Summary
使用高分辨率微分干涉对比（DIC）显微镜， 离体观察位于小鼠脑室内游动室管膜纤毛的跳动的证明通过实时成像。该技术允许独特纤毛跳动频率的记录和跳动角度以及它们的细胞内钙振荡起搏属性。
Abstract
Multiciliated室管膜细胞排列在成人大脑脑室。功能异常或室管膜纤毛的结构与各种神经功能障碍有关。目前能动纤毛室管膜技术的体外实时成像允许纤毛动态以下几个步骤进行详细的研究。这些步骤包括：小鼠安乐死二氧化碳根据托莱多的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的大学协议;骨瓣其次为脑拆除和矢状脑解剖与vibratome或锋利的刀片通过大脑侧脑室，其中室管膜纤毛可以可视化，以获得非常薄的部分。大脑的切片在含有Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基（DMEM）/高葡萄糖，在37℃在95％/ 5％氧气的存在下2 / CO 2混合物定制玻璃底板孵育必须保持所述组织活中实验。纤毛跳动的视频然后，使用高分辨率微分干涉显微镜记录。则视频被分析帧由帧来计算纤毛跳动频率。这允许基于其纤毛跳动频率和角度的室管膜细胞为三类或类型的不同分类。此外，这种技术允许使用高速荧光成像分析以表征室管膜细胞的独特细胞内钙振荡特性以及药理学试剂的钙振荡的效果和睫状跳动频率。此外，该技术适用于免疫荧光成像纤毛结构和纤毛蛋白定位研究。这是在疾病的诊断和表型的研究尤为重要。该技术的主要局限性是由于在活动纤毛运动的减少作为脑组织开始死亡。
Introduction
纤毛是感官微管系的细胞器，从细胞表面延伸到细胞外环境。取决于它们的微管组织，纤毛可分为两种类型 - “9 + 0”或“9 + 2”。在功能上，根据他们的运动，这些可被归类为运动型或非运动纤毛1。原发性纤毛是一种常用来表示“9 + 0”不动纤毛的术语。这些有九并行双峰微管（记为'9'）和一个中心对微管是中央鞘（表示为'0'）内不存在。然而，一些“9 + 0”的纤毛，如节点纤毛，从而调节胚胎偏侧是能动2。另一方面，运动纤毛的特征在于，除了九个并行微管双峰，通过附加中央对微管双峰，并与动力蛋白马达蛋白相关联，以促进蠕动。另外，一些“9+2“纤毛等纤毛的嗅觉都是非能动3。室管膜细胞衬脑室和脊髓的中央管的特征在于运动纤毛该推动脑脊液（CSF）沿脑室4。
该方法的总的目标是促进学习运动纤毛动力学和结构异常。大脑的健康和发展严重依赖于脑脊液的脑室中的高效流通。例如，正常脑脊液流量和流体平衡需要正常跳动和功能室管膜纤毛5,6，进而在调节神经元细胞的定向运动发挥关键作用和干细胞迁移7。因此，异常的室管膜纤毛功能或结构可能会导致异常脑脊液流动，这与脑积水，医疗条件，其中有脑脊液中的b的心室的异常积累雨。这可能进而使得颅内压增高和头部，抽搐，隧道视野的逐步扩大，以及精神残疾8。
该技术优于现有方法的优点是，它允许首次报道三个不同的室管膜细胞类型：I，II和III，基于其独特睫状打浆次数跳动角度。这些室管膜细胞在脑室某些区域内本地化。此外，年龄和药理学试剂如酒精和西洛他唑在改变室管膜细胞类型或它们的本地化的影响可以证明，这是不可能的这种分类室管膜细胞之前。西洛他唑是磷酸二酯酶3抑制剂，即代谢的cAMP为AMP的酶，它也调节细胞内钙9。采用高速荧光成像分析，可以成像的独特细胞内和细胞量化室管膜细胞的钙振荡特性。例如，酒精和西洛他唑显著改变室管膜纤毛跳动频率以及细胞内钙振荡性能，这反过来可能导致由室管膜纤毛10在脑脊液体积置换的变化。总之，该技术是关键，以提供三种不同类型的室管膜细胞具有不同钙振荡特性的第一个证据。
在下面的章节中，程序的详细一步一步的概述提供，密切关注组织准备和处理到。
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Protocol
该程序使用的动物均按照该机构动物护理和使用委员会的指导方针，在卫生部和国家研究院的指南护理和使用经托莱多大学的机构动物护理和使用委员会（IACUC）实验动物。
1.脑提取，切片和组织准备
- 通过用CO 2窒息深深安乐死5分钟牺牲野生型小鼠品系C57BL / 6。颈椎脱位保证死亡。
- 清洁鼠标头，用70％的乙醇。
- 由第一牵引皮肤脱落，开始与头部的顶部，以暴露颅骨执行使用无菌剪刀和镊子骨瓣。
- 然后，当颅骨露出，通过剥离骨片逐片，从后侧开始并朝着前侧移除头骨。要小心，不要破坏脑室。
- 收集整个大脑。
- 将脑在含有DMEM /高葡萄糖补充有10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素/链霉素溶液含有青霉素10000单位/毫升，链霉素和预热10,000微克/毫升100毫米的培养皿至37℃。
- 切片上的正中矢状面的脑用手用锋利的刀片，并获得使用振动的每个半第一100-200毫米截面。
- 冲洗脑组织与预热37℃的磷酸盐缓冲盐水（1×PBS）中的溶液。
- 立即将在DMEM /高葡萄糖培养基预温热至37℃的脑切片。
2.实时成像配置和设置
- 将脑组织切片中含有1ml的DMEM /高葡萄糖培养基的30mm的玻璃底培养皿。调整显微镜的封闭室的环境中37℃，95％/ 5％的O 2 / CO 2的含量（ 图1
- 使用60X物镜油浸镜头，首先将在60X物镜的油滴，并专注于细胞定期DIC收集室管膜细胞/纤毛的图像传输的光。
- 然后，按照DMEM气泡运动作为对能动的纤毛室管膜的位置的引导方向为纤毛殴打建立在该地区的一种气泡的运动。选择含有健康的细胞，在使用DIC过滤大脑的侧脑室动纤毛的区域。一旦室管膜纤毛被发现，调节光线和聚焦，以获得令人满意的图像。
- 根据使用的Metamorph成像软件的特定目的设定实时成像参数。在本演示中，获得24位图像用相机分级设置为1×1结合60X客观和5-10毫秒的曝光时间。
- 通过以具有最小EXP打开显微镜孔径到最佳水平收集的DIC图像osure时间。观察实时图像流的摄像头，提供快速，即时的图像采集刻不容缓。计算纤毛跳动基于最小曝光时间的要求，以获得足够的图像对比度的速度。
3.数据可视化和分析
- 通过计数1分钟殴打的数量计算纤毛殴打的数量。通过减小视频的速度和计数使用细胞计数器或类似工具的节拍数要这样做。
- 为了计算殴打的频率，乘以在该视频记录被获取以获得秒的数目的帧或时间推移的图像的数量的曝光时间。 （实施例：曝光时间5毫秒200帧= 1000毫秒或1秒）。
- 计算在一秒钟的殴打的数量，以获得被表示为每秒跳动的次数的频率。通过将纤毛殴打的人数超过一秒钟的时间跨做到这一点VAL（例：纤毛跳动50次的200帧视频录制，在5毫秒即 5毫秒×200帧= 1秒的曝光时间，现在分50次1秒= 50赫兹）。
- 通过在电源和恢复招评价都采取了室管膜纤毛的路径计算纤毛跳动角度。根据先前描述的方法执行此，具有小的修改11。个别纤毛的精确运动在完整周期节拍观察。
- 关于乙酸酯片材放置在显示器上，绘制一条水平线沿室管膜边缘并通过纤毛在做功冲程开始时的中线位置的垂直线。
- 由帧绘制纤毛帧的精确位置，因为它向前移动时在做功冲程期间。以类似的方式，绘制恢复行程中纤毛的运动。
- 从T期间中线计算从纤毛的最大偏差睫状打浆角他动力冲程以及恢复行程。
4.钙信号记录
- 切片大脑后，短暂地冲洗的脑切片用1×PBS或Dulbecco氏PBS（pH7.0）中。制备新鲜的Fluo-2，以避免荧光猝灭，并获得良好的信噪比。
- 制备的Fluo-2溶液在二甲基亚砜（DMSO）的1mM储备溶液，混合并旋涡振荡溶液至少5分钟，以确保将Fluo-2被均匀溶解在DMSO中。
- 稀释的Fluo-2原液在500毫升的DMEM /高葡萄糖的补充有2％B27的预加热到37℃至20毫克/毫升的最终浓度。
注：B-27是一种含有维生素A，抗氧化剂鸡尾酒，用于支持海马及其他CNS神经元的短期或长期生存能力胰岛素优化的无血清补充。 - 立即孵育大脑切片用20毫克/毫升的Fluo-2进行30分钟，在37℃，在玻璃底板。
- 为了确定钙荧光团的Fluo-2的最佳负载浓度并避免钙染料细胞毒性，与ATP挑战细胞，并通过确定响应于ATP的时间过程和钙信号的峰值幅度检查细胞存活力。
- 记录为钙振荡视频以5毫秒的最小1秒（每秒200帧）的捕获率，用488纳米和515纳米，分别（ 电影2）的激发和发射波长。
- 要区分自体荧光或运动伪影的荧光 - 2钙信号，保证在515纳米发射的强度进行独立监控。
注：将Fluo-2不适合于量化细胞内钙的钙荧光光度法。然而，这是一个极好的动态钙染料检测钙的快速变化，如钙振荡。为了更准确的定量的钙，呋喃-2建议。然而，的Fura-2的动态变化是由它的比例限定染料的性质。 - 遵循由生产商提供的公式来计算的确切细胞内游离钙的值。例如钙离子浓度= K 深 ×（R - R最小值）/（R 最大 - R）。其中，K d为从释放钙染料的解离常数，R为所测量的荧光在488和R 最小和R 最大值是在最小和最大离子浓度12的荧光比率。
5.免疫荧光显微
- 固定的脑切片用含有4％多聚甲醛（PFA）和2％的蔗糖，10分钟的磷酸盐缓冲盐水溶液。可替代地，固定的全脑，用4％PFA再部成使用低温恒温器50毫米部分。
- 用1×PBS，每次5分钟，洗净组织三次。
- 孵育大脑切片用soluti上0.1％的Triton-X在1×PBS中5分钟，再漂洗三次用1×PBS，每次5分钟。
- 孵育脑切片与小鼠抗，antiacetylated一个微管蛋白，用在稀释1：5000，在10％FBS的1×PBS在室温（RT）或过夜，在4℃一小时。
- 用1×PBS，每次5分钟，洗净组织三次。
- 孵育在二级抗体的脑切片，荧光素的抗小鼠IgG的稀释度1：在1小时在室温下的1×PBS溶液500在10％FBS。
- 在荧光显微镜下观察，染液的部分用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）中5分钟，进行染色的核（或DNA）13之前。以最小的曝光时间可能立即章节尽量减少漂白，形象。
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Representative Results
在活老鼠大脑室管膜下的测量功能纤毛
在这个协议中所描述的方法被用于监控在新鲜组织从小鼠脑以及监测和研究纤毛跳动频率解剖室管膜纤毛功能和结构。接着完成一个完整的实验步骤描述于一个概要流程图（图1）。强烈建议在实验很短的时间内，以保持运动纤毛尽可能积极进行。代表时间推移电影和室管膜细胞和它们的运动纤毛的图像也显示（电影1 和图2a）。得到的数据流中的数据分析，通过计算纤毛运动的跳动和角度的模式来完成。的标准，用于将纤毛分为三种类型示于表1室管膜纤毛的存在是CONFIRmed指带有纤毛的盯防，乙酰化微管蛋白，和室管膜细胞counterstained用DAPI（DNA标记），以显示细胞核（图2b）。根据我们的室管膜细胞中从至少22个独立实验的脑侧脑室的观察，我们能够以室管膜细胞分为基于其纤毛跳动频率三种类型。此外，我们证明了乙醇在0.25％浓度显著抑制它们的类型（ 图3）的纤毛跳动频率无关。更重要的是，这些数据是相一致与我们以前的研究结果10。
通过纤毛室管膜测钙信号
先前已经表明，纤毛的弯曲可触发纤毛依赖性胞内钙信号14-16。这项技术使研究人员能够检查和测量脑室中的细胞内钙离子信号
图1：室管膜纤毛成像协议流程图室管膜纤毛成像协议示出的步骤来完成从小鼠brainextraction开始，切片和组织制备到图像采集和分析的实验。一个近似1小时时间表呈现一步一步的过程。
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图2：在脑室室管膜纤毛本地化这里显示的是从小鼠脑的侧脑室室管膜细胞。 （a）中所示的单个室管膜细胞（底部箭头）和纤毛（顶端箭头）的DIC图像。 （b）在脑切片的叠加图像被用针对一个纤毛标记抗体，乙酰化微管蛋白，在绿色（顶端箭头）所示，并counterstained具有核/ DNA标记，DAPI，蓝色（底部箭头）所示。请注意，图a和b表示不同的脑切片。
图3：酒精和纤毛类型间的小鼠大脑侧脑室室管膜细胞的跳动频率差的 离体脑切片孵育无（对照）或用（Ethanol）0.25％乙醇5分钟。与对照组相比，酒精治疗显著下降纤毛跳动频率，用星号表示。至少5-10独立制备物用于每个室管膜细胞类型和治疗组。
电影 1：室管膜纤毛在III型室管膜细胞录制这里展示的是录音室管膜纤毛，特征在于跳动频率和角度独特从大脑的第三脑室Ⅲ型室管膜细胞。这一数字曾报道10，经许可被重用。
电影 2：在室管膜细胞内钙振荡这里展示的是室管膜细胞的钙振荡的记录通过大脑的横向VEN的截面。在37℃下温育该脑切片用20毫克/毫升钙指示剂，荧光 - 2，30分钟后tricle。大脑部分的钙水平进行了研究和伪色。彩条表示室管膜细胞的钙水平;其中，黑紫色和红色，黄色代表低和高的钙含量，分别为。细胞内钙的量化，室管膜细胞钙将从几个单独室管膜细胞计算，如上述在协议文本和对照组和治疗组之间平均。钙振荡的视频被记录在每秒200帧，分别488 nm和515nm处，激发和发射波长。这一数字曾报道10，经许可被重用。
| 室管膜细胞类型 | 纤毛跳动频率 | 纤毛跳动角 |
| I型 | > 60赫兹 | <90° |
| II型 | 30-60赫兹 | 90-135° |
| III型 | <30赫兹 | > 135° |
表1：室管膜纤毛的类型室管膜纤毛的分类为I型，II或III的主要依据是跳动的频率和殴打位于大脑第三脑室不同的区域内室管膜纤毛的角度。这部分数据已被报告并在这里进行许可复用。
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Discussion
这里描述的是协议用于制备鼠脑组织为活的成像和荧光显微镜，提供了脑室内的快速，灵敏密切观察室管膜纤毛。这种技术不限于仅侧脑室;它可以被用来观察在其他脑室的纤毛。这种成像技术提供的实时流类似于在离体环境的脑脊液由纤毛跳动的运动。此外，它使纤毛的定向运动的分析。这主要是促进通过使用高分辨率DIC和荧光成像系统。这个系统的一个优点是，在显微镜被封闭在一个环境室，其允许的温度，湿度和CO 2水平细调节。这些是进行实时成像EXPER时，应考虑对细胞和组织的存活非常重要的参数iments。该系统还配备了自动的XY和Z模块以及数字照相机和波长滤波器切换器，所有这些都是重要的特征，以方便动态的细胞行为，如纤毛运动的成像。该显微镜连接到计算机和收购高品质的图像是通过图像处理软件提供便利。
使用这种技术，以室管膜细胞分为不同的类型提供超过用于研究管膜纤毛现有/以前的方法一显著进步。例如，某些药理学或毒性剂如醇的效果，可以以其他方式最小化或废止，如果室管膜细胞被认为是一个群体17。它保持在那，尽管事实上，纤毛跳动频率和角度的特性是这三种类型的室管膜纤毛之间非常不同，我们刚开始了解这些细胞的生理头脑是重要的。故根据我们以前的工作，我们的分类是足够健壮如果如在这个协议中描述的方法进行正常。
识别不同的室管膜纤毛是从根本上重要的是获得生理室管膜的一个基本的了解。这种方法使得有可能三种不同类型的室管膜细胞独特和特异性定位在关于跳动频率和角度第三脑室内的区分，导致了分类成三种不同类型的（ 表1）。为了确认，在纤毛跳动频率的差异并不是由于在室管膜细胞，或在动物的年龄差异生存能力的差异，建议所连接到神经元组织，并在该只有完整和未分离的室管膜条带或片至少100毫米厚的使用。此外，睫状跳动频率应在沿各管膜部不同的位置来测量。之前我们已经证实，采用这种技术产生的纤毛摆动频率数据已经跻身87实验结果一致10重现性。因此，室管膜细胞准确分类取决于它们的纤毛跳动。此外，使用已知能减少睫状体跳动频率药剂时，纤毛跳动频率理论上应该继去除那些药剂的恢复正常跳动频率。
在这个协议中的一个关键步骤是主要涉及处理脑组织和完成实验所需的时间。当务之急是轻轻处理脑组织，以保持室管膜纤毛的结构和功能以及减少外伤的脆弱组织。更重要的是，和避免的脑组织，这可能是对于该技术的成功的一个限制因素恶化而死亡，这是非常recommende即在尽可能接近进行一小时尽可能与该技术有关的步骤d。然而，这种限制可以克服在未来与体外或使用替代营养介质运动纤毛中培养和生长室管膜或类似的细胞类型的进步。使用替代营养介质，如脑脊液和厄尔氏盐的脑切片的培养已被证明在文献5。然而，在我们手中，使用DMEM /高葡萄糖比脑脊液可能更有利是由于高含量的葡萄糖的（4500毫克/毫升）在培养基中的存在作为一个潜在的能量来源。因此，主要标准用于评估组织，因此该方法的有效性评估纤毛打浆的可行性，因为这是活细胞的代表性标志。
室管膜纤毛的实时成像提供了一个功能强大的工具来分析纤毛激活下游的信号转导通路如钙信号和振荡。例如，当使用活荧光成像，已经证明，不论室管膜细胞/纤毛类型，室管膜细胞的特征在于独特的钙振荡特性10。总而言之，这个协议是有关两个基本的科学知识和临床实践。从基础科学的角度来看，这种技术提供了室管膜纤毛结构，功能和机械的下游信号通路的功能和生理功能的评估。从临床实践的角度来看，这种方法是高度相关的搜索药物靶室管膜纤毛作为用于神经性疾病如脑积水和酒精滥用治疗的新靶点。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/HIGH GLUCOSE | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-SP | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-2395 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Fluo-2 | TEF Labs | #0200 | |
| DMSO | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1500 | |
| Anti-acetylated a-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T7451 | clone 6-11B1 |
| FITC Anti-mouse antibody | Vector Labs | FI-2000 | |
| Cell Culture plate | VWR Vista Vision | 30-2041 | |
| Cover Slip (18 x 18) | VWR Vista Vision | 16004.326 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | Leica VT1200S | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM1860 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | Nikon TE2000 | 60X oil |
| Microscope cover glass 24 x 60 mm2 | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| DAPI filter cube | Chroma Technology |
References
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