Introduction
Seit 1973 wird die Nierentransplantation Modell bei Mäusen wurde ein wertvolles Forschungswerkzeug, aber technische Probleme haben ihren weit verbreiteten Einsatz behindert. Im Laufe der Jahre mehrere Arbeiten veröffentlicht worden Detaillierung Verbesserungen / Verfeinerungen dieses Verfahrens. Als ein Modell der primär vaskularisierte Organtransplantation ist dieses Verfahren wohl nur auf die heterotopen Herztransplantationsmodell, das auch von der Russell Labor im Jahr 1973 6 entwickelt wurde zweite. Beide Modelle eignen sich für die in allogenen Abstoßungsreaktionen, die Entwicklung der verzögerten Transplantatfunktion Forschung und Ischämie-Reperfusionsverletzung.
Eines der häufigsten Probleme mit Nierentransplantation gemeldet werden ist die relativ hohe Inzidenz von arterieller Thrombose 4,5,7, die wir auch in unserem Labor erlebt. Deshalb haben wir dargelegt, um eine Literaturübersicht der Thrombusbildung führen und möglicherweise die Ursache für diese technische Frage zu finden und auch entwickeln einmögliche Lösung. Die wahrscheinlichste Ursache der Thrombose ist die etwas gewundenen Pfad das Blut nimmt vom Empfänger Aorta in den Spender renale Aorta dann zum Spender Nierenarterie. Dieser Weg führt zu Turbulenzen in der Nierenarterie, die Thrombozytenaktivierung und Thrombusbildung führen kann. Basierend auf den bisherigen Beobachtungen und der Suche der einschlägigen Literatur 14.08 kamen wir auf eine neue Technik, die Thrombose auf 0% reduziert hat.
Die hier beschriebene Technik ist von früher berichteten Techniken bei der Bildung eines arteriellen Fersen- und Zehen Manschette, die Einrichtungen verbessern die Durchblutung und die Thrombusbildung signifikant verringert. Die Manschette wird durch Dividieren der infra-renale Aorta über die Fläche des renalen Arterien Ostium in einem Winkel von weniger als 45 o zur Längsachse der Aorta (1A & 1B) gebildet ist. Dies resultiert in einer Manschette ungefähr 2 mm in der Länge. Eine Venen Carrel Patch wird durch Durchtrennung der r gebildetenal Vene in das IVC dadurch den Durchmesser der Manschette erhöht wird. Die Infrarot-Nierenspender Abdominalaorta Fersen- und Zehen Manschette End-zu-Seite-Anastomose an den Empfänger abdominalen Aorta und der Geber Nierenvene / IVC Patch End-zu-Seite-Anastomose an den Empfänger abdominalen Vena cava inferior (IVC) . Des Harnleiters wird dann eingeführt und verankert ist, um der Blase, wie von Han et al. 3 beschrieben
Für diese Studie unbehandelten Transplantaten mit nur warme Ischämie Zeiten (dh., Keine kalte Ischämie) verglichen. In diesem Fall wird warme Ischämie bezieht sich auf die Zeit von der Unterbrechung des Blutflusses durch das Spenderniere (Schritt 1.11 unten) und Reperfusion des Transplantats in den Empfänger (Schritt 2.11 unten). Kaltischämiezeit bezieht sich auf die Zeit, die die Niere nicht perfundiert und in kalten Lagerung bis zum Beginn der Implantation aufbewahrt.
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Protocol
Alle Mäuse wurden von The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) erworben und wurden unter pathogenfreien Bedingungen an der University of Colorado Denver, Barbara Davis-Center Tierhaltung nach NIH-Richtlinien und mit Genehmigung der University of Colorado Denver IACUC untergebracht.
1. Spenderniere Ernte
- Sterilisieren Sie alle Instrumente, tragen sterile Handschuhe während des gesamten Verfahrens und die Aufrechterhaltung eines sterilen Bereich. Führen alle Operationen mit der Verwendung eines Operationsmikroskops.
- Operativ zu entfernen Mausspendernieren von Pentobarbital-narkotisierten (60 mg / kg IP) Spendern. Festzustellen, Narkosetiefe von Zehen Prise, und beobachten Sie die Atemfrequenz.
- Clip der Pelz dann immobilisieren die Maus durch 4-Wege-Fesseln. Bereiten Sie die Haut mit PVP-Jod und drapieren Sie die Maus auf sterile Weise.
- Machen Sie eine 2 cm Mittellinie senkrechten Bauchschnitt und geben Sie die Bauchhöhle. Fahren Sie den Darm superior und externalisieren esauf der Brust. Halten Sie die Darm in sterilen feuchten Gaze während des gesamten Verfahrens gewickelt.
- Identifizieren Sie die großen Bauchgefäße und Mobilisierung, zu identifizieren keine lumbalen Ästen und entweder Kauterisieren oder ligieren sie mit 10/0 Nylonnaht.
- Unmittelbar distal der linken Nierengefäße necken die untere Hohlvene (IVC) und abdominalen Aorta (AA) auseinander stumpf über etwa 2 mm. Ligieren mit 10/0 Nylon und teilen kleinen arteriellen und venösen Zweige von den Nierengefäße.
- Jetzt trennen die Nierenvene von der Nierenarterie vorsichtig stumpf dieser Strukturen. Dies ermöglicht die genaue Erzeugung einer Carrel Patch an dem proximalen Ende der Nierenvene, die verwendet werden, um eine End-zu-Seit-Anastomose an die Empfänger IVC bilden wird.
- Identifizieren Sie, Ligat und teilen Sie die linken Nebengefäße. Dies erlaubt Zugriff auf die Nebennieren Aorta und eine 6-0 Seidennaht wird um die Aorta in Vorbereitung für die Ligation platziert, aber zu diesem Zeitpunkt nicht gebunden. Zu mobilisieren, die Niere, Gefäße und Harnleiter von der umgebenden Armaturenblende. Drehen Sie die Niere rechts und Ligat / aufzuteilen keine hinteren Ästen. Dann den Nieren nach links.
- Jetzt lenken die Aufmerksamkeit auf die Harnleiter. Ohne die Nierenhilus befreien den Harnleiter von der umgebenden facia darauf achten, dass die ureteric Gefäße zu erhalten stören. Teilen Sie die Harnleiter auf der Ebene der Samenleiter. Die Niere ist nun bereit für die Wiederherstellung.
- Langsam injizieren 300 Einheiten Heparin in das distale IVC wodurch die Spender heparinizing. Binden die 6-0-Seidenfaden um die Nebennieren AA gegeben und Perfusion der linken Niere über die distale abdominale Aorta mit 0,8 ml Heparin-Kochsalzlösung (100 U / ml).
- Sobald die Durchblutung aufgehört hat, schaffen eine venöse Carrel Patch sofort auf Rückfluss in der Niere zu entfernen. Ziehen Sie die Nierenvene in Richtung der Nieren enthüllt die AA und Nierenarterie unter.
- Teilen Sie die Aorta neben der Nierenarterie Schaffung einer Ferse und ume Manschette wie in Abbildung 1 dargestellt. Entfernen der Niere, Gefäße und Harnleiter von dem Spender.
- Entfernen der Niere direkt an einen vorbereiteten Empfänger (0 min Kaltischämiezeit) oder bei 4 ° C in einer Lösung der Wahl für eine vorbestimmte Zeit gespeichert, bis zum Zeitpunkt der Implantation. Eingeschläfert die Spender von exsanguanation und Genickbruch. Insgesamt benötigte Zeit, um Spenderniere erholen beträgt ca. 15-20 min.
2. Kidney Implantattechnik
- Betäuben die Empfängermaus mit Pentobarbital (60 mg / kg IP Initialdosis 25 mg / kg IP zusätzliche Dosis falls erforderlich). Festzustellen, Narkosetiefe von Zehen Prise, und beobachten Sie die Atemfrequenz. Clip das Fell dann immobilisieren die Maus durch 4-Wege-Stützen und gelten Augensalbe für die Augen. Bereiten Sie die Haut mit PVP-Jod und drapieren Sie die Maus auf sterile Weise.
- Machen Sie eine 2 cm Mittellinie senkrechten Bauchschnitt und geben Sie die Bauchhöhle. Fahren Sie den Darmsuperior und externalisieren auf der Brust. Halten Sie die Darm in sterilen feuchten Gaze während des gesamten Verfahrens gewickelt.
- Zu diesem Zeitpunkt führen Sie einen rechten Nephrektomie. Ligieren die renale Arterie und Vene mit 6-0 Seidenfäden. Auszuschneiden die Niere distal zu den Nähten. Ligieren des Harnleiters mit 6-0 Seide und teilen proximal der Nieren dann.
- Isolieren Sie die Bauchschlagader und der unteren Hohlvene (IVC) unterhalb der Nierengefäße. Zeigen 4-0 Baumwoll-Krawatten um den Aorta und IVC überlegen dann schlechter als die Anastomose. Identifizieren und zu ligieren keine Lendengefäße innerhalb des Feldes mit 10-0 Nylonnaht.
- Verknoten Sie die Baumwoll Krawatten, zuerst die untere, gefolgt von der Vorgesetzten. Auf diese Weise etwas Blut in die Aorta Herstellung der Aortotomie leichter beibehalten.
- Bilden die Aortotomie mit einer 30G Nadel, um das Lumen der Aorta eingeben. Verlängern Sie den Schnitt mit feinen Mikro Schere auf eine Länge von etwa 2 mm.
- Machen Sie Schluss mit Anastomose des Spenders Aorten-Ferse und Zehen-Manschetteder Empfänger der Aorta in der folgenden Art und Weise. Legen Sie eine 10-0 Nylonnaht Aufenthalt Stich in der Spender Aorta und an den unteren Winkel des Einschnitts in der Empfänger Aorta und Krawatte.
- Legen Sie einen zweiten 10-0 Nylon gegenüber dem ersten in der Spender Aorta und der überlegenen Ecke der Schnitt in der Bauchaorta und Krawatte. Machen Sie eine fortlaufende Naht Linie von oben nach unten in der Seitenwand der Aorta und Krawatte gegen den zuvor platzierten Aufenthalt Stich. Dann Naht der medialen Wand in einem laufenden Mode und Krawatte.
- Machen Sie Schluss mit Anastomose des Spenders Nierenvene an den Empfänger IVC in der folgenden Art und Weise. Punktion der IVC mit einer 30G Nadel und verlängern die Inzision mit feinen Mikroscheren. Binden Sie die Geber Nierenvene an der unteren Ecke der Einschnitt in der IVC mit 10-0 Nylon. Mit Anlauf Nahtlinie zwischen der Nierenvene und der IVC und Krawatte.
HINWEIS: Es ist auch sehr wichtig, dass die gesamte Dicke durchläuft der Nähnadel einschließlich der Gefäß adventitia und die Intima erreicht. Umstülpen der Kanten gewährleistet auch, dass es Intima-zu-Intima-Kontakt, der in dichtendem und Heilung der Anastomosen hilft. Während eine blutstillende Gerinnungsmittel kann zur Verringerung dicht sein, empfehlen wir, dass ein Chirurg stattdessen auf gute Technik verlassen. - Stellen Sie sicher, dass die Anastomosen sind "sauber". Das heißt, dass die gegenüberliegenden Wände nicht bei der Platzierung Maschen verfangen. Dies wird zu einer signifikanten Verengung fließen, daß in einem fehl Transplantat und im Extremfall zu Lähmung der hinteren Gliedmaßen führen.
HINWEIS: Ein weiterer entscheidender wichtiger Faktor ist sicherzustellen, dass die Spannung der Anastomosen Nahtlinien ist auch optimal. Zu locker und es wird irreversible undicht, zu eng und Stenose zu fließen die Folge sein. Wenn auf der arteriellen Seite dies führt zu einer schlechten Durchblutung des Transplantats führen, wenn sie auf der venösen Seite eine lasteten Niere führen. - Lassen Sie die distalen 4-0 Baumwoll Krawatte Wiedereinführung venösen Rückstrom. Sobald die Hämostase des venouns Anastomose hat sich allmählich beobachtet lösen Sie die proximalen 4-0 Baumwoll Krawatte und beobachten Sie die arterielle Anastomose zur Blutstillung.
- Entfernen Sie die Baumwollbinder von der Maus, wenn beide Anastomosen gelten als sicher. Pierce die Blase mit einer 20 G-Nadel die Schaffung von zwei Löchern.
- Übergeben Sie die Spitzen der gebogenen Pinzette durch die Löcher und ziehen Sie den Geber Harnleiter durch die Blase mit der Zange mit dem proximalen Ende des Harnleiters an der Blasenwand mit zwei 10-0 Nylon-Fäden verankert. Schneiden Sie die überschüssige Länge des Harnleiters aus dem zweiten Loch so dass der Harnleiter, um in der Blase zurücknehmen und schließen Sie das Loch mit zwei 10-0 Nylon-Fäden ragen.
- Schicken Sie das Darm auf den Bauch. Schließen Sie die Bauchwand in zwei Schichten mit 5-0 Seidennaht in einem laufenden Mode.
- Verabreichung einer 1,0 ml-Bolus von sterilen, warm normaler Salzlösung in den Bauchraum als Flüssigkeitszufuhr beim Schließen und injizieren 0,8 ml normaler Kochsalzlösung subkutan postoperativ. Keine andere supportiwährend der Operation sind ve Maßnahmen erforderlich.
- Recover das Tier auf einer Wärmedecke. Insgesamt Implantat Zeit beträgt ca. 35-45 min. Verabreichen Analgetika wie Buprenorphin 0,05 mg / kg, SC, 0,1-0,2 ml zu Beginn des Verfahrens und alle 6-12 h für 72 Stunden nach der Operation.
3. kontralaterale Nephrektomie
- Je nach den Protokollanforderungen, einige Tage nach der Implantation, führen Sie eine kontralaterale Nephrektomie unter Isofluran-Narkose (5% inhaliert Isofluran zur Induktion von 1,5 bis 2,0% für die Wartung).
- Geben Sie die Bauchhöhle und sanft zurückziehen den Darm nach rechts des Tieres. Setzen Sie die linke Niere und stumpf sezieren von den umgebenden Faszie.
- Ligieren die renale Arterie, Vene und Harnleiter mit 6-0 Seidenfäden und dann auszuschneiden die Niere über den Nähten und entfernen Sie die Niere. Gesamtoperationszeit beträgt ca. 10 min.
4. Graft-Bewertung
- Maßnahme Serum creatineun mit dem alkalische Pikrat-Methode (Jaffe-Reaktion).
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Representative Results
Diese Operationstechnik ermöglicht sowohl einfache Transplantatüberleben / Ablehnung Studien oder sehr komplex experimentelle Protokolle. In den folgenden Abbildungen zeigen wir die Vorteile der Verwendung dieser verbesserten arteriellen Anastomose Technik. Unter Verwendung dieser Technik haben wir deutlich auf 0% erhöht damit die Produktivität verringert die Häufigkeit von arteriellen Thrombosen von 35%. Wir haben diese Technik für über ein Jahr mit derselben 0% Thrombose Ergebnis aufrechterhalten verwendet. Figur 1 beschreibt das Verfahren zur Bildung des arteriellen Fersen- und Zehen Manschette, die die Basis dieser neuen Technik ist. Diese Manschette sieht eine längere Anastomose und eine geradere Blutströmungsweg in der Niere. Beide dieser Punkte führen zu deutlich verringert Turbulenzen, wodurch die Wahrscheinlichkeit der Thrombozytenaktivierung und Thrombusbildung verringert wird.
Abbildung 2. Immunhistochemische Analyse. (A) Periodic Acid-Schiff gefärbten Abschnitt einer Steuer nicht-transplanted Niere. (B) A syngenen Nierentransplantation bei POD 8 mit der Revised Technik zeigt normale Zellen proximaler Tubuli, die quaderförmig sind, mit einem klaren Zytoplasma und einem runden Lichtkern in der Mitte der Zelle. Es gibt Hinweise auf milde Bürstensaum Verletzungen (Pfeile), aber der Großteil der Bürste Grenzen regelmäßig und gut erhalten sind. Vergrößerung: 400x.
Tabelle 1. Vergleich von Thrombose Häufigkeit und warme Ischämie Zeiten zwischen den beiden Techniken. Alle Werte sind als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Für Einzelvergleiche, normal verteilt sind Daten mit ungepaarten, zweiseitigen Student t-Tests bewertet und nicht-normalverteilten Daten werden durch die nichtparametrische ungepaarten Mann-Whitney U-Test analysiert. P-Werte von weniger als 0,05 werden als statistisch significant.
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Discussion
Die Beherrschung dieser Transplantationstechnik ist schwierig, aber einmal erreicht ist ein sehr leistungsfähiges Forschungswerkzeug. Der Patient Chirurg / Forscher wird durch die Liebe zum Detail und die Konsistenz der Technik, die der Schlüssel zur Beherrschung jedem chirurgischen Eingriff, mehr noch in kleinen Tiermodellen ist belohnt. Die technischen Schwierigkeiten der Beherrschung der Maus Nierentransplantation sind viele Falten, und es ist sehr wahrscheinlich, dass Erfahrungen in anderen Kleintiertransplantationsmodelle müssen, bevor sie sich dieses Verfahren gewonnen werden.
Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die Anastomosen sind "sauber", dh, die gegenüberliegenden Gefäßwände dürfen nicht bei der Platzierung Stiche, um eine Patent Lumen aufrechtzuerhalten gefangen werden. Sonst gibt es signifikante Verengung auf, dass wird mehr fließen als wahrscheinlich zu einem gescheiterten Transplantat und im Extremfall führen zu hinter-Beinlähmung. Es ist auch sehr wichtig, dass die gesamte Dicke durchläuft der Nähnadel einschließlich der vaskulären Intima und Adventitia erreicht werden, da dies zu richtigen evertion der Kanten gewährleisten, dass es Intima-zu-Intima-Kontakt, der in dichtendem und Heilung der Anastomosen hilft. Während eine blutstillende Gerinnungsmittel kann zur Verringerung dicht sein, empfehlen wir, dass ein Chirurg stattdessen auf gute Technik verlassen.
Auch muss darauf geachtet, die Spannung der Anastomosen Nahtlinien zu zahlen ist optimal, zu verlieren und es wird irreversible undicht, zu eng und reduzierten Strömungs die Folge sein. Wenn auf der arteriellen Seite dies führt zu einer schlechten Durchblutung des Transplantats führen, wenn sie auf der venösen Seite eine lasteten Niere führen. Erreichung dieses richtige Spannung ist eine Frage der Übung und Erfahrung mit anderen Kleintiermikrovaskulären Modelle werden eine große Hilfe sein. Vor allem die Konsistenz der Technik und unerschütterliche Liebe zum Detail wird hervorragende Maus und Transplantatüberleben und Nierentransplantatfunktion ergeben.
t "> Die Grenzen dieses Verfahrens werden nur von den Verwendungen, die vom Untersuchenden angelegt werden kann geregelt. Wie bei jedem mikrovaskulären Verfahren, solange gute Technik wird beobachtet, die Ergebnisse sind reproduzierbar.Die Häufigkeit von arteriellen Thrombosen mit Hilfe dieser Technik drastisch reduziert worden. Dies führt zu mindestens 1/3 aller Nierentransplantationen gegen mögliche technische Ausfälle, um brauchbare Daten umgewandelt, was zu reduzierten Kosten und erhöhte Produktivität.
Als vollständig vaskularisiert, orthotopen Transplantationsmodell die zukünftige Anwendungen gehören Ablehnung / Verträglichkeitsstudien, das Phänomen des verzögerten Transplantatfunktion und Untersuchungen in die Mechanismen der Ischämie / Reperfusion Verletzungen.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise durch 1R03DK096151 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | Roboz # | Fine Science Tools # | Arosurgical # |
| Straight micro-dissecting forcep #5 | RS-5015 | 11295-51 | |
| Curved micro-dissecting forcep #7 | RS-5047 | 11297-00 | |
| Curved serrated forcep | RS-5137 | 11052-10 | |
| Vannas micro-dissecting scissors, short | RS-5610 | 09.140.08 | |
| Micro-dissecting scissors, straight, sharp, long | 11.602.11 | ||
| Micro spring handle needle holder | 11.549.15 | ||
| Straight mosquito forcep | 91308-12 | ||
| Micro-dissecting scissors, straight, blunt | RS-5962 | 14078-10 | |
| Micro-dissecting scissors, curved, blunt | RS-5981 | 14079-10 | |
| Micro retractor | RS-6540 | ||
| Instrument tray, 10” x 6 ½” x ¾” | RT-1350S | ||
| Silk suture, 5/0, 22.5m spool | 18020-50 | ||
| Suture | |||
| 10/0 nylon | T4A10Q07 | ||
| 5/0 silk | E19A05N | ||
| Gloves | Drapes | ||
| Biogel from Medex Supply | Precept, #64-9012-9 | ||
| Syringes | Cotton applicators | ||
| B-D 1cc insulin, #329424 | Fisher-brand, #23-400-100 | ||
| Povidone-Iodine swabs | |||
| PDI, #B40600 | |||
| 4/0 Cotton ties | |||
| Domestic cotton autoclaved with instruments |
References
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