Introduction
1973 yılından bu yana farelerde böbrek nakli modeli değerli bir araştırma aracı olmuştur, ama teknik sorunlar yaygın kullanımını engellemiştir. Yıllar boyunca birçok kağıtları yayınlanan bu prosedüre iyileştirmeler / iyileştirmeler ayrıntılarıyla oylandı. Öncelikle vaskülarize solid organ transplantasyonu bir model olarak bu prosedür sadece, aynı zamanda 1973 6 Russell laboratuvar tarafından icat edildi heterotopik kalp nakli modeli muhtemelen ikinci. Her iki model de allojenik ret yanıtları, gecikmiş greft fonksiyonu gelişimi içine araştırma kendilerini ödünç ve iskemi reperfüzyon hasarı.
Böbrek nakli ile rapor edilecek en yaygın konulardan biri de laboratuvarda yaşanan arteriyel tromboz 4,5,7 nispeten yüksek insidansı. Bu nedenle trombüs oluşumunun bir literatür taraması gerçekleştirmek ve muhtemelen bu teknik sorunun nedenini bulmak için yola ve aynı zamanda hazırlamak içinolası çözüm. Tromboz en muhtemel nedeni kan bağışı renal artere daha sonra donör böbrek aorta içine alıcı aortadan alır biraz dolambaçlı yoldur. Bu yol, trombosit aktivasyonu ve trombus oluşumuna neden olabilir renal arter türbülans neden olur. Son gözlemler ve literatür 8-14 bir arama dayanarak% 0 tromboz azalttı yeni bir teknik ile geldi.
Burada açıklanan teknik imkanları kan akışını geliştirilmiş bir arteriyel topuk-ve-ayak manşet oluşumunda önceden bildirilen teknikler arasında değişir ve anlamlı trombüs oluşumunu azaltır. Manşon az 45 ° aort (Şekil 1A ve 1B) uzunlamasına eksenine belirli bir açıda renal arter ostiyum yüzeyi boyunca alt böbrek aort bölünmesi ile meydana getirilir. Bu uzunluğu yaklaşık 2mm bir manşet ile sonuçlanır. Bir venöz Carrel yama r bölücü oluşturulmuşturIVC içine enal ven böylece manşet çapı artar. Kızıl-böbrek verici abdominal aorta topuk-and-toe manşet uç-yan alıcı abdominal aort ve donör renal venin anastomoz olduğunu / IVC yama (IVC) uç-yan alıcı karın inferior vena kava anastomoz olduğunu . Üreter sonra içine ve Han ve ark 3 tarafından açıklandığı gibi mesane bağlanır.
Bu çalışmada sadece sıcak iskemi süresi ile tedavi edilmemiş nakli için (yani., Soğuk iskemi) karşılaştırılır. Bu durumda sıcak iskemi verici böbrek yoluyla kan akımının kesilmesinden zaman anlamına gelir (aşağıda 1.11 adıma) ve alıcı (aşağıda adım 2.11) 'de greft reperfüzyon. Soğuk iskemi böbrek perfüze değildir ve implant prosedürünün başına kadar soğuk hava depolarında muhafaza edilir zaman anlamına gelir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm fareler Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) satın alındı ve NIH Rehberi ve Colorado Denver IACUC Üniversitesi onayıyla Colorado Denver, Barbara Davis Merkezi Hayvan Tesis Üniversitesi ile patojensiz şartlar altında muhafaza edildi.
1. Donör Böbrek Hasat
- Tüm aletler sterilize işlem boyunca steril eldiven giyin ve steril bir alan sağlamak. Bir ameliyat mikroskobu kullanımı ile tüm ameliyatları gerçekleştirmek.
- Cerrahi pentobarbital ile anestezi uygulanmış (60 mg / kg IP) vericilerden fare verici böbrek çıkarın. Ayak-tutam anestezi derinliği tespit ve solunum hızını gözlemlemek.
- Daha sonra 4-yollu sınırlamalar ile fare hareketsiz kürk Klip. Povidon-iyot ile cildi hazırlayın ve steril bir şekilde fare asmak.
- 2 cm orta hat vertikal karın kesi yapın ve karın boşluğuna girin. Superior barsak geri çekin ve dışagöğüs üzerinde. Prosedür boyunca steril gazlı bez nemli sarılmış bağırsak tutun.
- Büyük karın damarları tespit ve bunları harekete, herhangi bir lomber dalları tanımlamak ve dağlamak veya 10/0 naylon sütür ile lige ya.
- Hemen sol renal damarlara uzak yaklaşık 2mm üzerinde künt diseksiyon ile inferior vena kava (IVC) ve ayrı abdominal aorta (AA) kızdırmak. 10/0 naylon ile bağlanır ve böbrek damarlarının küçük arteriyel ve venöz dalları bölün.
- Şimdi bu yapıların künt diseksiyon ile dikkatlice renal arterden renal ven ayırın. Bu alıcıya IVC bir uç-yan anastamozu oluşturulması için kullanılacak renal ven proksimal ucunda bir Carrel yama doğru oluşturulması için izin verir.
- Tanımlayın, ligatı ve sol adrenal damarları bölün. Bu böbreküstü aorta erişime izin ve 6-0 ipek sütür ligasyon için hazırlık aort etrafına yerleştirilen, ancak şu anda bağlı değildir. Çevredeki facia gelen böbrek, üreter ve damarları harekete geçmek. Sağ ve Arter böbrek döndürün / herhangi posterior dalları bölün. Sonra sola böbrek dönün.
- Şimdi üreter dikkat yönlendirir. Böbrek hilum üreter damarları korumak için çevredeki facia alarak bakımdan üreteri özgür bozmadan. Duktus deferens düzeyinde üreter bölün. Böbrek hemen geri kazanılması için hazırdır.
- Yavaş yavaş, böylece donör heparinizing distal IVC içine heparin 300 birimlerini enjekte edilir. Böbreküstü AA etrafına yerleştirilen 6-0 ipek sütür aşağı kravat ve heparin tuzlu su çözeltisi (100 U / ml) 0.8ml distal abdominal aortun yoluyla sol böbrek serpmek.
- Perfüzyon venöz Carrel yama oluşturmak kesildi kez hemen böbrek içine akmasını önlemek için. AA ve altındaki böbrek arteri açığa böbrek doğru renal ven çekin.
- Renal arter bitişik aorta bir topuk ve yaratma DivideŞekil 1'de gösterildiği gibi e manşet. donörden böbrek, üreter ve damarları çıkartın.
- Implantasyonu kadar önceden hazırlanmış alıcı (0 dakika soğuk işemiya süresi) ya da önceden belirlenmiş bir süre için tercih edilen bir çözelti içinde 4 o C'de saklanabilir doğrudan böbrek çıkarın. Exsanguanation ve servikal dislokasyon ile vericilerden Ötenazi. Donör böbreği kurtarmak için Toplam süresi yaklaşık. 15-20 dk.
2. Böbrek İmplant Tekniği
- Pentobarbital alıcı fare anestezi (60 mg / kg IP başlangıç dozu, 25 mg / kg IP ek doz gerekli ise). Ayak-tutam anestezi derinliği tespit ve solunum hızını gözlemlemek. Kürk sonra 4-yollu sınırlamalar ile fare hareketsiz ve gözleri oftalmik merhem uygulayın Clip. Povidon-iyot ile cildi hazırlayın ve steril bir şekilde fare asmak.
- 2 cm orta hat vertikal karın kesi yapın ve karın boşluğuna girin. Bağırsak geri çekinsuperior ve göğüs üzerinde dışa. Prosedür boyunca steril gazlı bez nemli sarılmış bağırsak tutun.
- Şu anda sağ nefrektomi gerçekleştirin. 6-0 ipek dikişlerle renal arter ve ven Arter. Dikişlerle böbrek distalinden tüketim. Böbrek proksimal bölmek, sonra 6-0 ipek ile üreter bağlanır ve.
- Böbrek damarlarının altında abdominal aorta ve inferior vena kava (IVC) izole edin. Anastomoz sitesine 4-0 pamuk aort etrafında bağları ve IVC üstün sonra aşağı yerleştirin. 10-0 naylon sütür ile alanında herhangi bir lomber gemileri tespit etmek ve bağlamak.
- Üstün ardından ilk alt, pamuk bağları düğüm. Bu şekilde bazı kan aortatomi yapımında kolay aort tutulur.
- Aort lümeni girmek için bir 30G iğne ile aortatomi Form. Yaklaşık 2mm uzunluğunda ince mikro makas ile kesi uzatın.
- Donör aort topuk-ve-ayak manşet yan anastomoz son yapınAşağıdaki şekilde alıcı aorta. Donör aorta ve alıcı aort ve kravat kesinin alt açı bir 10-0 naylon dikiş kalmak dikiş yerleştirin.
- Donör aort ilk ve abdominal aorta ve kravat kesi üstün köşesinde karşısında ikinci 10-0 naylon yerleştirin. Aortun yan duvarında aşağı üstün bir çalışan sütür hattını yapın ve daha önce yerleştirilen kalmak dikiş karşı kravat. Sonra çalışan moda ve kravat medial duvar dikin.
- Aşağıdaki şekilde alıcıya IVC donör renal venin yan anastomoz son yapın. Bir 30G iğne ile IVC delinme ve ince mikro makasla kesi uzatmak. 10-0 naylon IVC içinde kesi alt köşesine donör renal ven kravat. Renal ven ile İVK ve kravat arasına çalışan sütür hattını olun.
NOT: Bu tam kalınlıkta vasküler adventit dahil dikiş iğnesinin geçtiği de hayati önem taşımaktadıria ve intima elde edilir. Kenarların Eversion de sızdırmazlık ve anastomuzuna yardımcıları intima-to-intima temas var olmasını sağlar. Hemostatik pıhtılaşma ajan kaçağının azaltılmasında yararlı olabilir, biz bir cerrah yerine iyi bir teknik güveniyor öneririz. - Anastomozlar "temiz" olduğundan emin olun. Yani dikiş yerleştirirken karşıt duvarları yakalanmış değil olmasıdır. Bu başarısız bir greft ve arka bacak felç aşırı durumlarda neden olacağı akışına karşı ciddi bir daralma neden olur.
NOT: Başka bir hayati önemli faktör anastomoz sütür hatlarının gerilim optimal olmasını sağlamak olduğunu. Çok gevşek ve geri dönüşümsüz sızıntı, çok sıkı ve neden olacaktır akış darlık olacaktır. Arteriyel tarafta bu greft zayıf perfüzyon neden olacaksa, venöz tarafında kalabalık böbrek neden olacaktır eğer. - Distal 4-0 pamuk kravat yeniden kurulması venöz akış bırakın. Veno ve hemostaz kezBize anastomoz proksimal 4-0 pamuk kravat gevşetin ve hemostaz için arteriyel anastomoz gözlemlemek giderek gözlenmiştir.
- Her iki anastomoz güvenli kabul edilir bir kez fare pamuk bağlarını çıkarın. Pierce iki delik yaratarak bir 20 G iğne ile mesane.
- Deliklerden kavisli bir forseps ipuçları Pass ve iki 10-0 naylon sütür ile mesane duvarına tutturulmuş olan üreter proksimal ucu ile forseps ile mesane yoluyla donör üreter çekin. Üreter mesane içinde geri ve iki 10-0 naylon sütür ile deliği kapatmak için izin ikinci delikten çıkan üreter aşırı uzunluğunu kesin.
- Karın barsak dönün. Çalışan bir moda 5-0 İpek sütür kullanarak iki kat karın duvarı kapatın.
- Kapanış üzerine sıvı resüsitasyon olarak karın içine steril sıcak normal serum fizyolojik 1.0 ml bolus yönetmek ve serum fizyolojik subkutan operasyon sonrası bir 0.8 ml enjekte edilir. Başka bir destek olacakziyaretinde önlemler ameliyat sırasında gerekmektedir.
- Bir ısınma battaniye hayvan kurtarın. Toplam implant süresi yaklaşık. 35-45 dk. Böyle buprenorfın, 0.05 mg / kg, SC, prosedürün başlangıcında ve 72 saat sonrası op her 6-12 saatte 0.1-0.2 ml olarak analjezikler yönetin.
3. Kontralateral Nefrektomi
- Protokol şartlarına bağlı olarak, birkaç gün implant işleminden sonra, izofluran anestezisi altında bir kontralateral nefrektomi (indüksiyon için% 5 inhale izofluran, bakım için 1.5-2.0%) gerçekleştirin.
- Karın boşluğu girin ve yavaşça hayvanın sağa barsak geri çekin. Çevre fasya sol böbreği ve künt incelemek Açığa.
- 6-0 ipek dikişlerle renal arter, ven ve üreter bağlanır ve sonra dikişler üzerinde böbrek tüketim ve böbrek çıkarın. Toplam ameliyat süresi yaklaşık. 10 dk.
4. Graft Değerlendirmesi
- Tedbir serum creatialkali pikrat yöntemi (Jaffe reaksiyonu) ile dokuz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu cerrahi teknik, basit greft sağkalım / ret çalışmaları, ya da oldukça karmaşık deneysel protokollerin biri için izin verir. Rakamlar biz bu gelişmiş arter anastomoz tekniği kullanılarak avantajlarını göstermek aşağıda. Biz önemli ölçüde% 0, böylece artan verimlilik% 35 den arteriyel tromboz insidansını azaltmıştır bu tekniği kullanarak. Biz tutulan Aynı% 0 tromboz sonucu bir yıldan bu tekniği kullandık. 1, bu yeni tekniğin temeli olan arteriyel topuk-ve-ayak manşet oluşumu için yöntem açıklanır Şekil. Bu manşet uzun bir anastomoz ve böbrek içine daha düz kan akış yolunun sağlar. Bu iki nokta böylece trombosit aktivasyonu ve trombüs oluşumu olasılığını azaltarak önemli oranda azaltılabilir türbülansı ile sonuçlanır.
2. immünohistokimyasal analizi Şekil. (A) peryodik asit-Schiffs olmayan bir kontrol tra bölümünde lekelinsplanted böbrek. (B) Revize tekniği kullanarak POD 8 A Singeneik böbrek nakli net bir sitoplazma ve hücrenin ortasında bir yuvarlak ışık çekirdeği ile, kübik olan normal bir proksimal tübüler hücreler, göstermektedir. Orada hafif fırça sınır hasarı (oklar) kanıtıdır ancak fırça sınırlarının büyük çoğunluğu düzenli ve iyi korunmuş bulunmaktadır. Büyütme: 400x.
Iki teknik arasında tromboz insidansı ve sıcak iskemi süreleri Tablo 1. karşılaştırılması. Tüm değerler ortalama ± SD olarak ifade edilir. Tek karşılaştırmalar için, normalde dağıtılmış veri unpaired, iki kuyruklu Student t testleri kullanılarak değerlendirildi ve non-normal dağılım verileri parametrik olmayan çiftlenmemiş Mann-Whitney U testi ile analiz edilir. Az 0.05 P değerleri istatistiksel significan kabul edilirt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu nakli tekniği Mastering zordur, ancak başarılı kez çok güçlü bir araştırma aracı. Hasta cerrah / araştırmacı detay ve küçük hayvan modellerinde daha çok herhangi bir cerrahi işlem mastering için anahtar olduğunu tekniğin, tutarlılık dikkat tarafından ödüllendirilir. Fare böbrek nakli mastering teknik zorluklar birçok kıvrımlar vardır ve diğer küçük hayvan nakli modellerinde deneyimi bu yordamı mücadelede önce kazanılan gerektiğini kuvvetle muhtemeldir.
Bir patent lümen korumak için dikiş yerleştirirken karşıt damar duvarları yakalanmış olmamalıdır, yani; bu anastomoz "temiz" olmasını sağlamak için önemlidir. Aksi takdirde başarısız greft ve aşırı durumlarda muhtemel sonuç daha olacak daha o akmaya önemli daralma olacaktır felç ekstremite hind yol açar. Tam kalınlıkta dikiş iğnesinin geçtiği de hayati önem taşımaktadır Bu mühürleme ve anastomuzuna yardımcıları intima-to-intima temas sağlamak kenarların düzgün evertion neden olarak damar adventisya ve intima dahil elde edilir. Hemostatik pıhtılaşma ajan kaçağının azaltılmasında yararlı olabilir, biz bir cerrah yerine iyi bir teknik dayanmak öneririz.
Ayrıca dikkat anastomoz sütür hatlarının gerginlik sağlamak için ödenmelidir çok gevşek, optimal ve neden olacaktır sıkı ve azaltılmış akışına geri dönüşü olmayan sızıntı, orada olacak. Arteriyel tarafta bu greft zayıf perfüzyon neden olacaksa, venöz tarafında kalabalık böbrek neden olacaktır eğer. Bu doğru gerilimi kavuşturulması uygulama ve diğer küçük hayvan mikrovasküler modelleri ile tecrübe meselesidir büyük yardımı olacaktır olduğunu. Mükemmel fare ve greft sağ kalımı ve böbrek nakli işlevini verecek detaylara teknik ve tereddütsüz bütün dikkatini tutarlılık şeyden.
t "> Bu tekniğin sınırlamaları araştırmacı tarafından uygulanabilir kullanımlar sadece yönetilmektedir. Herhangi bir mikrovasküler işlemde olduğu gibi, çok uzun iyi bir teknik sonuçları tekrarlanabilir olmalı görülmektedir.Bu tekniği kullanarak, arteriyel tromboz oranı belirgin şekilde azaltılmıştır. Tüm böbrek nakillerinin en az 1/3 Bu sonuç düşük maliyetler ve artan verimlilik elde kullanılabilir verilere potansiyel teknik arızalardan dönüştürülen.
Tam vaskülarize, ortotopik nakli modeli olarak gelecekteki uygulamalar ret / tolerans çalışmaları, iskemi / reperfüzyon hasarı mekanizmaları içine gecikmiş greft fonksiyonu ve soruşturmaların fenomen içerecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma 1R03DK096151 tarafından kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | Roboz # | Fine Science Tools # | Arosurgical # |
| Straight micro-dissecting forcep #5 | RS-5015 | 11295-51 | |
| Curved micro-dissecting forcep #7 | RS-5047 | 11297-00 | |
| Curved serrated forcep | RS-5137 | 11052-10 | |
| Vannas micro-dissecting scissors, short | RS-5610 | 09.140.08 | |
| Micro-dissecting scissors, straight, sharp, long | 11.602.11 | ||
| Micro spring handle needle holder | 11.549.15 | ||
| Straight mosquito forcep | 91308-12 | ||
| Micro-dissecting scissors, straight, blunt | RS-5962 | 14078-10 | |
| Micro-dissecting scissors, curved, blunt | RS-5981 | 14079-10 | |
| Micro retractor | RS-6540 | ||
| Instrument tray, 10” x 6 ½” x ¾” | RT-1350S | ||
| Silk suture, 5/0, 22.5m spool | 18020-50 | ||
| Suture | |||
| 10/0 nylon | T4A10Q07 | ||
| 5/0 silk | E19A05N | ||
| Gloves | Drapes | ||
| Biogel from Medex Supply | Precept, #64-9012-9 | ||
| Syringes | Cotton applicators | ||
| B-D 1cc insulin, #329424 | Fisher-brand, #23-400-100 | ||
| Povidone-Iodine swabs | |||
| PDI, #B40600 | |||
| 4/0 Cotton ties | |||
| Domestic cotton autoclaved with instruments |
References
- Skoskiewicz, M., Chase, C., Winn, H. J., Russell, P. S. Kidney transplants between mice of graded immunogenetic diversity. Transplant Proc. 5 (1), 721-725 (1973).
- Kalina, S. L., Mottram, P. L. A microsurgical technique for renal transplantation in mice. Aust N Z J Surg. 63 (3), 213-216 (1993).
- Han, W. R., Murray-Segal, L. J., Mottram, P. L. Modified technique for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 19 (6), 272-274 (1999).
- Ge, F., Gong, W. Strategies for successfully establishing a kidney transplant in a mouse model. Exp Clin Transplant. 9 (5), 287-294 (2011).
- Martins, P. N. Learning curve, surgical results and operative complications for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 26 (8), 590-593 (2006).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Zhang, Z. Kidney Transplantation in Mice. Experimental Organ Transplantation. Chen, H., Qian, S. , Nova Science Publishers. 45-64 (2013).
- Zhang, L., Moskovitz, M., Piscatelli, S., Longaker, M. T., Siebert, J. W. Hemodynamic study of different angled end-to-side anastomoses. Microsurgery. 16 (2), 114-117 (1995).
- Liu, Q., Mirc, D., Fu, B. M. Mechanical mechanisms of thrombosis in intact bent microvessels of rat mesentery. J Biomech. 41 (12), 2726-2734 (2008).
- Chesnutt, J. K., Han, H. C. Tortuosity triggers platelet activation and thrombus formation in microvessels. J Biomech Eng. 133 (12), 121004 (2011).
- Han, H. C. Blood vessel buckling within soft surrounding tissue generates tortuosity. J Biomech. 42 (16), 2797-2801 (2009).
- Gutierrez-Diaz, J. A., et al. Intraluminal thrombus and neointimal hyperplasia after microvascular surgery. Surg Neurol. 24 (2), 153-159 (1985).
- Khouri, R. K., Cooley, B. C., Kenna, D. M., Edstrom, L. E. Thrombosis of microvascular anastomoses in traumatized vessels: fibrin versus platelets. Plast Reconstr Surg. 86 (1), 110-117 (1990).
- Johnson, P. C., et al. Initial platelet deposition at the human microvascular anastomosis: effect on downstream platelet deposition to intact and injured vessels. Plast Reconstr Surg. 90 (4), 650-658 (1992).
