Introduction
מאז 1973 מודל השתלת הכליה בעכברים היה כלי מחקר חשובים, אבל בעיות טכניות שהקשו על השימוש הנרחב שלה. במהלך השנים כמה מאמרים שפורסמו מפרטים שיפורים / חידודים להליך זה. כמודל של השתלת איברים מוצקה בעיקר כלי דם בהליך זה הוא כנראה שני רק למודל השתלת לב heterotopic שגם תוכנן על ידי המעבדה ראסל בשנת 1973 6. שני הדגמים להשאיל את עצמם כדי לחקור לתגובות דחייה אלוגנאית, הפיתוח של פונקצית שתל מושהה ופגיעת reperfusion איסכמיה.
אחת מהבעיות הנפוצות ביותר שדווח בהשתלת כליה הוא יחסית השכיחות הגבוהה של פקקת עורקי 4,5,7 שגם אנחנו חווינו במעבדה שלנו. לכן יצאנו לביצוע סקר ספרות של היווצרות קרישי דם ואולי למצוא את הסיבה לבעיה טכנית זה וגם לתכנןפתרון אפשרי. הסיבה הסבירה ביותר של פקקת היא הנתיב מפותל מעט הדם לוקח מאב עורקי הנמען, לאב עורקי הכליה התורם לאחר מכן על עורק הכליה התורם. בדרך זו גורמת למערבולת בעורק הכליה אשר יכול להוביל להפעלה של טסיות דם והיווצרות קרישי דם. בהתבסס על התצפיות האחרונות וחיפוש של ספרות רלוונטית 8-14 באנו עם טכניקה חדשה שצמצמה פקקת ל -0%.
הטכניקה המתוארת כאן משתנה מטכניקות שדווחו בעבר במבנה של שרוול העקב ובוהן עורקים שמתקנים השתפרו זרימת דם והמפחית באופן משמעותי היווצרות קרישי דם. השרוול נוצר על ידי חלוקת אב העורקים אינפרא כליה על פניו של ostium עורקי הכליות בזווית פחות מ -45 o לציר האורך של אב העורקים (איור 1 א & 1B). התוצאה שרוול כ 2 מ"מ באורך. תיקון קארל ורידים נוצר על ידי חוצה rוריד enal לתוך IVC וכך להגדיל את הקוטר של השרוול. אינפרא-כליות שרוול העקב ובוהן תורם בטן אב העורקים הוא מקצה לצד anastomosed לאב העורקים בבטן הנמען ווריד הכליה התורם / תיקון IVC הוא הסוף לצד anastomosed לווריד הנבוב נחות בטן הנמען (IVC) . שופכן הוא הציג אז ולמעוגן לשלפוחית השתן כפי שתואר על ידי האן ואח '3.
במחקר זה השתלות שלא טופלו עם פעמים איסכמיה החמה בלבד (כלומר., אין איסכמיה הקרה) הן בהשוואה. במקרה זה איסכמיה החמה מתייחסת לזמן מהפסקת זרימת דם דרך הכליות התורמות (שלב 1.11 להלן) וreperfusion של השתל בנמען (שלב 2.11 להלן). איסכמיה הקרה מתייחסת לזמן שהכליות לא perfused ונשמר בקירור עד לתחילת הליך השתל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל העכברים נרכשו מהמעבדה ג'קסון (בר הרבור, ME) ושוכנו בתנאים חופשיים הפתוגן באוניברסיטת קולורדו בדנוור, מתקן ברברה דייויס מרכז בעלי חיים על פי הנחיות NIH ועם אישורה של אוניברסיטת קולורדו דנבר IACUC.
קציר כליות 1. התורם
- לעקר את כל המכשירים, ללבוש כפפות סטריליות בכל ההליך ולשמור על שדה סטרילי. לבצע את כל הניתוחים בשימוש במיקרוסקופ הפעלה.
- בניתוח להסיר כליות תורם עכבר מ( קילוגרם IP 60mg /) תורמים-הרדים pentobarbital. לברר לעומק של הרדמה על ידי הבוהן קמצוץ, ולבחון את קצב הנשימה.
- קליפ הפרווה אז לשתק את העכבר על ידי ריסון 4-דרך. הכן את העור עם povidone- יוד ולעטוף את העכבר בצורה סטרילית.
- לעשות חתך אנכי בטן 2 קו האמצע סנטימטר ולהיכנס לחלל הבטן. לחזור מעי superiorly ולהחצין את זהעל החזה. שמור את המעי עטוף בגזה לחה סטרילי לאורך כל ההליך.
- זהה את כלי בטן הגדולים ולגייס אותם, לזהות כל סניפים המותני וגם לצרוב או לקשור אותם עם 10/0 תפר ניילון.
- מייד דיסטלי כלי הכליה השמאלי להקניט את נחות הווריד נבוב (IVC) ואב עורקים בבטן (AA) לגזרים על ידי נתיחה בוטה על כ 2 מ"מ. ולקשור עם 10/0 ניילון ולחלק עורקים קטנים וסניפי ורידים מכלי הכליות.
- עכשיו להפריד את וריד הכליה מעורק הכליה בקפידה על ידי נתיחה בוטה של מבנים אלה. זה מאפשר ליצירה מדויקת של תיקון קארל בקצה הפרוקסימלי של עורק הכליה, אשר תשמש ליצירת השקה קצה לצד למקבלי IVC.
- לזהות, לקשור ולחלק את כלי יותרת הכליה השמאלי. זה מאפשר גישה לאב עורקי suprarenal ותפר 6-0 משי ממוקם סביב אב העורקים בהכנה לקשירה, אבל לא קשור בשלב זה. לגייס את הכליות, כלי דם ושופכן מfacia שמסביב. סובב את הכליות לימין ולקשור / לחלק כל סניפים אחורי. לאחר מכן להחזיר את הכליות לשמאל.
- עכשיו להפנות את תשומת לב לשופכן. מבלי להפריע hilum הכליה לשחרר את השופכן מטיפול לקיחת facia סביב לשמר את כלי ureteric. מחלקים את השופכן ברמה של הזרע ductus. הכליות היא מוכנות לשחזור החברה.
- לאט לאט להזריק 300 יחידות של הפרין לIVC דיסטלי כך heparinizing התורם. לקשור את תפר 6-0 משי ממוקם סביב AA suprarenal וינקב בכליות השמאלית דרך אב העורקים בבטן דיסטלי עם 0.8ml של תמיסת מלח הפרין (100 U / ml).
- ברגע שזלוף חדל ליצור תיקון קארל ורידים מייד לחסל את הזרימה חוזרת לכליות. לחזור וריד הכליה לכליה חושפת AA ועורק כליה מתחת.
- מחלקים את אב העורקים בסמוך לעורק הכליה יצירת העקב ולשרוול דואר כפי שמוצג באיור 1. הסר את הכליות, כלי הדם ושופכן מהתורם.
- הסר את הכליות ישירות לנמען מוכן מראש (זמן 0 דקות קר איסכמיה) או מאוחסן על 4 מעלות צלסיוס בפתרון של בחירה במשך זמן שנקבע מראש עד למועד השתלה. מורדמים התורמים ידי exsanguanation ונקע בצוואר הרחם. סה"כ זמן להתאושש כליות תורמות הוא כ. 15-20 דקות.
טכניקה שתל 2. כליות
- להרדים את עכבר הנמען עם pentobarbital (60 מ"ג / קילוגרם מינון ראשוני IP, 25mg מינון משלים / קילוגרם IP אם נדרש). לברר לעומק של הרדמה על ידי הבוהן קמצוץ, ולבחון את קצב הנשימה. קליפ הפרווה אז לשתק את העכבר על ידי ריסון 4-דרך ולהחיל משחת עיניים לעיניים. הכן את העור עם povidone- יוד ולעטוף את העכבר בצורה סטרילית.
- לעשות חתך אנכי בטן 2 קו האמצע סנטימטר ולהיכנס לחלל הבטן. לחזור המעיsuperiorly ולהחצין לחזה. שמור את המעי עטוף בגזה לחה סטרילי לאורך כל ההליך.
- בשלב זה לבצע כריתת כליה תקין. ולקשור את עורק הכליה ווריד עם 6-0 תפרי משי. בלו דיסטלי הכליות לתפרים. לקשור את השופכן עם 6-0 משי ולאחר מכן לחלק הפרוקסימלי לכליות.
- לבודד את וריד אב העורקים בבטן ונבוב נחות (IVC) מתחת לכלי הכליות. מניחים 4-0 קשרי כותנה סביב אב העורקים וIVC מעולה אז נחות לאתר ההשקה. לזהות ולקשור כל כלי המותני בתחום עם 10-0 תפר ניילון.
- קשר קשרי הכותנה, ראשון הנחות ואחריו מעולה. בדרך זו כמה דם נשמרים באב העורקים עושים aortotomy קלים יותר.
- טופס aortotomy עם מחט 30G להיכנס ללומן של אב העורקים. להאריך את החתך עם מספריים מיקרו קנס לאורך של כ 2 מ"מ.
- הפוך קץ להשקת צד של שרוול העקב ובוהן אב העורקים תורם לאב העורקים הנמען באופנה הבאה. מניחים תפר שהות תפר 10-0 ניילון באב העורקים ותורם לזווית הנחותה של החתך באב עורקי הנמען והעניבה.
- הנח 10-0 ניילון שני מול הראשון באב עורקי התורם והפינה מעולה של החתך באב העורקים ועניבת הבטן. הפוך קו תפר פועל ממעולה לנחות בקיר לרוחב של אב העורקים ולקשור נגד תפר השהות הניח בעבר. אז תפר את הקיר המדיאלי באופנה ועניבה פועלת.
- הפוך קץ להשקת צד של עורק הכליה התורם למקבל IVC באופנה הבאה. לנקב את IVC עם מחט 30G ולהרחיב את החתך במספריים מיקרו קנס. לקשור את עורק הכליה התורם לפינה הנחות של החתך בIVC עם 10-0 ניילון. הפוך קו תפר פועל בין עורק הכליה וIVC והעניבה.
הערה: זה גם חשוב וחיוני שעובי מלא עובר מחט התפר כולל adventit כלי הדםIA ואינטימה מושגות. Eversion של הקצוות גם מבטיח כי יש קשר אינטימה לאינטימה, אשר מסייע באיטום וריפוי של anastomoses. בעוד סוכן קרישה עוצר דמום יכול להיות שימושי לצמצום דליפות, אנו ממליצים שמנתח במקום להסתמך על טכניקה טובה. - ודא שanastomoses הם "נקי". כלומר, שהקירות היריבים לא נתפסו בעת ביצוע תפרים. זה יגרום התכווצות משמעותית לזרום שיגרמו שתל נכשל ובמקרים קיצוניים לשיתוק גפיים האחורי.
הערה: הגורם חשוב ביותר נוסף הוא להבטיח כי המתח של קווי תפר בהשקה הוא גם אופטימלי. רופף מדי ולא יהיו דליפה בלתי הפיכה, הדוקה מדי וצרות לזרום יגרום. אם בצד העורקים זה יגרום זלוף העני של השתל, אם בצד ורידי כליות צפופות יגרמו. - שחרר את זרימת ורידי 4-0 עניבת כותנה מחדש הקמת דיסטלי. ברגע עצירת הדימום של Venoהשקתנו נצפתה בהדרגה לשחרר את העניבה הפרוקסימלי 4-0 הכותנה ולבחון את ההשקה העורקים לעצירת דימום.
- הסר את קשרי כותנה מהעכבר פעם אחת שני anastomoses נחשב מאובטח. פירס השלפוחית עם מחט 20 G יצירת שני חורים.
- לעבור את הטיפים של מלקחיים מעוקלים דרך החורים ולמשוך את השופכן התורם דרך שלפוחית השתן עם המלקחיים עם הקצה הפרוקסימלי של השופכן שמעוגן לקיר שלפוחית השתן עם שני 10-0 תפרי ניילון. חתוך את האורך העודף של השופכן הבולט מהחור השני מאפשר השופכן לחזור בתוך שלפוחית השתן ולסגור את החור עם שני 10-0 תפרי ניילון.
- להחזיר את המעי לבטן. סגור את דופן הבטן בשתי שכבות באמצעות 5-0 תפר משי באופנת ריצה.
- לנהל בולוס 1.0 מיליליטר של תמיסת מלח סטרילית, חמה רגילה לתוך הבטן כהחייאת נוזלים על סגירה, ולהזריק 0.8 מיליליטר של שלאחר ניתוח מתחת לעור מלח רגיל. אין supporti האחרצעדי ve נדרשים במהלך הניתוח.
- לשחזר את החיה על שמיכת התחממות. זמן שתל כולל הוא כ. 35-45 דק '. לנהל משככי כאבים כגון עצירות, 0.05 מ"ג / קילוגרם, SC, 0.1-0.2 מיליליטר בתחילת ההליך וכל שעה 6-12 למנותח 72 שעות.
3. נגדי כריתת כליה
- בהתאם לדרישות הפרוטוקול, כמה ימים לאחר הליך השתל, לבצע כריתת כליה נגדי תחת ההרדמה isoflurane (5% isoflurane בשאיפה לזירוז, 1.5-2.0% לתחזוקה).
- הזן את חלל הבטן ובעדינות לחזור המעי לזכותו של בעלי החיים. לחשוף את הכליה השמאלית ולנתח בוטים מfascia שמסביב.
- ולקשור את העורק, וריד הכליה והשופכן עם 6-0 תפרי משי ולאחר מכן יחתוך את הכליה מעל התפרים ולהסיר את הכליות. זמן ניתוח כולל הוא כ. 10 דקות.
4. הערכת שתל
- creati סרום מידהתשע בשיטת picrate אלקליין (התגובה יפה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
טכניקה ניתוחית זו מאפשרת לשני מחקרים פשוטים שתל הישרדות / דחייה, או פרוטוקולי ניסוי מורכבים למדי. בנתוני להלן אנחנו מדגימים את היתרונות של שימוש בטכניקה זו השקה משופרת עורקים. שימוש בטכניקה זו צמצמנו באופן משמעותי את השכיחות של פקקת עורקים מ -35% ל 0% ובכך להגדיל את התפוקה. אנחנו השתמשנו בטכניקה זו ליותר משנה עם אותה התוצאה פקקת 0% נשמרה. איור 1 מתאר את השיטה ליצירת שרוול העקב ובוהן עורקים המהווה את הבסיס של טכניקה חדשה זו. שרוול זה מספק להשקה ארוכה יותר וזרימת דם דרך ישרה לכליות. שתי נקודות אלה לגרום למערבולת פחתה באופן משמעותי ובכך להפחית את הסבירות של הפעלת טסיות דם והיווצרות קרישי דם.
איור 2. ניתוח אימונוהיסטוכימיים. () תקופתי חומצה שיף מוכתם סעיף של אי-tra שליטהכליות nsplanted. (ב) להשתלת כליה syngeneic בPOD 8 באמצעות הטכניקה המתוקנת מדגימה תאים נורמלים הפרוקסימלי צינורי, שהם cuboidal, עם ציטופלסמה ברורה וגרעין אור עגול באמצע התא. יש עדויות לפגיעה בגבול מברשת עדינה (חיצים) אבל רוב גבולות מברשת הן רגילים והשתמר היטב. הגדלה: 400x.
טבלת השוואה של שכיחות 1. פקקת ופעמים איסכמיה חמות בין שתי הטכניקות. כל הערכים באות לידי ביטוי כממוצע ± סטיית תקן. להשוואות בודדות, הנתונים מתפלגים נורמלי מוערכים באמצעות בדיקות מזווגים, שני זנב לא סטודנט, ונתונים מבוזרים-בדרך כלל אינם מנותחים על ידי מבחן Mann-Whitney U פרמטרית מזווג. ערכי P של פחות מ 0.05 נחשבים סטטיסטי משמעותיתלא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאסטרינג טכניקת השתלה זה קשה, אבל ברגע שהשיג את זה הוא כלי מחקר חזק מאוד. המנתח / חוקר המטופל יתוגמל על ידי תשומת לב לפרטים ועקביות של טכניקה, המהווה את המפתח לשליטה בכל הליך כירורגי, עוד יותר מכך במודלים של בעלי חיים קטנים. הקשיים הטכניים של שליטה בהשתלת הכליה העכבר הם קפלים רבים, וקיימת סבירות גבוהה שניסיון במודלים של בעלי החיים קטנים אחרים השתלה חייב להיות שנרכש לפני ההתמודדות בהליך זה.
חשוב להבטיח כי anastomoses הם "נקי", כלומר, קירות כלי דם היריבים אסור להיתפס בעת ביצוע תפרים על מנת לשמור על לומן פטנט. אחרת לא תהיה התכווצות משמעותית לזרום שיהיו יותר סיכוי תוצאה בשתל נכשל ובמקרים קיצוניים להוביל לשיתוק גפיים אחורי-. כמו כן, חשוב וחיוני שעובי מלא עובר מחט התפר כולל adventitia כלי הדם ואינטימה מושגות כזה תוצאות בevertion התקינה של הקצוות להבטיח כי יש קשר אינטימה לאינטימה אשר מסייע באיטום וריפוי של anastomoses. בעוד סוכן קרישה עוצר דמום יכול להיות שימושי לצמצום דליפות, אנו ממליצים שמנתח במקום להסתמך על טכניקה טובה.
כמו כן יש לשים לב להבטחת המתח של קווי תפר בהשקה הוא אופטימלי, רופף מדי ולא תהיה דליפה בלתי הפיכה, לזרימה חזק ומופחתת תגרום. אם בצד העורקים זה יגרום זלוף העני של השתל, אם בצד ורידי כליות צפופות יגרמו. השגת מתח נכון זה עניין של תרגול וניסיון עם מודלים כלי דם של בעלי החיים קטנים אחרים יהיה לעזר רב. מעל לכל העקביות של טכניקה ותשומת לב בלתי מתפשרת לפרטים תניב עכבר מצוין והישרדות שתל, ותפקוד השתלת הכליה.
לא "> המגבלות של טכניקה זו נשלטות רק על ידי השימושים שיכולים להיות מיושמים על ידי החוקר. כמו בכל הליך כלי דם, טכניקה טובה כל כך הרבה זמן כפי שנצפתה התוצאות צריכה להיות לשחזור.השכיחות של פקקת עורקים באמצעות טכניקה זו צומצמה באופן דרסטי. שתוצאות בלפחות 1/3 מכל השתלות הכליה זה יומר מכשלים טכניים פוטנציאל לנתונים שימושיים, וכתוצאה מכך לצמצום עלויות והגדלת תפוקה.
כמודל להשתלת כלי דם באופן מלא, orthotopic היישומים העתידיים יכללו דחייה / מחקרי סובלנות, התופעה של תפקוד שתל מתעכב וחקירות לתוך המנגנונים של פגיעת איסכמיה / reperfusion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי 1R03DK096151.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | Roboz # | Fine Science Tools # | Arosurgical # |
| Straight micro-dissecting forcep #5 | RS-5015 | 11295-51 | |
| Curved micro-dissecting forcep #7 | RS-5047 | 11297-00 | |
| Curved serrated forcep | RS-5137 | 11052-10 | |
| Vannas micro-dissecting scissors, short | RS-5610 | 09.140.08 | |
| Micro-dissecting scissors, straight, sharp, long | 11.602.11 | ||
| Micro spring handle needle holder | 11.549.15 | ||
| Straight mosquito forcep | 91308-12 | ||
| Micro-dissecting scissors, straight, blunt | RS-5962 | 14078-10 | |
| Micro-dissecting scissors, curved, blunt | RS-5981 | 14079-10 | |
| Micro retractor | RS-6540 | ||
| Instrument tray, 10” x 6 ½” x ¾” | RT-1350S | ||
| Silk suture, 5/0, 22.5m spool | 18020-50 | ||
| Suture | |||
| 10/0 nylon | T4A10Q07 | ||
| 5/0 silk | E19A05N | ||
| Gloves | Drapes | ||
| Biogel from Medex Supply | Precept, #64-9012-9 | ||
| Syringes | Cotton applicators | ||
| B-D 1cc insulin, #329424 | Fisher-brand, #23-400-100 | ||
| Povidone-Iodine swabs | |||
| PDI, #B40600 | |||
| 4/0 Cotton ties | |||
| Domestic cotton autoclaved with instruments |
References
- Skoskiewicz, M., Chase, C., Winn, H. J., Russell, P. S. Kidney transplants between mice of graded immunogenetic diversity. Transplant Proc. 5 (1), 721-725 (1973).
- Kalina, S. L., Mottram, P. L. A microsurgical technique for renal transplantation in mice. Aust N Z J Surg. 63 (3), 213-216 (1993).
- Han, W. R., Murray-Segal, L. J., Mottram, P. L. Modified technique for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 19 (6), 272-274 (1999).
- Ge, F., Gong, W. Strategies for successfully establishing a kidney transplant in a mouse model. Exp Clin Transplant. 9 (5), 287-294 (2011).
- Martins, P. N. Learning curve, surgical results and operative complications for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 26 (8), 590-593 (2006).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Zhang, Z. Kidney Transplantation in Mice. Experimental Organ Transplantation. Chen, H., Qian, S. , Nova Science Publishers. 45-64 (2013).
- Zhang, L., Moskovitz, M., Piscatelli, S., Longaker, M. T., Siebert, J. W. Hemodynamic study of different angled end-to-side anastomoses. Microsurgery. 16 (2), 114-117 (1995).
- Liu, Q., Mirc, D., Fu, B. M. Mechanical mechanisms of thrombosis in intact bent microvessels of rat mesentery. J Biomech. 41 (12), 2726-2734 (2008).
- Chesnutt, J. K., Han, H. C. Tortuosity triggers platelet activation and thrombus formation in microvessels. J Biomech Eng. 133 (12), 121004 (2011).
- Han, H. C. Blood vessel buckling within soft surrounding tissue generates tortuosity. J Biomech. 42 (16), 2797-2801 (2009).
- Gutierrez-Diaz, J. A., et al. Intraluminal thrombus and neointimal hyperplasia after microvascular surgery. Surg Neurol. 24 (2), 153-159 (1985).
- Khouri, R. K., Cooley, B. C., Kenna, D. M., Edstrom, L. E. Thrombosis of microvascular anastomoses in traumatized vessels: fibrin versus platelets. Plast Reconstr Surg. 86 (1), 110-117 (1990).
- Johnson, P. C., et al. Initial platelet deposition at the human microvascular anastomosis: effect on downstream platelet deposition to intact and injured vessels. Plast Reconstr Surg. 90 (4), 650-658 (1992).
