Summary
고해상도 미분 간섭 대비 (DIC) 현미경을 사용하여, 마우스 뇌 심실 내에 위치 운동성 뇌실막 섬모의 고동의 생체 관찰은 실시간 이미징에 의해 입증된다. 이 기술은 고유의 섬모 박동 주파수의 기록 및 구타 각도뿐만 아니라 세포 내 칼슘 진동 페이싱 등록 할 수 있습니다.
Abstract
Multiciliated 뇌실막 세포는 성인의 뇌에 심실 라인. 이상 기능이나 뇌실막 섬모의 구조는 다양한 신경 학적 결손과 관련이있다. 운동성 섬모 뇌실막 기술의 생체 라이브 영상 전류는 여러 단계를 다음과 섬모의 역학에 대한 자세한 연구를 위해 수 있습니다. 이 단계는 다음과 같습니다 마우스 이산화탄소와 안락사를 톨레도의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 대학의 프로토콜에 따라; vibratome 또는 날카로운 블레이드와 뇌 제거 및 시상 뇌 해부 다음에 두개 절제술은 뇌실막 섬모가 가시화 될 수있는 뇌 측면 심실을 통해 매우 얇은 섹션을 얻었다. 95 % / 5 % O의 존재하에 2 / CO 2 혼합물을 37 ℃에서 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM) / 하이 글루코스를 함유하는 맞춤형 유리 - 바닥 접시 뇌 슬라이스 포란 살아있는 조직을 유지하는 것이 필수적이다 시실험. 섬모 고해 비디오이어서 고해상도 미분 간섭 현미경을 이용하여 기록된다. 비디오는 섬모 비팅 주파수를 계산하는 프레임 단위로 분석한다. 이것은 그들의 섬모 박동 주파수와 각도에 따라 세 종류 또는 유형에 뇌실막 세포의 뚜렷한 구분을 할 수 있습니다. 또한,이 기술은 뇌실막 세포 특유의 세포 내 칼슘 발진 특성뿐만 아니라, 칼슘 진동에 약리학 적 제제의 효과 및 모양체 비팅 주파수의 특성을 고속 형광 영상 분석의 사용을 허용한다. 또한,이 기술은 섬모 구조 및 섬모 단백질 지역화 연구 면역 촬상에 적합하다. 이는 질병 진단 및 표현형 연구에서 특히 중요하다. 뇌 조직이 죽는 시작으로 기술의 주요 제한은 라이브 운동성 섬모 운동의 감소에 기인한다.
Introduction
섬모 세포 외 환경으로 세포 표면으로부터 연장 감각 미세 소관 기반 소기관이다. "9 + 0"또는 "9 + 2"- 미세 소관들은 조직에 따라 섬모는 두 가지 유형으로 분류 될 수있다. 기능적으로, 그들의 운동에 기초하여, 이러한 운동성 또는 비 - 운동성 섬모 1로 분류 될 수있다. 차 섬모는 일반적으로 "9 + 0"비 운동성 섬모를 나타 내기 위해 사용되는 용어입니다. 이들은 ( '9'로 표시) 아홉 평행 겹 미세 소관 있고 미세 소관의 중앙 쌍 ( '0'로 표시) 내에서 중앙 피복 부재. 그러나, 배아 편측성 규제 등 절점 섬모 일부 "9 + 0"섬모는 2 운동성이다. 한편, 운동성 섬모는 미세 소관 이중선의 추가적인 중앙 쌍, 아홉 병렬 미세 소관 이중선에 더하여, 특징 및 운동성을 촉진하기 네인 모터 단백질과 연관된. 또한, 일부 "9이러한 후각 섬모 등이 "섬모 3 비 운동성이 있습니다. 뇌 심실 및 척수의 중심 관을 긋고 뇌실막 세포는 뇌 심실 4 따라 뇌척수액 (CSF)를 추진 운동성 섬모 특징으로한다.
이 방법의 전반적인 목표는 섬모 역학과 구조적 이상 운동성 연구를 촉진하는 것입니다. 뇌의 건강과 발전은 크게 뇌의 뇌실 내 뇌척수액의 효율적인 순환에 따라 달라집니다. 예를 들어, 정상 뇌척수액의 흐름과 유체 균형은 정상 박동 차례로 신경 세포의 방향 움직임을 조절하는 중요한 역할을하고 세포 이동 (7) 줄기 기능 뇌실막 섬모 5,6 필요합니다. 이러한 비정상적인 뇌실막 섬모 기능 또는 뇌수종과 연관된 비정상적인 CSF 흐름을 초래할 수 구조체로서, 용태가있는 (B)의 심실에서 CSF의 비정상 축적이 존재비. 이것은 결과적으로 두개 내 압력과 머리, 경련, 터널 비전의 점진적 확대, 정신 장애 (8) 증가의 원인이 될 수 있습니다.
기존의 방법에 비해이 기술의 장점은 세 가지 뇌실막 세포 유형을보고 처음 허용한다는 것이다 : I, 고유 모양체 비팅 주파수 및 각도 박동에 근거 II 및 III. 이 뇌실막 세포는 뇌의 뇌실에 특정 지역 내에서 지역화됩니다. 또한, 나이 등과 같은 알코올 및 뇌실막 세포 유형 또는 지역화 변경에 실로 스타 졸과 같은 약리학 적 제제의 효과는 뇌실막 세포의 분류 이전에는 불가능이었다 증명 될 수있다. 실로 스타 졸은 포스-3 저해제, AMP에 캠프 대사 효소이며 세포 내 칼슘도 9를 조절한다. 고속 형광 영상 분석을 이용하여 세포 내 고유의 이미징 및 정량을 허용뇌실막 세포의 칼슘 진동 특성. 예를 들면, 실로 스타 졸 및 알콜 모두 크게 차례로, 뇌실막 섬모 10 의해 뇌척수액 볼륨 여분의 변화로 이어질 수 뇌실막 모양체 비팅 주파수뿐만 아니라, 세포 내 칼슘의 진동 특성을 변경. 요약하면,이 기술은 다른 칼슘 발진 특성 뇌실막 세포의 세 가지 유형 중 첫번째 증거를 제공하는 핵심이다.
다음 섹션에서, 절차의 상세한 단계별 개요는 티슈 제조 및 취급에 세심한주의를 기울이고, 제공된다.
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Protocol
동물 사용에 대한 절차는 국립 보건원 (National Institutes of Health)과 관리 및 사용을위한 설명서에서 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 톨레도 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다 실험 동물의.
1. 뇌 추출, 단면 및 조직 준비
- 깊이 5 분 동안 CO 2 질식으로 안락사에 의해 야생형 마우스 스트레인 C57BL / 6 희생. 자궁 전위에 의해 죽음을 확신합니다.
- 70 % 에탄올로 마우스 헤드를 청소합니다.
- 제 두개골을 노출시키기 위해 머리 위쪽부터 떨어져 피부를 당겨 멸균 가위 집게를 사용하여 두개 절제술을 수행한다.
- 그런 다음, 두개골이 노출 될 때, 뼈 조각별로 조각을 벗겨 후방 측에서 시작하여 전방쪽으로 이동하여 두개골을 제거합니다. 뇌 심실을 파괴하지 않도록주의해야합니다.
- 전체 뇌를 수집합니다.
- 페니실린 10000 단위 / ㎖ 및 스트렙토 마이신 및 예열 10,000 ㎍ / ml를 함유 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 DMEM / 하이 글루코스 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 용액을 함유 100mm 배양 접시에서 뇌를 놓고 37 ° C까지.
- 날카로운 블레이드와 손으로 정중 시상면에 뇌를 슬라이스하고, vibratome를 사용하여 각 반에서 첫 번째 100-200mm 섹션을 구하십시오.
- 미리 예열 37 ° C, 인산 완충 식염수 (1X PBS) 용액으로 뇌 조직을 헹군다.
- 즉시 DMEM / 높은 포도당 미디어 37 ℃로 미리 예열 뇌 섹션을 배치합니다.
2. 라이브 영상 구성 및 설정
- DMEM / 높은 포도당 미디어 1 ㎖를 포함 30mm의 유리 바닥 배양 접시의 뇌 조직 섹션을 배치합니다. 95 % / 5 % O 2 / CO 함량이 37 ° C, (도 1의 현미경 밀폐 챔버 환경을 조정
- 60X 대물 오일 침지 렌즈를 사용하여, 제 60X 대물 렌즈의 기름 방울을 배치하고 정기적 DIC와 셀에 초점 뇌실막 세포 / 섬모 영상 수집은 광을 투과.
- 섬모 구타 영역에서 기포 운동 종류를 만들 때 다음, 뇌실막 운동성 섬모의 위치 기준으로 DMEM 거품 이동 방향을 따른다. DIC 필터를 사용하여 뇌의 뇌실의 운동성 섬모와 건강한 세포를 포함하는 영역을 선택합니다. 뇌실막 섬모가 발견되면, 빛을 조정하고 양호한 화상을 얻는 데 초점을 맞춘다.
- MetaMorph로부터 촬상 소프트웨어를 이용하여 특정 용도에 따라 라이브 영상 파라미터를 설정한다. 본 데모에서는 객관적인 60X 5 ~ 10 밀리 초 노출 시간과 함께 1 × 1 카메라 비닝 세트 이십사 비트 이미지를 획득.
- 최소 특급을 위해 최적 수준으로 현미경 조리개를 열어 DIC 이미지 수집osure 시간. 지체없이 신속하고 즉시 이미지 수집을 제공하기 위해 카메라에 라이브 영상 스트림을 관찰한다. 충분한 화상 콘트라스트를 획득하기 위해 최소 노출 시간의 요건에 기초하여 섬모 박동의 속도를 계산한다.
3. 데이터 시각화 및 분석
- 1 분에 구타의 수를 계산하여 섬모의 구타의 수를 계산합니다. 비디오의 속도를 감소시키고 셀 카운터 또는 유사한 공구를 사용하여 비트 수를 카운트하여 수행.
- 매질의 주파수를 계산하기 위해, 비디오 초의 수를 얻기 위해 획득 프레임 또는 시간 경과 화상의 수에 의해 기록되는 노광 시간을 곱한다. (예 : 노출 시간 5 밀리 초 200 프레임 = 1000 밀리 초 또는 1 초).
- 초 당 하나의 박동 수로 표현되는 주파수를 획득하기 위해 1 초 매질의 수를 계산한다. 1 초 시간 간 동안 섬모의 구타의 수를 분할하여이 작업을 수행발은 (예 : 섬모는 = 1 초 5 밀리 초, 즉 5 밀리 X 200 프레임의 노출 시간 기록 (200) 프레임 비디오에서 50 회 박동, 지금은 1 초 = 50 Hz에서 50 비트를 분할).
- 모두 전원 및 복구 스트로크하는 동안 뇌실막 섬모에 의해 촬영 경로를 평가하여 섬모 치는 각도를 계산합니다. 약간의 수정 (11)와, 이전에 기술 된 방법에 따라이 작업을 수행합니다. 각각의 섬모 운동의 정확한 완전한 비트주기 동안 관찰된다.
- 모니터 위에 배치 아세테이트 시트에서 뇌실막 가장자리와 동력 행정의 개시시 섬모의 중심선 위치를 통해 수직 라인을 따라 수평 라인을 그린다.
- 이 동력 행정 중에 전진으로 프레임에 의해 섬모 프레임의 정확한 위치를 플롯. 유사한 방식으로, 복구 행정 중에 섬모의 운동을 플롯.
- T시의 중간 선에서 섬모의 최대 편차에서 섬모 치는 각도를 계산동력 행정뿐만 아니라 복구 스트로크 그가.
4. 칼슘 신호 기록
- 뇌를 슬라이스 한 후, 간단히 1X PBS 또는 둘 베코의 PBS (PH 7.0)와 뇌 조각을 씻어. 형광 소광을 방지하고, 양호한 신호 대 잡음비를 구하는 신선한 FLUO-2를 준비한다.
- 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 FLUO-2 액 1 mM의 스톡 용액을 준비 혼합 FLUO-2를 균일 DMSO에 용해 될 수 있도록 적어도 5 분 동안 용액을 소용돌이.
- 2 % B27로 보충 된 DMEM / 하이 글루코스 500ml에 FLUO-2 원액 희석하여 20 ㎎ / ㎖의 최종 농도로 37 ° C로 미리 예열.
주 : B-27 비타민 A, 항산화 칵테일 및 해마 및 기타 CNS 신경 세포의 단기 또는 장기 생존 능력을 지원하기 위해 사용되는 인슐린을 포함하는 최적화 된 무 혈청 보충. - 즉시 유리 - 바닥 플레이트에 37 ° C에서 30 분 동안 20 ㎎ / ㎖ FLUO-2 뇌 슬라이스 배양한다.
- 칼슘 형광체 FLUO-2의 최적 로딩 농도를 결정하고, ATP와 칼슘 염료 세포 독성 공격 세포를 방지하고, ATP에 응답하여 시간 경과와 칼슘 신호의 피크 진폭을 측정함으로써 세포 생존을 확인.
- 488 nm의 515 nm의 각각 (영화 2)의 여기 및 방출 파장, 1 초 (초당 200 프레임)의 최소 5 밀리의 캡처 속도로 칼슘 진동에 대한 비디오를 기록합니다.
- 자가 형광 또는 이동 유물에서 FLUO-2 칼슘 신호를 구별하기 위해, 515 nm에서 방출 강도가 개별적으로 모니터링되어 있는지 확인합니다.
참고 : FLUO-2는 세포 내 칼슘을 정량화하기에 적합한 칼슘 fluoremetric 없습니다. 그러나, 칼슘 진동 빨리 칼슘 변화를 감지하는 우수한 동적 칼슘 염료이다. 보다 정확한 칼슘 정량,의 Fura-2를 권장합니다. 그러나의 Fura-2의 동적 변경은 그 비율 적으로 한정염료의 특성. - 정확한 무료 세포 내 칼슘의 값을 계산하기 위해 제조업체에서 제공하는 공식을 따릅니다. 예 [칼슘 2 +] = K의 D × (R - R 분) / (R 최대 - R). K (D)가 해제 칼슘으로부터 염료의 해리 상수이고, R은 488에서 측정 된 형광이고, R과 R 분의 최대 최소 및 최대 이온 농도 12에서 형광 비율이다.
5. 면역 형광 현미경
- 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA), 10 분 동안 2 % 수 크로즈를 함유하는 인산염 완충 식염수와 뇌 부분을 수정. 또한, 저온 유지 장치를 사용하여 50mm의 섹션으로 4 % PFA 다음과 섹션 전체 뇌를 해결.
- 5 분마다 시간을 1X PBS로 조직을 세 번 씻으십시오.
- soluti와 뇌 조각을 품어5 분 1X PBS에서 0.1 % 트리톤-X의에, 다음 5 분 때마다 1X PBS로 3 회 씻어.
- 밤새 4 ℃에서, 실온 (RT) 또는에서 1 시간 동안 1X PBS에 10 % FBS에서 5000 : 마우스 일차 항체로 뇌 슬라이스 부화 1의 희석에 사용 - 튜 불린을 antiacetylated.
- 5 분마다 시간을 1X PBS로 조직을 세 번 씻으십시오.
- 이차 항체의 뇌 슬라이스 부화 1의 희석 레세 항 - 마우스 IgG : RT에서 1 시간 동안 1X PBS 용액 500 10 %의 FBS.
- 5 분 핵 (또는 DNA) 13 얼룩 4 ', 6 diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI)와 섹션 Counterstain과 형광 현미경으로 관찰하기 전에. 가능한 최소 노출 시간 구간 바로 광표백 화상을 최소화.
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Representative Results
라이브 마우스의 뇌에 뇌실막 섬모 기능을 측정
이 프로토콜에 기재된 방법은 마우스 뇌뿐만 아니라 모니터링 섬모 비팅 주파수 공부 해부 신선한 조직 뇌실막 섬모 기능과 구조를 모니터링하는 데 사용된다. 전체 실험을 수행하기 위해 그 다음 단계는 개략 플로우 차트 (도 1)에 도시된다. 이것은 고도로 실험 가능한 활성 운동성 섬모를 유지하기 위해 짧은 시간 내에 수행하는 것이 좋다. 대표 시간 경과 영화와 뇌실막 세포와 그들의 운동성 섬모의 이미지도 표시됩니다 (동영상 1 와 그림 2a). 얻어진 스트림 데이터 분석 이동 섬모의 박동 패턴과 각도를 계산함으로써 달성된다. 세 가지 유형으로 섬모를 나누는 기준은 뇌실막 섬모의 존재는 눌러 확인은 표 1에 나타내었다핵 보여 섬모 마커, 아세틸 - - 튜 불린과 rmed하고, 뇌실막 세포 DAPI (DNA 마커)으로 대조된다 (그림 2B). 적어도 22 독립 실험으로부터 뇌의 뇌실 뇌실막 세포의 관찰 사항을 바탕으로, 우리는 섬모 비팅 주파수에 기초한 세 가지 유형으로 뇌실막 세포를 분류 할 수 있었다. 또한, 우리는 0.25 %의 농도의 에탄올이 크게 자신의 형 (그림 3)에 관계없이 섬모 박동 주파수를 억압 있음을 보여 주었다. 더 중요한 것은, 이러한 데이터는 우리의 이전 연구 결과 10 일관성에 있습니다.
뇌실막 섬모에 의한 측정 칼슘 신호
그것은 이전 섬모 굽힘 14-16 시그널링 섬모 의존적 세포 내 칼슘을 트리거 할 수 있음을 보여왔다. 이 기술은 연구자들이 검토하고 뇌 심실 내의 세포 내 칼슘 신호를 측정 할 수 있도록
그림 1. 뇌실막 섬모 촬상 프로토콜 흐름도 뇌실막 섬모 촬상 프로토콜 실험, 마우스 brainextraction부터 절편 및 이미지 획득 및 분석 조직 준비를 완료하는 단계를 도시한다. 대략 한 시간 타임 라인은 단계별 절차와 함께 제공됩니다.
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그림 2 :. 뇌 심실에서 뇌실막 섬모 현지화 여기에 표시됨 마우스 뇌의 뇌실에서 뇌실막 세포이다. () 개인 뇌실막 세포 (아래 화살표)과 섬모 (위 화살표)의 DIC 이미지가 표시됩니다. (b) 뇌 부의 오버레이 화상 모양체 마커 대한 항체로 염색하고, 녹색 (위쪽 화살표)에 나타내는 바와 - 튜 불린을, 아세틸, 청색 (아래쪽 화살표)에 나타내는 핵 / DNA 마커, DAPI로 대조 . 패널 A와 B가 서로 다른 뇌의 부분을 나타내는 있습니다.
그림 3 :. 알코올 및 마우스 뇌의 뇌실의 뇌실막 세포의 타입과 주파수를 치고 섬모의 차이 생체 뇌 슬라이스는 E ((제어)없이 또는 함께 배양 하였다thanol) 5 분 동안 0.25 %의 알코올. 별표로 표시된 바와 같이 대조군에 비해, 알코올 처리는 크게, 섬모 비팅 주파수를 감소시켰다. 적어도 5-10 제제는 각각 독립적 뇌실막 세포 유형 및 처리 군에 사용 하였다.
영화 1 : III 형 뇌실막 세포에서 뇌실막 섬모의 기록 여기에 표시된 뇌의 제 3 뇌실에서 III 뇌실막 세포를 입력 주파수와 고유의 각도를 치고 특징 뇌실막 섬모의 녹음이다.. 이 그림은 이전에 (10)를보고되었으며 허가를 재사용했다.
영화 2 : 뇌실막 세포에서 세포 내 칼슘 진동 여기에 표시된 뇌의 측면 호흡기 섹션을 통해 뇌실막 세포의 칼슘 진동의 기록이다.37 ° C에서 30 분 동안, 20 ㎎ / ㎖ 칼슘 인디케이터 FLUO-2 뇌 슬라이스 배양 후 tricle. 뇌 부분의 칼슘 수준은 공부하고 의사는 색. 컬러 바는 뇌실막 세포의 칼슘 수준을 나타냅니다; 여기서 검은 보라색과 빨강 노랑은 각각 낮은 및 높은 칼슘 농도를 나타냅니다. 프로토콜 텍스트에 언급 된 제어 및 치료 그룹 사이의 평균으로 세포 내 칼슘 정량, 뇌실막 세포 칼슘, 여러 개별 뇌실막 세포에서 계산됩니다. 칼슘 진동의 비디오는 각각 488 nm의 515 나노 미터의 여기 및 방출 파장 초당 200 프레임을 기록하였습니다. 이 그림은 이전에 (10)를보고되었으며 허가를 재사용했다.
| 뇌실막 세포 유형 | 섬모 박동 주파수 | 섬모 박동 각도 |
| 유형 I | > 60 Hz에서 | <90 ° |
| 유형 II | 30 ~ 60 Hz에서 | 90-135 ° |
| 유형 III | <30 Hz에서 | > 135 ° |
표 1. 뇌실막 섬모의 종류 I 형으로 뇌실막 섬모의 분류는, II 또는 III는 주로 박동 주파수와 뇌의 제 3 뇌실의 특정 영역에 위치한 뇌실막 속눈썹의 각도를 때리고 기반으로했다. 이 데이터의 일부는 이전에보고 된 허가 여기 재사용되었다.
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Discussion
실시간 이미징과 뇌 심실 내에 뇌실막 섬모의 신속하고 민감하게 관찰을 제공 형광 현미경 모두 마우스 뇌 조직의 준비를위한 프로토콜은 여기에 설명한다. 이 기술은 뇌실에 한정되지 않는다; 그것은 다른 뇌 심실에서 섬모를 관찰하는 데에 이용 될 수있다. 이 영상 기술은 생체 외 환경에서 섬모의 박동에 의해 뇌척수액의 움직임과 유사한 라이브 스트림을 제공한다. 또한, 섬모의 운동 방향의 분석을 가능하게한다. 이것은 주로 고해상도 DIC와 형광 이미징 시스템의 사용에 의해 용이하게된다. 이 시스템의 장점은, 현미경이 온도, 습도 및 CO 2 수준의 미세 조절을 허용 환경 챔버로 묶여 있다는 점이다. 이것은 라이브 영상 EXPER을 수행 할 때 조직과 세포의 생존을 위해 고려되어야 매우 중요한 파라미터는iments. 시스템은 또한 섬모 운동 동적 세포 행동의 영상을 용이하게하는 중요한 특징이다 모두 자동 XY 및 Z 모듈뿐만 아니라, 디지털 카메라 및 파장 필터 스위처 장착된다. 현미경은 컴퓨터에 연결되어 있고 높은 품질의 이미지의 취득을 이미징 소프트웨어에 의해 용이하게된다.
뚜렷한 유형으로 뇌실막 세포를 분류하기 위해이 기술을 사용하면 뇌실막 섬모를 연구하는 데 사용되는 기존의 / 이전의 방법에 비해 상당한 진보를 제공한다. 예를 들어, 알콜과 같은 특정 약물 또는 제제의 독성 효과가 최소화되거나 그렇지 뇌실막 세포 하나 인구 (17)로 간주되는 경우 무효화 될 수있다. 그것은 주파수와 각도를 치고 섬모의 특성이 뇌실막 섬모의 이러한 세 가지 유형 중 아주 다르다는 사실에도 불구하고, 우리가이 세포의 생리를 이해하기 시작했다 염두에 유지하는 것이 중요합니다. 따라서이 프로토콜에 설명 된 절차가 적절하게 수행되는 경우, 우리의 이전 연구에 의하면, 우리의 분류는 충분히 견고하다.
별개 뇌실막 섬모를 식별하는 것은 뇌실막 생리 기본적인 이해를 얻기 위해 근본적 중요하다. 이 방법은 세 가지 종류 (표 1)로 분류에 이르는 고유 구체적 비팅 주파수 및 각도에 관해서 제 3 뇌실 내에 위치 뇌실막 세포의 세 가지 유형을 구별하는 것이 가능하게된다. 주파수를 상회 섬모의 차이 뇌실막 세포 또는 동물의 연령의 차이에 생존의 차이에 기인하지 않은 것을 확인하기 위해서, 권장 신경 조직 및 부착 만 그대로하고 undetached 뇌실막 스트립 또는 슬라이스 두께가 최소 100mm가 사용됩니다. 또한, 섬모 박동 주파수는 각 뇌실막 섹션에 따라 다른 위치에서 측정되어야한다. 우리는 이전에이 기술을 사용하여 생성 모양체 비트 주파수 데이터 (87)의 관찰 실험 10 중에서 일관 재현되었음을 보여 주었다. 따라서, 뇌실막 세포는 정확하게 자신의 섬모 박동에 따라 분류된다. 섬모 박동 주파수를 감소하는 것으로 알려져있다 약리 에이전트를 사용하는 경우 또한, 섬모의 박동 주파수는 이론적으로 그 약리 에이전트의 제거 다음 정상 박동 주파수로 반환해야합니다.
이 프로토콜의 핵심 단계는 뇌 조직 및 실험을 완료하는데 필요한 처리 시간에 주로 관련된다. 그것은 뇌실막 섬모의 구조와 기능을 보존뿐만 아니라 약해 조직 외상을 감소시키기 위해 부드럽게 뇌 조직을 처리하기 위해 필수적이다. 더욱 중요한 것은,이 기술의 성공을위한 제한 인자가 될 수 뇌 조직의 열화와 사망을 방지하기 위해서는 고도로 recommende이고이 기술에 관련된 단계를 가능한 한 시간 가까이에서 수행되는 D. 그러나,이 제한은 시험관 내에서 또는 다른 영양 용지의 사용과 운동성 섬모 함께 배양하고 성장 또는 유사한 뇌실막 세포 유형에서의 진보와 함께 미래에 극복 될 수있다. 이러한 ACSF 및 뇌 슬라이스 배양 용 얼의 염과 같은 대안 영양 매체의 사용은 문헌 5에 입증되었다. 그러나, 우리의 손, DMEM / 하이 글루코스의 사용으로 인해 잠재적 인 에너지 원으로서 배지에서 포도당의 높은 양 (4500 ㎎ / ㎖)의 존재 가능성 ACSF보다 유익. 이 생균의 대표적인 기호 그대로 따라서, 주 기준은 조직 따라서 접근법의 타당성을 평가한다 섬모 박동의 생존력을 평가하기 위해 사용된다.
뇌실막 섬모의 라이브 영상은 섬모 활성화의 다운 스트림 신호 전달 경로를 분석 할 수있는 강력한 도구를 제공합니다칼슘 시그널링 및 진동 등. 예를 들어, 실시간 형광 이미징을 이용하면, 그 관계없이 뇌실막 세포 / 섬모 타입의 증명되었다, 뇌실막 세포 고유 칼슘 발진 특성 (10)에 의해 특징 지어진다. 모두 모두,이 프로토콜은 기초 과학 지식과 임상 모두 관련이있다. 기초 과학의 관점에서,이 기술은 뇌실막 섬모의 구조, 기능 및 기계적 하류 신호 전달 경로의 기능 및 생리 학적 역할의 평가를 제공한다. 임상 관점에서,이 방법은 뇌수종과 알코올 남용 등의 신경 질환에 대한 새로운 치료 대상으로 뇌실막 섬모를 대상으로 약물에 대한 검색에 매우 관련이있다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/HIGH GLUCOSE | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-SP | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-2395 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Fluo-2 | TEF Labs | #0200 | |
| DMSO | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1500 | |
| Anti-acetylated a-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T7451 | clone 6-11B1 |
| FITC Anti-mouse antibody | Vector Labs | FI-2000 | |
| Cell Culture plate | VWR Vista Vision | 30-2041 | |
| Cover Slip (18 x 18) | VWR Vista Vision | 16004.326 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | Leica VT1200S | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM1860 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | Nikon TE2000 | 60X oil |
| Microscope cover glass 24 x 60 mm2 | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| DAPI filter cube | Chroma Technology |
References
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