monteres ved hjelp av avlesningsmerke for å orientere vevssnittene på skinnene.
5. Lumbar Spinal Cord Dissection og forberedelse til histologi
- Lå dyret kadaver på ryggen.
- Utfør en midtlinjen snitt langs buken på dyret og ta ut innvollene. Skjær ut musklene i bakre bukvegg å eksponere den ventrale del av ryggraden.
- Finn korte hale-mest rib og dens tilstøtende T13 vertebra der T13 ventral root kommer ut beinet.
- Fortløpende fjerne en etter en to eller tre ryggvirvler rostralt til T13 (dvs. T12, T11 og, om nødvendig, T10) med fine kirurgiske Rongeurs å følge T13 ventral roten til sin inngangspunkt i ventral aspekt av ventral ledningen og merk den med en permanent filt markør.
- Fra dette punktet, gjentar samme prosedyre for å identifisere plasseringen av ventral poeng root hindringer for L1, L2, L3, L4, L5, L6 og S1, fargelegge dem med vekslende farger.
- Følg samme prosedyre som beskrevet i punkt 4.5 til 4.10 for lumbar ryggmargen disseksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Acetylcholinesterase histokjemisk farging viser plasseringen av motoren endeplatene på tvers av bredden av musklene. Figur 1 illustrerer resultatene av en slik farging utført på en hel rotteforbens. Det er foreslått å optimalisere konsentrasjonen av ammonium sulfid-løsning (f.eks., 5-7% i stedet for 10%) hvis den ikke-spesifikke bakgrunnsfarging på musklene fibrene er like godt som det tidspunkt prøven er neddykket i løsningen for dreven. Figur 2 illustrerer en kolonne av merkede motoriske nevroner i cervical ryggmargen etter en injeksjon av retrograd neuronal tracer langs lengden av motorens endeplate regionen til en mus triceps brachii muskel. De retrograd merkede motoriske nevroner vanligvis danner en langsgående kolonne som strekker seg over flere segmenter i ryggmargen. Figur 3 viser ulike antall merkede ryggmargen motoriske nevroner som er innhentet gjennom selektiv Fluor-Gold målretting av motoren endeplaten region i triceps brachii. Maksimalt opptak ble observert etter levering inn i hele utstrekningen av den MEP region, i motsetning til å rettet mot bestemte avdelinger av MEP regionen.
Figur 1: Utsikt over Lateral forbena av Rat etter Acetylcholinesterase histokjemiske Farging for Motor endeplater før (A) og etter (B) Eksponering for Ammonium sulfid Solution. I (A), den motorendeplatene er tydelige i form av hvite flekkete prikker som danner en kontinuerlig linje som krysser hele bredden av muskelen mens muskelfibrene adoptere en grønn-blå fargetone. I (B), blir den samme forbena presentert etter neddykking i ammonium sulfid-løsning. Etter utvikling i ammonium sulfid løsning, motorendeplatene turn svart i løpet av de brune muskelfibre. Pilene i begge deler av figurene peker til plasseringen av motoren endeplater for (1) Acromiotrapezius, (2) Spinodeltoideus og (3) triceps brachii.
Figur 2:. Mikrofotografier på 50 mikrometer lengdesnitt gjennom Ventral Horn i ryggmargen på Cervical Levels Avslører Fluor-Gold-merket motor nevroner WM representerer hvit substans og GM representerer den grå materie i ryggmargen. Den stiplede linjen angir grensen mellom grå og hvit substans i ryggmargen seksjonen sett i figuren. Mikrofotografiet ble tatt med en 10X objektiv under DAPI filter mens det innfelte ble tatt med 20X objektiv under samme filter. I begge paneler, kan fluor-gull merking observeres i den motoriske nevroner cytoplasma samt proksimale axon / dendritic prosesser. Figur som opprinnelig publisert i Tosolini et al. (2013) Rettet mot hele lengden av Motor endeplaten Regions i Mouse forbena øker opptaket av fluor-gull til tilsvarende ryggmargs motoriske nerveceller Front. Neurol. 04:58. doi: 10,3389 / fneur.2013.00058
Figur 3:. Selektiv Fluor-Gold målretting av Motor End Plate Region i Triceps brachii og den resulterende Merking i ryggmargen motor nevroner (A) er en skjematisk fremstilling av plasseringen av motor endeplatene på triceps brachii fibre. De tre ulike delene av MEP regionen som ble rettet individuelt er representert av grønne, røde og blå prikker. De grønne og røde prikker representerer de fremre og bakre halvdelen av hele MEP regionen henholdsvis mens de blå prikkene represent plasseringen av bolusinjeksjon av FG i buken av muskelen. Tohodet pil orienterer muskel i en anterior-posterior aksen. (B) er et sammensatt diagram som viser merkingen oppnådd etter selektiv målretting av de forskjellige delene av MEP regionen av triceps brachii, som angitt i (A). Hver prikk i (B) representerer en enkelt merket motor neuron. Den sorte kolonnen er representativ for typiske merking observert etter injeksjon av FG i hele spennet av MEP region av muskelen. Den røde motoriske nevroner kolonne oppnås følgende FG injeksjoner i den bakre halvdel av muskelen, mens den grønne motoriske nevroner kolonne oppnås følgende FG injeksjoner i den fremre halvdel av muskelen. Injeksjoner begrenset til "buk" på muskelen ga motoriske nevroner i bare et lite antall av ryggmargssegmenter, som vist ved den blå kolonne. Figur som opprinnelig publisereed i Tosolini et al. (2013) Rettet mot hele lengden av Motor endeplaten Regions i Mouse forbena øker opptaket av fluor-gull til tilsvarende ryggmargs motoriske nerveceller Front. Neurol. 04:58. doi: 10,3389 / fneur.2013.00058
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intramuskulær målretting og påfølgende retrograd overføring av terapeutiske transgener til de tilsvarende α motoriske nerveceller for eksperimentell behandling av nevromuskulær tilstand er ikke en ny strategi. For eksempel har denne leveringsmetoden blitt anvendt for å forsinke neuromuskulær degenerasjon i forskjellige stadier av ALS progresjon i SOD1 mus og rotter 1,9-12 samt i mus med SMA 13. Mens lovende, har effekten av disse genterapi scenarier vært begrenset. I denne forbindelse, foreslår vi at opptaket av transgener fra ryggmargen motoriske nevroner kan forbedres ved selektiv målretting av motorens endeplatene på muskelfibrene. Det er viktig å merke seg at i de ovennevnte undersøkelser, ble intramuskulære injeksjoner av virale vektorer utført uten hensyn til plasseringen av MEP regionen i de målrettede muskler.
I løpet av våre analyser av fordelingen av motorens endeplatene(MEP'er) av bakben og forbena, har noen prinsipper dukket opp. For det første strekker seg MEP region over hele bredden av en muskel. Videre er parlamentsmedlemmer konsekvent linje vinkelrett med hensyn til retning av muskelfibrene. Spesielt, er MEP regionen ikke alltid ligger innenfor den tykkeste del av den muskel, et område som ofte er referert til som "mage", og det er ofte målet for bolus intramuskulære injeksjoner. Det er verdt å merke seg at dagens analysene ble utført på C57BL6 mus 22-23 og Long Evans rat 21, og det ble funnet at fordelingen av de MEPs er konservert innen hver av disse to stammer av dyr. Imidlertid, uansett om den MEP fordelingen er bevart mellom forskjellige stammer av dyr innenfor samme art forblir skal dokumenteres.
Opprinnelig, har vi dokumentert plasseringen av MEP regionen i flere muskler i forbena og bakbena for å lede små, multiple intramuskulære injeksjoner av retrograd neuronal tracer Fluor-gull. Disse MEP kartene kan brukes til skyttransgener i motoriske nevroner. I et slikt tilfelle er det imidlertid viktig å justere volumet av injeksjoner i henhold til den type virus anvendt (f.eks., Adenovirus, lentivirus, etc.) dens serotype så vel som dens titer. Holde fascia intakt er en god måte å holde viruset begrenset innenfor grensene av muskelen (e) av interesse. En annen måte å unngå falsk transfeksjon av motoriske nevroner innervating nabo muskler er å tørke overflaten av muskel forsiktig etter injeksjonene. Disse forholdsreglene kan være irrelevant i noen eksperimentelle design hvor oppnå høye nivåer av overføring kan være mer relevant enn som inneholder det innenfor pool av motoriske nerveceller som forsyner målrettet muskel. Likevel er de god praksis for åpenbare sikkerhetsmessige grunner. Hvis mer enn én isolerte muskler må injiseres, kan det være lurt, hvis mulig, å velgeen gruppe av muskler som er nær hverandre for å minimalisere størrelsen av huden innsnitt. Rotter og mus har meget løse huden (f.eks., Ikke er festet til muskler), slik at det er relativt enkelt å målrette flere muskler uten å måtte foreta store hud snitt.
Effektiv genterapi for ALS og andre nevromuskulære tilstander ved hjelp av retrograd maskineri av nevroner er fortsatt en utfordring som ideelt sett ville en slik behandling overføre gunstige gener på tvers av hele befolkningen i ryggmargen motoriske nevroner. Imidlertid er det ikke nødvendig å målrette alle motoriske nevroner å oppnå varige nivåer av transduksjon hvis det terapeutiske genet av interesse som koder et sekretorisk protein slik som et neurotrofiner. Faktisk, ikke-omsatte motoriske nevroner i nærheten av de som er blitt transdusert har vist seg å internal eksogene molekyler av neurotrofiner gjennom en parakrin mekanisme 24. Denne "Tilskuereffekten" i stor grad forbedrer effcacy av intramuskulær målretting til shuttle sekresjonsprotein-koding gener inn i tilsvarende motoriske nerveceller. På den annen side, gitt det faktum at tap av luftkontroll er det optimale dødsårsak i ALS, kan intramuskulære injeksjoner av terapeutiske virale konstruksjoner utføres i interkostalrom muskler en eller intrapleurally 25 for å beskytte de motoriske nevroner som er involvert i å puste. Ved å beskrive en metode for enkelt å markere plassering og organisering av parlamentsmedlemmer om skjelettmusklene, vil den nåværende protokollen vise seg å være et verdifullt verktøy for å utforske nye genterapi strategier for nevromuskulære dysfunksjoner. Denne protokollen gir også en minimal invasiv måte for å bevare integriteten av det nevromuskulære krysset i disse lavere motor neuron sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en National Health & Medical Research Centre (NHMRC) prosjektstøtte til RM
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluoro-Gold | Fluorochrome, LLC | Nil | Diluted to 5% |
| Drummond PCR Micropipets 1-10 µl | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | accompanied with plungers |
| Acetylthiocholine Iodide | Sigma Life Science | A5751-25G | |
| Copper(II) Sulfate Anhydrous | Sigma-Aldrich | 61230-500G-F | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Glycine | Ajax Finechem | 1083-500G | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin | Life Technologies | D-3312 | Diliuted in distilled water |
| Isothesia | Provet | ISOF00 | 1000 mg/g Isoflurane inhalation vapour |
| Autoclip 9 mm Wound Clips | Texas Scientific Instruments, LLC | 205016 | |
| Lethabarb Enthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd. | LETHA450 | |
| Formaldehyde Solution | Ajax Finechem | A809-2.5L PL | |
| SuperFrost Plus glass slides | Menzel-Glaser | J1800AMNZ | |
| Ammonium Sulphide | Sigma-Aldrich | A1952 | Diluted to 10% |
| Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride) | Astrazenca | Diluted to 0.25% |
References
- Kaspar, B. K. Retrograde Viral Delivery of IGF-1 Prolongs Survival in a Mouse ALS Model. Science. 301 (5634), (2003).
- Ishiyama, T., Okada, R., Nishibe, H., Mitsumoto, H., Nakayama, C. Riluzole slows the progression of neuromuscular dysfunction in the wobbler mouse motor neuron disease. Brain Res. 1019 (1-2), 226-236 (2004).
- Turner, B. J., Parkinson, N. J., Davies, K. E., Talbot, K. Survival motor neuron deficiency enhances progression in an amyotrophic lateral sclerosis mouse model. Neurobiol Dis. 34 (3), 511-517 (2009).
- Wegorzewska, I., Bell, S., Cairns, N. J., Miller, T. M., Baloh, R. H. TDP-43 mutant transgenic mice develop features of ALS and frontotemporal lobar degeneration. P Natl Acad Sci USA. 106 (44), 18809-18814 (2009).
- Kimura, E., Li, S., Gregorevic, P., Fall, B. M., Chamberlain, J. S. Dystrophin delivery to muscles of mdx mice using lentiviral vectors leads to myogenic progenitor targeting and stable gene expression. Mol Ther. 18 (1), 206-213 (2009).
- Van Den Bosch, L. Genetic rodent models of amyotrophic lateral sclerosis. J Biomed Biotechnol. 2011 (6), 348765–11 (2011).
- Pratt, S. J. P., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles. J Physiol. 591 (Pt 2), 559-570 (2013).
- Garrett, C. A., et al. DYNC1H1 mutation alters transport kinetics and ERK1/2-cFos signalling in a mouse model of distal spinal muscular atrophy). Brain. 137 (Pt 7), 1883-1893 (2014).
- Bordet, T., et al. Protective effects of cardiotrophin-1 adenoviral gene transfer on neuromuscular degeneration in transgenic ALS mice). Hum Mol Gen. 10 (18), 1925-1933 (2001).
- Acsadi, G., et al. Increased survival and function of SOD1 mice after glial cell-derived neurotrophic factor gene therapy. Hum Gene Ther. 13 (9), 1047-1059 (2002).
- Azzouz, M., et al. VEGF delivery with retrogradely transported lentivector prolongs survival in a mouse ALS model. Nature. 429 (6990), 413-417 (2004).
- Suzuki, M., et al. Direct muscle delivery of GDNF with human mesenchymal stem cells improves motor neuron survival and function in a rat model of familial ALS. Mol Ther. 16 (12), 2002-2010 (2008).
- Benkhelifa-Ziyyat, S., et al. Intramuscular scAAV9-SMN Injection Mediates Widespread Gene Delivery to the Spinal Cord and Decreases Disease Severity in SMA Mice. Mol Ther. 21 (2), 282-290 (2013).
- Azzouz, M., Hottinger, A., Paterna, J. C., Zurn, A. D., Aebischer, P., Büeler, H. Increased motoneuron survival and improved neuromuscular function in transgenic ALS mice after intraspinal injection of an adeno-associated virus encoding Bcl-2. Hum Mol Gen. 9 (5), (2000).
- Lepore, A. C., Haenggeli, C., et al. Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS. Brain Res. 1185, 256-265 (2007).
- Schnapp, B. J., Reese, T. S. Dynein is the motor for retrograde axonal transport of organelles. Proc Natl Acad Sci USA. 86 (5), 1548-1552 (1989).
- Vale, R. D. The Molecular Motor Toolbox for Intracellular Transport. Cell. 112 (4), 467-480 (2003).
- Schiavo, G., Fainzilber, M. Cell biology: Alternative energy for neuronal motors. Nature. 495 (7440), 178-180 (2013).
- Gracies, J. -M., Lugassy, M., Weisz, D. J., Vecchio, M., Flanagan, S., Simpson, D. M. Botulinum Toxin Dilution and Endplate Targeting in Spasticity. A Double-Blind Controlled Study. Arch Phys Med Rehabil. 90 (1), 9-16 (2009).
- Van Campenhout, A., Molenaers, G. Localization of the motor endplate zone in human skeletal muscles of the lower limb: anatomical guidelines for injection with botulinum toxin. Dev Med Child Neurol. 53 (2), 108-119 (2011).
- Tosolini, A. P., Morris, R. Spatial characterization of the motor neuron columns supplying the rat forelimb. Neuroscience. 200, 19-30 (2012).
- Tosolini, A. P., Mohan, R., Morris, R. Targeting the full length of the motor end plate regions in the mouse forelimb increases the uptake of fluoro-gold into corresponding spinal cord motor neurons. Front Neurol. 4, 58 (2013).
- Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport. Neuroscience. 274, 318-330 (2014).
- Baumgartner, B. J., Shine, H. D. Neuroprotection of spinal motoneurons following targeted transduction with an adenoviral vector carrying the gene for glial cell line-derived neurotrophic factor. Exp Neurol. 153 (1), 102-112 (1998).
- Gransee, H. M., Zhan, W. -Z., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Targeted delivery of TrkB receptor to phrenic motoneurons enhances functional recovery of rhythmic phrenic activity after cervical spinal hemisection. PLoS ONE. 8 (5), e64755 (2013).
