Introduction
Sedan 1973 njurtransplantation modellen i möss har varit ett värdefullt forskningsverktyg, men tekniska problem har hämmat dess utbredda användning. Under årens lopp har flera artiklar har publicerats detaljer förbättringar / förbättringar av detta förfarande. Som en modell av främst kärl fast organtransplantation detta förfarande är förmodligen näst heterotopisk hjärttransplantation modell som också utarbetats av Russell laboratoriet 1973 6. Båda modellerna lämpar sig för forskning om allogen avstötningssvar, utveckling av fördröjd transplantatfunktion och ischemi reperfusionsskada.
En av de vanligaste frågorna som ska rapporteras med njurtransplantation är den relativt höga förekomsten av arteriell trombos 4,5,7 som vi upplevt också i vårt laboratorium. Därför har vi satt ut att utföra en litteraturgenomgång av blodproppsbildning och eventuellt hitta orsaken till denna tekniska fråga och även utarbeta enmöjlig lösning. Den troligaste orsaken till trombos är den något slingrig väg blodet tar från mottagaren aorta, i donatornjur aorta sedan vidare till donatornjurartären. Denna väg orsakar turbulens i njurartären som kan leda till blodplättsaktivering och blodproppsbildning. Baserat på den senaste tidens observationer och en sökning av relevant litteratur 8-14 vi kom upp med en ny teknik som har minskat trombos till 0%.
Tekniken som beskrivs här varierar från tidigare rapporterade tekniker i bildandet av en arteriell häl-och-tå manschett vilka anläggningar förbättrade blodflödet och minskar blodproppar bildas. Manschetten är bildad genom att dividera den infra renala aorta över ytan av njurartär ostium med en vinkel mindre än 45 ° mot längdaxeln av aorta (Figur 1A & 1 B). Detta resulterar i en manschett omkring 2 mm i längd. En venös Carrel plåster bildas genom transecting renal venen i IVC därigenom öka diametern på manschetten. Den infranjurdonator bukaorta häl-och-tå manschetten är end-to-sida anastomoseras till mottagaren bukaorta och givaren njurvenen / IVC patch är end-to-sida anastomoseras till mottagaren buken sämre hålvenen (IVC) . Urinledaren införs sedan in i och förankrad till blåsan, såsom beskrivs av Han et al, 3.
För denna studie obehandlade transplantationer med bara varm ischemi tider (dvs.., Ingen kall ischemi) jämförs. I det här fallet varm ischemi avser tiden från upphörandet av blodflödet genom donatornjuren (steg 1.11 nedan) och reperfusion av transplantatet i mottagaren (steg 2.11 nedan). Kall ischemi avses den tid att njuren inte perfunderas och hålles i kylrum fram till början av implantationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla möss köptes från The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) och inhystes i patogenfria förhållanden vid University of Colorado Denver, Barbara Davis Center Animal Facility enligt NIH riktlinjer och med godkännande av University of Colorado Denver IACUC.
1. donatornjuren Harvest
- Sterilisera alla instrument, bära sterila handskar under hela förfarandet och upprätthålla ett sterilt område. Utför alla operationer med hjälp av ett operationsmikroskop.
- Kirurgiskt ta bort musen donor njurarna från pentobarbital-sövda (60mg / kg IP) givare. Fastställa djup anestesi med toe-nypa, och observera andningsfrekvens.
- Klippa pälsen sedan immobilisera musen genom begränsningar 4-vägs. Förbereda huden med povidon-jod och drapera musen på ett sterilt sätt.
- Gör en 2 cm mittlinje vertikalt buksnitt och ange bukhålan. Dra tillbaka tarmen mycket fint och YTTRE detpå bröstet. Håll tarmen insvept i steril fuktig gasväv under hela förfarandet.
- Identifiera de stora buken fartyg och mobilisera dem, identifiera ländryggen grenar och antingen bränna eller ligera dem med 10/0 nylonsutur.
- Omedelbart distalt om den vänstra njurkärl retas den nedre hålvenen (IVC) och bukaortan (AA) från varandra genom trubbig dissektion över ungefär 2 mm. Ligera med 10/0 nylon och dela små arteriella och venösa grenar från njurkärl.
- Nu separera njurvenen från njurartären försiktigt genom trubbig dissektion av dessa strukturer. Detta gör det möjligt att exakt skapa ett Carrel plåster vid den proximala änden av den renala venen, som kommer att användas för att bilda en ände-mot-sida anastomos till mottagarna IVC.
- Identifiera, ligat och dela den vänstra binjuren fartyg. Detta ger tillgång till suprarenala aorta och en 6-0 silkessutur placeras runt aortan som förberedelse för ligering, men inte bundna vid denna tidpunkt. Mobilisera njuren, fartyg och urinledaren från den omgivande instrumentpanelen. Vrid njuren till höger och ligatet / dela några bakre grenar. Sedan tillbaka njuren till vänster.
- Rikta nu uppmärksamheten på urinledaren. Utan att störa njur hilum befria urinledaren från den omgivande facia noga med att bevara ureteric kärlen. Dividera urinledaren vid nivån av ductus deferens. Njuren är nu klar för att återhämta sig.
- Långsamt injicera 300 enheter heparin i den distala IVC därigenom heparinizing givaren. Surra 6-0 silkesutur placeras runt suprarenala AA och BEGJUTA den vänstra njuren genom den distala bukaortan med 0,8 ml av heparin saltlösning (100 U / ml).
- När perfusion har upphört skapa en venös Carrel plåster omedelbart att eliminera återflöde in i njuren. Dra tillbaka njurvenen mot njuren avslöjar AA och njurartären under.
- Dividera aorta intill njurartären skapar en häl och atte manschetten som visas i figur 1. Avlägsna njure, fartyg och uretär från donatorn.
- Ta njuren direkt till en i förväg förberedd mottagare (0 min kall ischemi tid) eller lagras vid 4 ° C i en lösning av val för en förutbestämd tid förrän vid implantation. Avlivas givarna av exsanguanation och halsdislokation. Total tid att återhämta donatornjuren är ca.. 15-20 min.
2. Njure Implantat Teknik
- Söva mottagaren mus med pentobarbital (60 mg / kg IP initial dos, 25 mg / kg IP extra dos om det behövs). Fastställa djup anestesi med toe-nypa, och observera andningsfrekvens. Clip pälsen immobilisera sedan musen genom begränsningar 4-vägs och tillämpa oftalmologiska salva för ögonen. Förbereda huden med povidon-jod och drapera musen på ett sterilt sätt.
- Gör en 2 cm mittlinje vertikalt buksnitt och ange bukhålan. Dra tillbaka tarmensuperiorly och YTTRE på bröstet. Håll tarmen insvept i steril fuktig gasväv under hela förfarandet.
- Vid denna tidpunkt utföra en rätt nefrektomi. Ligate njur artär och ven med 6-0 silkessuturer. Excidera njuren distalt suturerna. Ligate urinledaren med 6-0 silke och sedan dela proximal till njuren.
- Isolera den abdominala aortan och vena cava inferior (IVC) under njurkärlen. Placera 4-0 bomullsband runt aorta och IVC överlägsen sedan sämre till anastomos webbplatsen. Identifiera och ligera eventuella ländryggen fartyg inom området med 10-0 nylonsutur.
- Knyt bomullsband, först sämre följt av överlägsen. På detta sätt lite blod kvarhålls i aortan gör aortotomy enklare.
- Forma aortotomy med en 30G nål för att komma in i lumen i aorta. Utöka snittet med fina mikro sax till en längd av ca 2 mm.
- Gör ett slut på sida anastomos av donator aorta häl-och-tå manschettenmottagarens aorta i följande sätt. Placera en 10-0 nylonsutur vistelse stygn i givar aorta och sämre vinkel på snittet i mottagarens aorta och slips.
- Placera en andra 10-0 nylon motsatt den första i givar aorta och den överlägsna hörnet av snittet i bukaorta och slips. Gör en löpande sutur linje från överlägsen underlägsen i sidoväggen av aorta och slips mot tidigare placerade vistelsen stygn. Sedan sutur mediala väggen i en löpande mode och slips.
- Gör ett slut på sida anastomos hos donator njurvenen till mottagaren IVC i följande sätt. Punktera IVC med en 30G nål och förlänga snittet med fina mikro sax. Knyt givaren njurvenen till sämre hörnet av snittet i IVC med 10-0 nylon. Gör en löpande sutur linje mellan njurvenen och IVC och slips.
OBS: Det är också mycket viktigt att full tjocklek passerar av suturnålen inklusive vaskulära adventitIA och intiman uppnås. Eversion av kanterna säkerställer också att det finns intima till intima kontakt, som hjälper till att täta och läkning av anastomoser. Medan en BLODS koaguleringsmedel kan vara användbart för att minska läckage, rekommenderar vi att en kirurg lita istället på god teknik. - Se till att anastomoser är "ren". Det vill säga att de motstående väggar inte fångas när du placerar stygn. Detta kommer att leda till en betydande sammandragning att flöda som kommer att resultera i en misslyckad transplantat och i extrema fall till bakbensförlamning.
OBS: En annan avgörande faktor är att se till att spänningen i anastomotiska suturer linjerna är också optimalt. För löst och det blir oåterkallelig läcker, för hårt och striktur att flyta kommer att resultera. Om på artärsidan detta kommer att resultera i dålig perfusion av transplantatet, om på den venösa sidan en överbelastad njure kommer att resultera. - Släpp distala 4-0 bomull tie återupprätta venflöde. När hemostas av venooss anastomosis har observerats gradvis lossa proximala 4-0 bomull slips och observera arteriella anastomos för hemostas.
- Ta bort bomullsband från musen när båda anastomoser anses säker. Pierce blåsan med en 20 G nål skapar två hål.
- Passera spetsarna på böjda pincett genom hålen och dra donatorurinledaren genom blåsan med pincetten med den proximala änden av urinledaren förankras i blåsväggen med två 10-0 nylonsuturer. Klipp bort överflödigt längd urinledaren som skjuter ut från det andra hålet tillåter urinledaren att dra i urinblåsan och stänga hålet med två 10-0 nylonsuturer.
- Återgå tarmen till buken. Stäng bukväggen i två skikt med hjälp av 5-0 siden sutur i en löpande sätt.
- Administrera en 1,0 ml bolus av steril, varm normal saltlösning in i buken som vätsketillförsel vid stängning, och injicera 0,8 ml normal saltlösning subkutant postoperativt. Ingen annan supportive åtgärder krävs under operationen.
- Återställa djuret på en värmande filt. Total implantat Tiden är ca. 35-45 min. Administrera analgetika såsom buprenorfin, 0,05 mg / kg, SC, 0,1-0,2 ml vid början av förfarandet och varje 6-12 h under 72 h post-op.
3. Kontra Nefrektomi
- Beroende på protokollkrav, flera dagar efter implantationen, utföra en kontra nefrektomi enligt isoflurananestesi (5% inandning isofluran för induktion, 1,5-2,0% för underhåll).
- Ange bukhålan och försiktigt dra tarmen till djurets rätt. Exponera vänster njure och trubbigt dissekera från de omgivande fascia.
- Ligate njurartären, ven och urinledaren med 6-0 silkessuturer och sedan skära ut njurarna ovanför suturer och ta bort njuren. Total operativ Tiden är ca. 10 min.
4. Transplantat Bedömning
- Mät serum creatinio användning av alkaliska pikrat metoden (Jaffe reaktion).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna kirurgiska tekniken möjliggör antingen enkla transplantat överlevnad / avvisande studier, eller ganska komplicerade experimentella protokoll. I figurerna nedan vi demonstrera fördelarna med att använda denna förbättrade arteriell anastomos teknik. Med denna teknik har vi minskat signifikant incidensen av arteriell trombos från 35% till 0% vilket ökar produktiviteten. Vi har använt denna teknik för över ett år med samma 0% trombos resultat bibehålls. Figur 1 beskriver metoden för bildandet av arteriella häl och tå manschett som ligger till grund för denna nya teknik. Denna manschett ger en längre anastomos och en rakare blodflöde väg in i njuren. Båda dessa punkter resulterar i signifikant minskat turbulens och därigenom minska sannolikheten för blodplättaktivering och trombosbildning.
Figur 2. Immunohistokemisk analys. (A) perjodsyra Schiff färgade snitt av en kontroll icke-transplanted njure. (B) En syngena njurtransplantation på POD 8 med den reviderade tekniken visar normala proximala tubulära celler, som är kubiskt, med en tydlig cytoplasma och en rund ljus kärna i mitten av cellen. Det finns bevis för mild borstbräm skada (pilar) men majoriteten av borst gränser är regelbundna och väl bevarade. Förstoring: 400x.
Tabell 1. Jämförelse av trombos incidens och varma ischemi gånger mellan de två teknikerna. Alla värden uttrycks som medelvärde ± SD. För enskilda jämförelser, är normalfördelade uppgifter utvärderas med hjälp av oparade, två-tailed Student t test, och icke-normalfördelade data analyseras av nonparametric oparade Mann-Whitney U test. P-värden på mindre än 0,05 anses statist significant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Behärska denna transplantation teknik är svårt, men när åstadkommit det är ett mycket kraftfullt forskningsverktyg. Patienten kirurg / forskare kommer att belönas med uppmärksamhet på detaljer och konsekvens av teknik, vilket är nyckeln till att behärska alla kirurgiska ingrepp, i ännu högre grad i små djurmodeller. De tekniska svårigheterna att bemästra musen njurtransplantation är många veck, och det är mycket troligt att erfarenheter från andra små djur transplantationsmodeller måste vinnas innan itu med detta förfarande.
Det är viktigt att se till att anastomoser är "ren", det vill säga, de motstående kärlväggen får inte fångas när du placerar stygn för att upprätthålla ett patent lumen. Annars kommer det att finnas betydande sammandragning att flyta som kommer högst sannolikt resulterar i en misslyckad transplantat och i extrema fall leda till hind-lem förlamning. Det är också mycket viktigt att full tjocklek passerar av suturnålen inklusive vaskulära adventitia och intiman uppnås eftersom detta resulterar i korrekt evertion av kanterna säkerställer att det finns intima-to-intima kontakt som hjälpmedel i tätande och läkning av anastomoser. Medan en BLODS koaguleringsmedel kan vara användbart för att minska läckage, rekommenderar vi att en kirurg lita istället på god teknik.
Också uppmärksamhet måste ägnas åt att säkerställa spänningen i anastomotiska suturer linjerna är optimal, för löst och det blir oåterkallelig läcker, med snäva och reducerat flöde kommer att resultera. Om på artärsidan detta kommer att resultera i dålig perfusion av transplantatet, om på den venösa sidan en överbelastad njure kommer att resultera. Uppnå detta rätt spänning är en fråga om praxis och erfarenheter med andra små djur mikrovaskulära modeller kommer att vara till stor hjälp. Framförallt konsekvens av teknik och orubbliga uppmärksamhet på detaljer kommer att ge utmärkt mus och graft överlevnad och njurtransplantation funktion.
t "> Begränsningarna av denna teknik bara styrs av de användningsområden som kan tillämpas av undersökaren. Som med alla mikrovaskulära förfarande, så länge bra teknik observeras resultaten ska vara reproducerbara.Incidensen av arteriell trombos med denna teknik har minskat drastiskt. Detta resulterar i minst 1/3 av alla njurtransplantationer omvandlas från potentiella tekniska fel till användbara uppgifter, vilket resulterar i minskade kostnader och ökad produktivitet.
Som en helt vaskulariserad, ortotopisk transplantation modell de framtida tillämpningar kommer att omfatta avslag / toleransstudier, fenomenet fördröjd transplantatfunktion och utredningar mekanismerna för ischemi / reperfusionsskada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av 1R03DK096151.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | Roboz # | Fine Science Tools # | Arosurgical # |
| Straight micro-dissecting forcep #5 | RS-5015 | 11295-51 | |
| Curved micro-dissecting forcep #7 | RS-5047 | 11297-00 | |
| Curved serrated forcep | RS-5137 | 11052-10 | |
| Vannas micro-dissecting scissors, short | RS-5610 | 09.140.08 | |
| Micro-dissecting scissors, straight, sharp, long | 11.602.11 | ||
| Micro spring handle needle holder | 11.549.15 | ||
| Straight mosquito forcep | 91308-12 | ||
| Micro-dissecting scissors, straight, blunt | RS-5962 | 14078-10 | |
| Micro-dissecting scissors, curved, blunt | RS-5981 | 14079-10 | |
| Micro retractor | RS-6540 | ||
| Instrument tray, 10” x 6 ½” x ¾” | RT-1350S | ||
| Silk suture, 5/0, 22.5m spool | 18020-50 | ||
| Suture | |||
| 10/0 nylon | T4A10Q07 | ||
| 5/0 silk | E19A05N | ||
| Gloves | Drapes | ||
| Biogel from Medex Supply | Precept, #64-9012-9 | ||
| Syringes | Cotton applicators | ||
| B-D 1cc insulin, #329424 | Fisher-brand, #23-400-100 | ||
| Povidone-Iodine swabs | |||
| PDI, #B40600 | |||
| 4/0 Cotton ties | |||
| Domestic cotton autoclaved with instruments |
References
- Skoskiewicz, M., Chase, C., Winn, H. J., Russell, P. S. Kidney transplants between mice of graded immunogenetic diversity. Transplant Proc. 5 (1), 721-725 (1973).
- Kalina, S. L., Mottram, P. L. A microsurgical technique for renal transplantation in mice. Aust N Z J Surg. 63 (3), 213-216 (1993).
- Han, W. R., Murray-Segal, L. J., Mottram, P. L. Modified technique for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 19 (6), 272-274 (1999).
- Ge, F., Gong, W. Strategies for successfully establishing a kidney transplant in a mouse model. Exp Clin Transplant. 9 (5), 287-294 (2011).
- Martins, P. N. Learning curve, surgical results and operative complications for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 26 (8), 590-593 (2006).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Zhang, Z. Kidney Transplantation in Mice. Experimental Organ Transplantation. Chen, H., Qian, S. , Nova Science Publishers. 45-64 (2013).
- Zhang, L., Moskovitz, M., Piscatelli, S., Longaker, M. T., Siebert, J. W. Hemodynamic study of different angled end-to-side anastomoses. Microsurgery. 16 (2), 114-117 (1995).
- Liu, Q., Mirc, D., Fu, B. M. Mechanical mechanisms of thrombosis in intact bent microvessels of rat mesentery. J Biomech. 41 (12), 2726-2734 (2008).
- Chesnutt, J. K., Han, H. C. Tortuosity triggers platelet activation and thrombus formation in microvessels. J Biomech Eng. 133 (12), 121004 (2011).
- Han, H. C. Blood vessel buckling within soft surrounding tissue generates tortuosity. J Biomech. 42 (16), 2797-2801 (2009).
- Gutierrez-Diaz, J. A., et al. Intraluminal thrombus and neointimal hyperplasia after microvascular surgery. Surg Neurol. 24 (2), 153-159 (1985).
- Khouri, R. K., Cooley, B. C., Kenna, D. M., Edstrom, L. E. Thrombosis of microvascular anastomoses in traumatized vessels: fibrin versus platelets. Plast Reconstr Surg. 86 (1), 110-117 (1990).
- Johnson, P. C., et al. Initial platelet deposition at the human microvascular anastomosis: effect on downstream platelet deposition to intact and injured vessels. Plast Reconstr Surg. 90 (4), 650-658 (1992).
