Introduction
Sinds 1973 is de nier transplantatie model bij muizen is een waardevol onderzoeksinstrument, maar technische problemen hebben het wijdverbreide gebruik bemoeilijkt. In de loop der jaren een aantal kranten zijn gepubliceerd detaillering verbeteringen / verfijningen aan deze procedure. Als model van primair gevasculariseerde vaste orgaantransplantatie deze procedure waarschijnlijk tweede alleen voor de heterotope harttransplantatie dat ook voor de Russell laboratorium werd ontwikkeld in 1973 6. Beide modellen lenen voor onderzoek naar allogene afstotingsreacties, de ontwikkeling van vertraagde transplantaatfunctie en ischemie-reperfusie schade.
Een van de meest voorkomende problemen te rapporteren met niertransplantatie is de relatief hoge incidentie van arteriële trombose 4,5,7 die we ook ervaren in ons laboratorium. Daarom zetten we een literatuuronderzoek van trombusvorming te voeren en mogelijk de oorzaak van dit technisch probleem te vinden en ook bedenken eenmogelijke oplossing. De meest waarschijnlijke oorzaak van trombose is enigszins gedraaide baan neemt het bloed van de ontvanger aorta, in het donor renale aorta vervolgens naar de donor nierslagader. Deze weg veroorzaakt turbulentie in de nierslagader wat kan leiden tot de activering van bloedplaatjes en thrombusvorming. Op basis van de recente waarnemingen en een zoektocht van relevante literatuur 8-14 kwamen we met een nieuwe techniek die trombose heeft teruggebracht tot 0%.
De hier beschreven techniek verschilt van eerder gerapporteerde technieken in de vorming van een arterieel hiel en teen manchet welke voorzieningen verbeterde bloedstroom en vermindert trombusvorming. De manchet is gevormd door het verdelen van de infra-renale aorta over het gezicht van de renale arteriële ostium onder een hoek kleiner dan 45 ° met de lengteas van de aorta (figuur 1A en 1B). Dit resulteert in een manchet ongeveer 2 mm lang. Een veneuze Carrel patch wordt gevormd door het doorsnijden van de renal ader in de IVC waardoor de diameter van de manchet. De infra-renale donor abdominale aorta hiel en teen manchet end-to-side anastomose aan de ontvanger abdominale aorta en de donor renale ader / IVC patch end-to-side anastomose aan de ontvanger abdominale inferieure vena cava (IVC) . De urineleider wordt vervolgens in en verankerd aan de blaas zoals beschreven door Han et al 3.
Voor deze studie behandelde transplantaten slechts warme ischemie keren (bijv., Zonder koude ischemie) vergeleken. In dit geval warme ischemie verwijst naar de tijd vanaf de beëindiging van de bloedstroom door de donornier (stap 1.11) en reperfusie van het transplantaat in de ontvanger (stap 2.11). Koude ischemie is de tijd dat de nier niet geperfundeerd en bewaard in koude opslag tot het begin van de implantatieprocedure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle muizen werden gekocht van The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) en werden ondergebracht onder pathogeenvrije omstandigheden bij de Universiteit van Colorado Denver, Barbara Davis Center Animal Facility volgens de NIH richtlijnen en met goedkeuring van de Universiteit van Colorado Denver IACUC.
1. donornier Harvest
- Steriliseren alle instrumenten, draag steriele handschoenen tijdens de gehele procedure en een steriel veld te houden. Voer alle operaties met gebruik van een operatiemicroscoop.
- Operatief verwijderen muis donornieren uit-pentobarbital verdoofd (60 mg / kg IP) donoren. Vergewissen de diepte van de anesthesie door teen-snuifje, en observeer de ademhaling.
- Klem de vacht dan immobiliseren de muis door 4-way beperkingen. Bereid de huid met povidonjood en drapeer de muis in een steriele manier.
- Maak een 2 cm middellijn verticale incisie in de buik en voer de buikholte. Trek de darm superieur en externaliseren dezeop de borst. Houd de darm verpakt in steriele vochtig gaasje gedurende de hele procedure.
- De grote abdominale vaten te identificeren en te mobiliseren, vast welke lumbale takken en ofwel cauterize of ligeren ze met 10/0 nylon hechtdraad.
- Direct distaal van de linker renale vaten plagen de inferior vena cava (IVC) en abdominale aorta (AA) elkaar door stompe dissectie dan ongeveer 2 mm. Ligeren met 10/0 nylon en verdeel kleine arteriële en veneuze takken uit de renale vaten.
- Nu scheiden de nierader van de nierslagader zorgvuldig door stompe dissectie van deze structuren. Dit maakt een nauwkeurige instelling van een Carrel patch op het proximale uiteinde van de renale ader, die zal worden gebruikt om een end-to-side anastomose aan de ontvangers IVC vormen.
- Identificeren, ligeren en de linker bijnier vaten verdelen. Dit maakt toegang tot de bijnieren aorta en een 6-0 zijden hechtdraad wordt geplaatst rond de aorta als voorbereiding op ligatie, maar op dit moment niet gebonden. Mobiliseer de nieren, schepen en urineleider van de omringende dashboard. Draai de nier naar rechts en ligeren / verdelen elke posterior takken. Dan terug de nier naar links.
- Richt nu de aandacht op de ureter. Zonder de nier navel gratis de urineleider van de omringende dashboard zorg ervoor dat de ureteric schepen behouden. Verdeel de urineleider ter hoogte van de ductus deferens. De nier is nu klaar voor het herstellen.
- Injecteer langzaam 300 eenheden van heparine in het distale IVC waardoor de donor heparinizing. Vastsjorren van 6-0 zijden hechtdraad geplaatst rond de bijnieren AA en perfuseren de linker nier via de distale abdominale aorta met 0,8 ml van heparine-zoutoplossing (100 U / ml).
- Zodra de perfusie heeft opgehouden te creëren een veneuze Carrel patch onmiddellijk terugstromen in de nieren te elimineren. Trek de nierader in de richting van de nier het openbaren van de AA en nierslagader eronder.
- Verdeel de aorta naast de nierslagader creëren van een hiel ene manchet zoals weergegeven in figuur 1. de nier, ureter en vaten van de donor verwijderen.
- Verwijder de nier rechtstreeks aan een vooraf bereide begunstigde (0 min koude ischemie tijd) of opgeslagen bij 4 ° C in een oplossing van de keuze voor een vooraf bepaalde tijd op het moment van implantatie. Gedood donoren door exsanguanation en cervicale dislocatie. Totale tijd om donornier te herstellen is ongeveer. 15-20 min.
2. Nier Implant Techniek
- Verdoven van de ontvanger muis met pentobarbital (60 mg / kg IP initiële dosis, 25 mg / kg IP aanvullende dosis indien nodig). Vergewissen de diepte van de anesthesie door teen-snuifje, en observeer de ademhaling. Klem de vacht te immobiliseren dan de muis met 4-way beperkingen en oogzalf toepassing op de ogen. Bereid de huid met povidonjood en drapeer de muis in een steriele manier.
- Maak een 2 cm middellijn verticale incisie in de buik en voer de buikholte. Trek de darmsuperiorly en externaliseren op de borst. Houd de darm verpakt in steriele vochtig gaasje gedurende de hele procedure.
- Op dit moment is het uitvoeren van een rechter nefrectomie. Afbinden van de nierslagader en ader met 6-0 zijde hechtingen. Uitsnijden de nier distaal van de hechtingen. Ligeren de urineleider met 6-0 zijde en vervolgens delen proximaal van de nier.
- Isoleer de abdominale aorta en inferior vena cava (IVC) in de renale vaten. Plaats 4-0 katoenen banden rond de aorta en IVC superieur dan inferieur aan de anastomosisplaats. Identificeren en ligeren elke lumbale schepen binnen het veld met 10-0 nylon hechtdraad.
- Knoop de katoenen banden, eerst de inferieure, gevolgd door de superieur. Zo wat bloed wordt vastgehouden in de aorta om de aortotomy vergemakkelijken.
- Vorm het aortotomy met een 30G naald om het lumen van de aorta voeren. Verleng de incisie met fijne micro schaar om een lengte van ongeveer 2 mm.
- Maak een einde aan de zijde anastomose van de donor aorta hak-en-teen manchetde ontvanger aorta op de volgende wijze. Plaats een 10-0 nylon hechtdraad verblijf steek in de donor aorta en de inferieure hoek van de incisie in de ontvanger aorta en stropdas.
- Plaats een tweede 10-0 nylon tegenover de eerste in de donor aorta en de superieure hoek van de incisie in de abdominale aorta en stropdas. Maak een draaiende hechtdraad lijn van superieur aan inferieure in de laterale wand van de aorta en te binden tegen de eerder geplaatste verblijf steek. Hechten dan de mediale muur in een running mode en stropdas.
- Maak een einde aan de zijde anastomose van de donor nierader aan de ontvanger IVC in de volgende mode. Prik de IVC met een 30G naald en uitbreiding van de incisie met fijne micro schaar. Bind de donor renale ader aan de inferieure hoek van de incisie in de IVC met 10-0 nylon. Maak een lopende hechting tussen de renale ader en de IVC en stropdas.
NB: Het is ook van vitaal belang dat volledige dikte passeert de hechtnaald waaronder de vasculaire adventitia de intima bereikt. Eversie van de kanten maakt dat er intima-aan-intima contact, wat helpt bij het afdichten en genezing van de anastomosen. Terwijl een hemostatische stolling middel nuttig voor het verminderen van lekken kunnen worden, raden we aan dat een chirurg in plaats rekenen op een goede techniek. - Zorg ervoor dat de anastomosen zijn "schone". Dat wil zeggen, dat de tegenoverliggende wanden niet worden betrapt bij het plaatsen van hechtingen. Dit zal een belangrijke vernauwing stromen die zullen leiden tot een mislukte implantaat en in extreme gevallen tot verlamming veroorzaken.
OPMERKING: Een andere factor is van vitaal belang ervoor te zorgen dat de spanning van de anastomose hechtlijnen is optimaal. Te los en er zal onomkeerbare lekken, te strak en vernauwing te stromen zal leiden zijn. Als aan de arteriële kant leidt dit tot een slechte doorbloeding van het transplantaat, indien op het aderlijke kant een overbelaste nier leidt. - Laat de distale 4-0 katoen tie re-oprichting van veneuze flow. Nadat hemostase van venoons anastomose is geleidelijk waargenomen draai de proximale 4-0 katoen stropdas en observeer de arteriële anastomose voor hemostase.
- Verwijder de katoenen banden van de muis een keer zowel anastomoses veilig worden beschouwd. Pierce de blaas met een 20 G naald creëren van twee gaten.
- Leid de uiteinden van de gebogen forceps door de gaten en trek de donor ureter naar de blaas de tang met het proximale uiteinde van de ureter verankerd aan de blaaswand twee 10-0 nylon hechtingen. Knip de overtollige lengte van de urineleider uitsteekt uit het tweede gat waardoor de urineleider terug te trekken binnen de blaas en sluit het gat met twee 10-0 nylon hechtingen.
- Zet de darm naar het abdomen. Sluit de buikwand in twee lagen met 5-0 zijden hechtdraad in een actieve manier.
- Dien een 1,0 ml bolus van steriele, warme fysiologische zoutoplossing in de buik als vloeistof reanimatie bij het sluiten, en injecteer 0,8 ml normale zoutoplossing subcutaan post-operatief. Geen andere Houdersve maatregelen vereist tijdens de operatie.
- Herstellen van het dier op een warming deken. Totale implantaat is ca.. 35-45 min. Dien pijnstillers zoals buprenorfine, 0,05 mg / kg, SC, 0,1-0,2 ml aan het begin van de behandeling en elke 6-12 uur gedurende 72 uur na de operatie.
3. Contralaterale Nephrectomy
- Afhankelijk van het protocol eisen, enkele dagen na de implantatie procedure uitvoert een contralaterale nefrectomie onder isofluraan anesthesie (5% geïnhaleerd isofluraan inductie, 1,5-2,0% onderhoud).
- Voer de buikholte en zachtjes trekken de darm naar rechts van het dier. Expose de linker nier en stompe ontleden uit de omliggende fascia.
- Afbinden van de nierslagader, ader en ureter met 6-0 zijde hechtingen en accijnzen de nier boven de hechtingen en verwijder de nier. Totale operatieve tijd is ca.. 10 min.
4. Graft Assessment
- Maatregel serum creatnegen met de alkalische picraat methode (Jaffe reactie).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze chirurgische techniek maakt het mogelijk voor zowel eenvoudige graft survival / afstoting studies of behoorlijk complex experimentele protocollen. In de onderstaande figuren tonen we de voordelen van deze verbeterde arteriële anastomose techniek. Met behulp van deze techniek die we hebben aanzienlijk verminderd de incidentie van arteriële trombose van 35% naar 0% waardoor de productiviteit. Wij hebben deze techniek gebruikt voor meer dan een jaar bij dezelfde 0% trombose resultaat gehandhaafd. Figuur 1 beschrijft de werkwijze voor de vorming van de arteriële hiel en teen manchet die de basis van deze nieuwe techniek. Deze manchet verschaft een langere anastomose en een rechtere bloedstroombaan in de nier. Beide punten leiden tot significant verminderde turbulentie waardoor de waarschijnlijkheid van bloedplaatjes activering en thrombusvorming verminderd.
Figuur 2. Immunohistochemische analyse. (A) Periodic Acid-Schiff gekleurde coupe van een controle niet-transplanted nier. (B) een syngene niertransplantaat op POD 8 met de herziene techniek toont normale proximale tubulaire cellen, welke kubische zijn, namelijk cytoplasma en een ronde licht kern in het midden van de cel. Er is bewijs van milde borstelzoom letsel (pijlen), maar de meerderheid van de borstel grenzen regelmatig en goed bewaard gebleven. Vergroting: 400x.
Tabel 1. Vergelijking van trombose incidentie en warme ischemie tijd tussen de twee technieken. Alle waarden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. Voor enkele vergelijkingen, zijn normaal verdeelde data geëvalueerd met behulp van ongepaarde, tweezijdige Student t-toetsen, en niet-normaal verdeelde gegevens worden geanalyseerd door de niet-parametrische ongepaarde Mann-Whitney U test. P-waarden van minder dan 0,05 worden als statistisch significant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mastering deze transplantatie techniek is moeilijk, maar eenmaal bereikt het is een zeer krachtige research tool. De patiënt arts / onderzoeker zal worden beloond met aandacht voor detail en de consistentie van de techniek, dat is de sleutel tot het beheersen van elke chirurgische ingreep, nog meer in kleine diermodellen. De technische problemen bij het beheersen van de muis niertransplantatie zijn veel plooien, en het is zeer waarschijnlijk dat ervaringen in andere kleine dieren transplantaat modellen moeten worden verkregen voordat aan deze procedure.
Het is belangrijk dat de anastomosen zijn "clean", dat wil zeggen de tegenoverliggende bloedvatwanden niet worden gevangen bij het plaatsen van hechtingen om een patent lumen te handhaven. Anders zal er significante beklemming te stromen, dat zal meer dan waarschijnlijk resulteren in een mislukte transplantaat en in extreme gevallen kan leiden tot een achterste ledematen verlamming. Ook is het van vitaal belang dat volledige dikte passeert de hechtnaald waaronder vasculaire adventitia en intima bereikt als dit leidt tot goede evertion van de randen zorgen ervoor dat er intima-aan-intima contact dat helpt bij het afdichten en genezing van de anastomosen. Terwijl een hemostatische stolling middel nuttig voor het verminderen van lekken kunnen worden, raden we aan dat een chirurg in plaats daarvan vertrouwen op een goede techniek.
Ook aandacht moet worden besteed aan het waarborgen van de spanning van de anastomose hechtdraad lijnen optimaal is, te los en er zal onomkeerbare lekken, te strak en verminderde doorstroming zal leiden zijn. Als aan de arteriële kant leidt dit tot een slechte doorbloeding van het transplantaat, indien op het aderlijke kant een overbelaste nier leidt. Het bereiken van deze juiste spanning is een kwestie van oefening en ervaring met andere kleine dieren microvasculaire modellen zullen van grote hulp zijn. Vooral consistentie van techniek en niet aflatende aandacht voor detail zal uitstekende muis en graft survival en niertransplantatie functie opleveren.
t "> De beperkingen van deze techniek geldt slechts het gebruik dat door de onderzoeker kan worden toegepast. Zoals bij elke microvasculaire procedure, mits goede techniek wordt waargenomen de resultaten dienen reproduceerbaar te zijn.De incidentie van arteriële trombose deze techniek drastisch gereduceerd. Dit resulteert in ten minste 1/3 van niertransplantaties omgezet tegen mogelijke technische gebreken in bruikbare data, wat resulteert in lagere kosten en hogere productiviteit.
Als volledig gevasculariseerd, orthotoop transplantatie model van de toekomstige toepassingen zal afwijzing / tolerantie studies, het fenomeen van de vertraagde graft functie en onderzoek naar de mechanismen van ischemie / reperfusie schade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd mede ondersteund door 1R03DK096151.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | Roboz # | Fine Science Tools # | Arosurgical # |
| Straight micro-dissecting forcep #5 | RS-5015 | 11295-51 | |
| Curved micro-dissecting forcep #7 | RS-5047 | 11297-00 | |
| Curved serrated forcep | RS-5137 | 11052-10 | |
| Vannas micro-dissecting scissors, short | RS-5610 | 09.140.08 | |
| Micro-dissecting scissors, straight, sharp, long | 11.602.11 | ||
| Micro spring handle needle holder | 11.549.15 | ||
| Straight mosquito forcep | 91308-12 | ||
| Micro-dissecting scissors, straight, blunt | RS-5962 | 14078-10 | |
| Micro-dissecting scissors, curved, blunt | RS-5981 | 14079-10 | |
| Micro retractor | RS-6540 | ||
| Instrument tray, 10” x 6 ½” x ¾” | RT-1350S | ||
| Silk suture, 5/0, 22.5m spool | 18020-50 | ||
| Suture | |||
| 10/0 nylon | T4A10Q07 | ||
| 5/0 silk | E19A05N | ||
| Gloves | Drapes | ||
| Biogel from Medex Supply | Precept, #64-9012-9 | ||
| Syringes | Cotton applicators | ||
| B-D 1cc insulin, #329424 | Fisher-brand, #23-400-100 | ||
| Povidone-Iodine swabs | |||
| PDI, #B40600 | |||
| 4/0 Cotton ties | |||
| Domestic cotton autoclaved with instruments |
References
- Skoskiewicz, M., Chase, C., Winn, H. J., Russell, P. S. Kidney transplants between mice of graded immunogenetic diversity. Transplant Proc. 5 (1), 721-725 (1973).
- Kalina, S. L., Mottram, P. L. A microsurgical technique for renal transplantation in mice. Aust N Z J Surg. 63 (3), 213-216 (1993).
- Han, W. R., Murray-Segal, L. J., Mottram, P. L. Modified technique for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 19 (6), 272-274 (1999).
- Ge, F., Gong, W. Strategies for successfully establishing a kidney transplant in a mouse model. Exp Clin Transplant. 9 (5), 287-294 (2011).
- Martins, P. N. Learning curve, surgical results and operative complications for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 26 (8), 590-593 (2006).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Zhang, Z. Kidney Transplantation in Mice. Experimental Organ Transplantation. Chen, H., Qian, S. , Nova Science Publishers. 45-64 (2013).
- Zhang, L., Moskovitz, M., Piscatelli, S., Longaker, M. T., Siebert, J. W. Hemodynamic study of different angled end-to-side anastomoses. Microsurgery. 16 (2), 114-117 (1995).
- Liu, Q., Mirc, D., Fu, B. M. Mechanical mechanisms of thrombosis in intact bent microvessels of rat mesentery. J Biomech. 41 (12), 2726-2734 (2008).
- Chesnutt, J. K., Han, H. C. Tortuosity triggers platelet activation and thrombus formation in microvessels. J Biomech Eng. 133 (12), 121004 (2011).
- Han, H. C. Blood vessel buckling within soft surrounding tissue generates tortuosity. J Biomech. 42 (16), 2797-2801 (2009).
- Gutierrez-Diaz, J. A., et al. Intraluminal thrombus and neointimal hyperplasia after microvascular surgery. Surg Neurol. 24 (2), 153-159 (1985).
- Khouri, R. K., Cooley, B. C., Kenna, D. M., Edstrom, L. E. Thrombosis of microvascular anastomoses in traumatized vessels: fibrin versus platelets. Plast Reconstr Surg. 86 (1), 110-117 (1990).
- Johnson, P. C., et al. Initial platelet deposition at the human microvascular anastomosis: effect on downstream platelet deposition to intact and injured vessels. Plast Reconstr Surg. 90 (4), 650-658 (1992).
