Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

التصوير المباشر لالبطانة العصبية سيليا في البطينات الجانبية للدماغ الفأر

Published: June 1, 2015 doi: 10.3791/52853
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1
1Department of Pharmacology and Experimental Therapeutics, University of Toledo, College of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 2Life Sciences Institute, University of Michigan, 3Department of Biomedical & Pharmaceutical Sciences, Chapman University, School of Pharmacy, Rinker Health Science campus

Summary

باستخدام عالية الدقة تدخل الفرق النقيض (DIC) المجهري، ويتجلى ملاحظة المجراة سابقا من ضرب أهداب بطانية عصبية متحركة تقع داخل البطينات الدماغية الماوس عن طريق الحية التصوير. هذه التقنية تتيح للتسجيل فريدة من نوعها تردد الهدبية الضرب والضرب زاوية وكذلك الكالسيوم داخل الخلايا خصائص التذبذب سرعة الخاصة بهم.

Abstract

خلايا البطانة العصبية Multiciliated خط البطينين في الدماغ الكبار. ويرتبط ظيفة غير طبيعية أو بنية أهداب بطانية عصبية مع مختلف عجز عصبي. التيار فيفو السابقين التصوير المباشر متحركة تقنية أهداب البطانة العصبية يسمح لدراسة تفصيلية لديناميات الهدبية بعد عدة خطوات. وتشمل هذه الخطوات: الفئران القتل الرحيم مع ثاني أكسيد الكربون وفقا لبروتوكولات جامعة الرعاية المؤسسية توليدو الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC)؛ قطع القحف تليها إزالة المخ وسهمي تشريح الدماغ مع vibratome أو شفرة حادة للحصول على المقاطع رقيقة جدا من خلال البطينين الوحشي الدماغ، حيث يمكن تصور أهداب بطانية عصبية. حضانة شرائح الدماغ في لوحة من الزجاج السفلي مخصصة تحتوي على التعديل النسر المتوسطة (DMEM) / ارتفاع الجلوكوز، Dulbecco وعند 37 درجة مئوية في ظل وجود 95٪ / 5٪ O 2 / CO 2 مزيج أمر ضروري للحفاظ على الأنسجة على قيد الحياة خلالالتجربة. ثم يتم تسجيل الفيديو من الضرب أهداب باستخدام مجهر تدخل الفرق التباين العالي الدقة. ثم يتم الفيديو تحليل الإطار من جانب الإطار لحساب التردد الهدبية الضرب. وهذا يسمح تصنيف واضح للخلايا البطانة العصبية إلى ثلاث فئات أو أنواع على أساس تردد الهدبية الضرب وزاوية. وعلاوة على ذلك، وهذا الأسلوب يسمح استخدام عالية السرعة تحليل التصوير مضان لتحديد خصائص فريدة من نوعها داخل الخلايا خصائص التذبذب الكالسيوم من خلايا البطانة العصبية فضلا عن تأثير كلاء الدوائية على التذبذبات الكالسيوم وتردد الهدبية الضرب. بالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب هو مناسبة للتصوير المناعي للهيكل الهدبية والهدبية البروتين توطين الدراسات. هذا مهم بشكل خاص في تشخيص المرض والنمط الظاهري الدراسات. ويعزى القيد الرئيسي لهذه التقنية إلى انخفاض في حي حركة أهداب متحركة كما تبدأ أنسجة المخ في الموت.

Introduction

أهداب هي عضيات القائم على أنيبيب الحسية التي تمتد من سطح الخلية إلى البيئة خارج الخلية. حسب منظمة أنيبيب، ويمكن تصنيف أهداب إلى نوعين - "9 + 0" أو "9 + 2". وظيفيا، استنادا إلى الحركة، ويمكن ان تصنف هذه كما متحركة أو غير متحركة أهداب 1. أهداب الأساسي هو مصطلح يستخدم عادة للدلالة على "9 + 0" أهداب غير متحركة. هذه تسع الأنابيب الدقيقة صدرة موازية (الرمز بواسطة '9') وزوج المركزي من الأنابيب الدقيقة غائب داخل غمد المركزي (الرمز بواسطة '0'). ومع ذلك، بعض "9 + 0" أهداب، مثل أهداب العقدي، التي تنظم الجنين تجانب هم متحركة 2. من ناحية أخرى، تتميز أهداب متحركة، بالإضافة إلى تسعة الحلل أنيبيب بالتوازي مع ذلك، عن طريق الزوج المركزي إضافي من الحلل أنيبيب والمرتبطة البروتينات داينين ​​السيارات لتسهيل الحركة. بالإضافة إلى ذلك، بعض "9+2 "أهداب مثل أهداب الشم غير قابلة للمتحرك 3. وتتميز خلايا البطانة العصبية تبطن البطينات الدماغ والقناة المركزية للحبل الشوكي عن طريق أهداب متحركة التي تدفع السائل النخاعي (CSF) جنبا إلى جنب البطينين الدماغ 4.

الهدف العام من هذه الطريقة هو تسهيل دراسة ديناميات أهداب والتشوهات الهيكلية متحركة. صحة الدماغ والتنمية تعتمد بشكل كبير على التداول بكفاءة CSF داخل البطينات الدماغية. على سبيل المثال، وتدفق CSF طبيعي وتوازن السوائل يتطلب الضرب الطبيعي والوظيفي أهداب بطانية عصبية 5،6، والتي بدورها تلعب أدوارا حاسمة في تنظيم حركة الاتجاه الخلايا العصبية ووقف الهجرة الخلية 7. على هذا النحو، غير طبيعي وظيفة الأهداب البطانة العصبية أو بنية يمكن أن يؤدي إلى تدفق CSF الشاذ، الذي يرتبط مع استسقاء الدماغ، وهي حالة طبية التي يوجد فيها تراكم غير طبيعي للCSF في بطينات بالمطر. هذا قد يسبب بالتالي زيادة الضغط داخل الجمجمة والتوسيع التدريجي من الرأس، والتشنج، رؤية النفق، والإعاقة العقلية 8.

مزايا هذه التقنية على الطرق القائمة هو أنه سمح للمرة الأولى أن يقدم ثلاثة أنواع الخلايا البطانة العصبية متميزة: I، II، III و، على أساس فريد من نوعه تردد الهدبية الضرب والضرب زاوية. يتم ترجمة هذه خلايا البطانة العصبية في مناطق معينة في الدماغ البطينين. وعلاوة على ذلك، فإن آثار العمر وكلاء الدوائية مثل الكحول وcilostazol على تغيير الأنماط الخلوية البطانة العصبية أو تعريب بهم يمكن البرهنة، الذي لم يكن ممكنا من قبل هذا التصنيف من خلايا البطانة العصبية. Cilostazol هو المانع من الفوسفو-3، وهو الانزيم الذي يتأيض المخيم لAMP وينظم أيضا الكالسيوم داخل الخلايا 9. باستخدام عالية السرعة تحليل التصوير مضان يسمح التصوير وقياس للداخل خلوية فريدة من نوعهاخصائص التذبذب الكالسيوم من الخلايا البطانة العصبية. على سبيل المثال، على حد سواء الكحول وcilostazol تغيير كبير في بطانية عصبية تردد الهدبية الضرب وكذلك الخلايا خصائص التذبذبات الكالسيوم، والذي بدوره يمكن أن يؤدي إلى تغيير في النخاعي استبدال حجم السوائل عن طريق أهداب بطانية عصبية 10. باختصار، كانت هذه التقنية الرئيسية لتوفير أول دليل على ثلاثة أنواع متميزة من خلايا البطانة العصبية مع مختلف خصائص التذبذب الكالسيوم.

في المقطع التالي، وتقدم خطوة بخطوة محة مفصلة عن الإجراء، مع إيلاء اهتمام وثيق لإعداد الأنسجة والتعامل معها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على إجراءات للاستخدام الحيواني من لجنة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من جامعة توليدو وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في المعاهد الوطنية للصحة ودليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.

1. الدماغ استخراج، باجتزاء والأنسجة التحضير

  1. تضحية من نوع السلالة البرية الماوس C57BL / 6 قبل القتل الرحيم بعمق مع CO 2 اختناق لمدة 5 دقائق. أؤكد وفاة خلع عنق الرحم.
  2. تنظيف رأس الفأر مع الايثانول 70٪.
  3. أداء قطع القحف باستخدام مقص العقيمة وملقط عن طريق سحب لأول مرة خارج الجلد، بدءا من قمة الرأس إلى فضح الجمجمة.
  4. ثم، عندما يتعرض الجمجمة، وإزالة الجمجمة عن طريق تقشير قطعة تلو قطعة العظم، بدءا من الجانب الخلفي والتحرك نحو الجانب الأمامي. الحرص على عدم تدمير البطينات الدماغية.
  5. جمع الدماغ كله.
  6. وضع الدماغ في 100 مم طبق بتري تحتوي على DMEM / ارتفاع الجلوكوز تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) و 1٪ محلول البنسلين / الستربتومايسين تحتوي على 10000 وحدة / مل من البنسلين و 10،000 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين وقبل حرارة إلى 37 ° C.
  7. شريحة الدماغ على المستوى السهمي متوسط ​​باليد بشفرة حادة، والحصول على أول 100-200 ملم قسم من كل شوط باستخدام vibratome.
  8. شطف أنسجة المخ مع حرارة ما قبل 37 ° C الفوسفات مخزنة المالحة (1X PBS) حل.
  9. المكان على الفور قسم الدماغ في DMEM / الإعلام السامية الجلوكوز مسبقا تحسنت إلى 37 درجة مئوية.

2. لايف التصوير تكوين وإعداد

  1. وضع المقاطع أنسجة المخ في أطباق ثقافة أسفل الزجاج 30 ملم تحتوي على 1 مل من DMEM / وسائل الإعلام عالية الجلوكوز، ضبط بيئة غرفة مغلقة المجهر في 37 ° C، و 95٪ / 5٪ O 2 / CO 2 المحتوى (الشكل 1
  2. باستخدام 60X موضوعية عدسة الغمر النفط، وجمع خلايا البطانة العصبية / صور أهداب عن طريق وضع أول هبوط النفط في عدسة الهدف 60X، والتركيز على الخلايا مع مدينة دبي للإنترنت العادية التي تنتقل عن طريق الضوء.
  3. ثم اتبع اتجاه حركة فقاعة DMEM كدليل لمكان وجود أهداب بطانية عصبية متحركة عن الضرب الهدبية خلق نوع من الحركة فقاعة في المنطقة. اختيار المنطقة التي تحتوي على الخلايا السليمة مع أهداب متحركة في البطين الجانبي للمخ باستخدام فلتر DIC. حالما يتم العثور على أهداب بطانية عصبية، وضبط ضوء والتركيز على الحصول على صورة مرضية.
  4. تعيين المعلمات التصوير الحية وفقا لهدف معين باستخدام برامج التصوير Metamorph. في التظاهرة الحالية، والحصول على عشرين أربع صور بت مع binning مجموعة الكاميرا إلى 1 × 1 جنبا إلى جنب مع 60X موضوعي و5-10 مللي ثانية زمن التعرض.
  5. جمع الصور DIC عن طريق فتح فتحة المجهر إلى المستوى الأمثل من أجل أن يكون الحد الأدنى لإكسبالوقت osure. مراقبة الصور الحية تيار إلى الكاميرا لتوفير الحصول على الصور سريع وفوري دون تأخير. حساب سرعة أهداب الضرب استنادا إلى متطلبات العصر التعرض الحد الأدنى للحصول على ما يكفي من النقيض من الصورة.

3. التصور البيانات وتحليل

  1. حساب عدد من الضرب أهداب عن طريق حساب عدد من الضرب في 1 دقيقة. القيام بذلك عن طريق خفض سرعة الفيديو وحساب عدد دقات باستخدام عداد الخلية أو أداة مماثلة.
  2. لحساب تواتر الضرب ومضاعفة زمن التعرض الذي يتم تسجيل الفيديو من قبل عدد من الأطر أو الوقت الفاصل بين الصور المكتسبة للحصول على عدد من ثانية. (مثال: زمن التعرض 5 ميللي ثانية 200 إطارات = 1000 ميللي ثانية أو 1 ثانية).
  3. احسب عدد الضرب في ثانية واحدة للحصول على وتيرة والتي يتم التعبير عن عدد من الضرب في واحدة ثانية. القيام بذلك عن طريق قسمة عدد من الضرب أهداب أكثر من مرة بين ثانية واحدةفال (مثال: أهداب يدق 50 مرة في شريط فيديو 200 إطارات سجلت في وقت تعرض 5 ميللي ثانية أي 5 ميللي ثانية × 200 إطارات = 1 ثانية؛ تقسيم الآن 50 نبض ب 1 ثانية = 50 هرتز).
  4. حساب الزاوية الهدبية الضرب من خلال تقييم المسار الذي اتخذه أهداب بطانية عصبية خلال كل من السكتات الدماغية القوة والانتعاش. تنفيذ هذا وفقا لطريقة وصفها سابقا، مع بعض التعديلات الطفيفة 11. لوحظ حركة دقيقة من أهداب الفردي خلال دورة ضربات كاملة.
  5. على ورقة خلات وضعت على الشاشة، ورسم خط أفقي على طول حافة البطانة العصبية وخط عمودي من خلال موقف خط الوسط من أهداب في بداية شوط القدرة.
  6. رسم موقف دقيق للإطار هدب من جانب الإطار وهي تتحرك إلى الأمام خلال شوط القدرة. بطريقة مماثلة، رسم حركة أهداب أثناء السكتة الدماغية الانتعاش.
  7. حساب الزاوية الهدبية الضرب من الانحراف إلى أقصى حد من هدب من خط الوسط خلال رانه السكتة الدماغية السلطة وكذلك السكتة الدماغية الانتعاش.

4. الكالسيوم تسجيل الإشارات

  1. تشريح المخ بعد، وشطف لفترة وجيزة شريحة الدماغ مع 1X PBS أو PBS Dulbecco و(7.0 درجة الحموضة). إعداد جديدة فلوو-2 لتجنب مضان التبريد والحصول على نسبة جيدة إشارة إلى الضجيج.
  2. إعداد 1 ملم حل سهم فلوو-2 الحل في dimethylsulfoxide (DMSO)، ومزيج دوامة الحل لمدة 5 دقائق على الأقل لضمان فلوو-2 تم ​​حل متجانس في DMSO.
  3. تمييع الحل الأسهم فلوو-2 في 500 مل من DMEM / ارتفاع الجلوكوز تستكمل مع 2٪ B27 قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية إلى تركيز النهائي من 20 ملغ / مل.
    ملاحظة: B-27 هو الأمثل المصل خالية ملحق التي تحتوي على فيتامين A، كوكتيل المضادة للأكسدة والأنسولين المستخدمة لدعم استمرارية قصيرة أو طويلة الأجل للقرن آمون والخلايا العصبية CNS أخرى.
  4. احتضان فورا شريحة الدماغ مع 20 ملغ / مل فلوو-2 لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C في لوحة من الزجاج السفلي.
  5. لتحديد تركيز التحميل الأمثل للfluorophore الكالسيوم فلوو-2 وتجنب سمية خلية الصبغة الكالسيوم، وخلايا التحدي مع ATP، والتحقق من بقاء الخلية عن طريق تحديد مسار الوقت وحجم الذروة من إشارات الكالسيوم ردا على ATP.
  6. تسجيل فيديو لالتذبذب الكالسيوم بمعدل القبض على 5 ميللي ثانية مدة لا تقل عن 1 ثانية (200 لقطة في الثانية)، مع الإثارة وانبعاث موجات من 488 نانومتر و 515 نانومتر، على التوالي (فيلم 2).
  7. لتمييز إشارة الكالسيوم فلوو-2 من تألق ذاتي أو حركة القطع الأثرية، تأكد من أن شدة المنبعثة عند 515 نانومتر ويتم رصد كل على حدة.
    ملاحظة: فلوو-2 ليست fluoremetric الكالسيوم مناسبة لقياس الكالسيوم داخل الخلايا. ومع ذلك، فإنه هو صبغة دينامية الكالسيوم ممتازة للكشف عن تغيرات سريعة الكالسيوم، مثل التذبذبات الكالسيوم. لتقدير الكالسيوم أكثر دقة، يوصى FURA-2. ومع ذلك، فإن التغييرات ديناميكية للFURA 2 محدودة بسبب ratiometric لهاطبيعة الصبغة.
  8. اتبع الصيغ المقدمة من قبل الشركة المصنعة لحساب القيم الكالسيوم داخل الخلايا الحرة بالضبط. مثال [كا 2+] = K د × (R - R دقيقة) / (R ماكس - R). حيث K d هو ثابت التفكك للصباغة من الكالسيوم المفرج عنهم، R هو مضان محسوب في 488، وR دقيقة وR ماكس هي نسب مضان في الحد الأدنى والحد الأقصى للتركيز أيون 12.

5. المناعي المجهري

  1. إصلاح أقسام الدماغ مع الفوسفات مخزنة محلول ملحي يحتوي على 4٪ لامتصاص العرق (PFA) و 2٪ سكروز لمدة 10 دقيقة. بدلا من ذلك، وتحديد الدماغ كله مع 4٪ PFA ثم قسم إلى 50 ملم المقاطع باستخدام ناظم البرد.
  2. غسل الأنسجة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق في كل مرة.
  3. احتضان شريحة الدماغ مع solutiعلى 0.1٪ تريتون-X في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق، ثم شطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق في كل مرة.
  4. احتضان شريحة المخ مع الأجسام المضادة الماوس الابتدائي، antiacetylated على تويولين، وتستخدم في التخفيف 1: 5000 في 10٪ FBS في برنامج تلفزيوني 1X لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (RT) أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  5. غسل الأنسجة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق في كل مرة.
  6. احتضان شريحة الدماغ في الضد الثانوية، فلوريسئين المضادة للماوس مفتش في التخفيف من 1: 500 في 10٪ FBS في برنامج تلفزيوني 1X الحل لمدة 1 ساعة على RT.
  7. قبل الملاحظة تحت المجهر الفلورسنت، مباين القسم مع 4، 6-diamidino-2-phenylindole (دابي) لمدة 5 دقائق إلى وصمة عار على النواة (أو DNA) 13. لتقليل photobleaching من والصورة الأقسام فورا مع الحد الأدنى من الوقت احتمال التعرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

قياس وظيفة الأهداب البطانة العصبية في دماغ الفأر الحي

يتم استخدام الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول لمراقبة وظيفة الأهداب البطانة العصبية وهيكل في أنسجة جديدة تشريح من مخ الفأر وكذلك لرصد ودراسة أهداب تردد الضرب. وصفت الخطوات المتبعة لإنجاز تجربة كاملة في مخطط التخطيطي (الشكل 1). ينصح بشدة أن يتم إجراء التجربة ضمن إطار زمني قصير في النظام للحفاظ على أهداب متحركة نشطة قدر الإمكان. وترد أيضا ممثل فيلم الوقت الفاصل بين والصور من الخلايا البطانة العصبية وأهداب بهم متحركة (فيلم 1 والشكل 2A). ويتم إنجاز تحليل البيانات في مجرى الحصول عليها عن طريق عد نمط الضرب وزاوية أهداب تتحرك. وترد معايير لتقسيم أهداب إلى ثلاثة أنواع في الجدول 1. وجود أهداب بطانية عصبية هو confirmed مع علامة الهدبية، الأسيتيل واحد في تويولين، وcounterstained الخلايا البطانة العصبية مع دابي (DNA علامة) لإظهار النواة (الشكل 2B). بناء على ملاحظاتنا خلايا البطانة العصبية في الدماغ البطين الجانبي من 22 على الأقل تجارب مستقلة، كنا قادرين على تصنيف خلايا البطانة العصبية إلى ثلاثة أنواع على أساس تردد الهدبية الضرب بهم. وعلاوة على ذلك، أثبتنا أن الإيثانول بتركيز 0.25٪ قمعها بشكل ملحوظ تردد أهداب الضرب بغض النظر عن نوعها (الشكل 3). الأهم من ذلك، وهذه البيانات هي التي تنسجم مع النتائج التي توصلنا إليها السابقة (10).

قياس الإشارات الكالسيوم التي كتبها أهداب بطانية عصبية

وقد تبين في السابق أن الانحناء من أهداب يمكن أن تؤدي إلى الكالسيوم داخل الخلايا التي تعتمد على هدب يشير 14-16. هذا الأسلوب يسمح للباحثين لدراسة وقياس إشارة الكالسيوم داخل الخلية داخل البطينات الدماغية > (فيلم 2). إحدى يمكن تطبيق منهجية مماثلة لتسجيل الاهتزازات الكالسيوم عصاري خلوي ردا على تفعيل أهداب بطانية عصبية أو في الاستجابة للعلاج مع وكلاء الدوائية. لدراسة عصاري خلوي الكالسيوم، وحضنت الأنسجة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع مؤشر الكالسيوم، فلوو-2. يتم بث الصور الحية من الكالسيوم عصاري خلوي التذبذب / مستوى في الإثارة وانبعاث موجات من 488 و 515 نانومتر، على التوالي.

الشكل 1
ويوضح البطانة العصبية مخطط بروتوكول التصوير أهداب بروتوكول التصوير أهداب البطانة العصبية الخطوات لإكمال تجربة بدءا من الماوس brainextraction، باجتزاء وإعداد الأنسجة إلى الحصول على الصور والتحليل: الرقم 1. ويرد تقريبي ساعة واحدة زمني مع خطوة بخطوة الإجراء.

ه 2 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 52853 / 52853fig2.jpg "/>
الشكل 2: البطانة العصبية توطين أهداب في البطينات الدماغية المعروضة هنا هي خلايا البطانة العصبية من البطين الجانبي للدماغ الفأر. (أ) وتظهر الصور DIC الخلايا الفردية البطانة العصبية (الأسهم السفلى) وأهداب (أعلى السهام). (ب) اتسخت صورة التراكب من قسم المخ مع الأجسام المضادة ضد علامة الهدبية، الأسيتيل على تويولين، كما هو موضح في جرين (أعلى السهام)، و counterstained مع علامة النووي / الحمض النووي، دابي، كما هو موضح في الزرقاء (الأسهم السفلى) . يرجى ملاحظة أن فريقي أ و ب يمثلون أقسام الدماغ المختلفة.

الشكل (3)
الشكل 3: الكحول والاختلاف في أهداب بفوزه على الترددات ضمن الأنواع من خلايا البطانة العصبية للبطين الوحشي مخ الفأر وقد حضنت شريحة المخ فيفو السابقين دون (مراقبة) أو مع (Ethanol) 0.25٪ كحول لمدة 5 دقائق. مقارنة السيطرة عليها، الكحول العلاج انخفضت بشكل ملحوظ أهداب تردد الضرب، كما يتبين من علامة النجمة. واستخدمت 10/05 على الأقل الاستعدادات مستقلة لكل نوع من الخلايا وعلاج مجموعة البطانة العصبية.

فيلم 1: تسجيل أهداب بطانية عصبية في النوع الثالث خلايا البطانة العصبية المعروضة هنا هي تسجيلات لأهداب بطانية عصبية، وتتميز بفوزه على وتيرة وزاوية فريدة من نوعها لكتابة III خلايا البطانة العصبية من البطين الثالث للمخ. هذا الرقم قد ذكرت سابقا 10 وإعادة استخدامها بإذن.

فيلم 2: التذبذب الكالسيوم داخل الخلايا في الخلايا البطانة العصبية يظهر هنا هي التسجيلات من التذبذبات الكالسيوم من خلايا البطانة العصبية من خلال قسم من فين الجانبي للدماغ.tricle بعد احتضان شريحة الدماغ مع 20 ملغ / مل مؤشر الكالسيوم، فلوو-2، لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C. تمت دراسة مستوى الكالسيوم قسم المخ والملونة الزائفة. يشير شريط اللون مستوى الكالسيوم في خلايا البطانة العصبية '؛ حيث الأسود الأرجواني والأحمر والأصفر تمثل مستويات منخفضة وعالية من الكالسيوم، على التوالي. لتقدير الكالسيوم داخل الخلايا، وسيتم احتساب الكالسيوم خلية بطانية عصبية من عدة خلايا البطانة العصبية الفردية، كما ورد في نص البروتوكول وبلغ متوسط ​​بين المجموعات الضابطة والعلاج. تم تسجيل الفيديو من التذبذب الكالسيوم في 200 لقطة في الثانية مع الإثارة وانبعاث موجات من 488 نانومتر و 515 نانومتر، على التوالي. هذا الرقم قد ذكرت سابقا 10 وإعادة استخدامها بإذن.

نوع من الخلايا البطانة العصبية أهداب تردد الضرب أهداب زاوية الضرب
النوع الأول > 60 هرتز <90 درجة
النوع الثاني 30-60 هرتز 90-135 °
النوع الثالث <30 هرتز > 135 °

الجدول 1: أنواع من أهداب بطانية عصبية تصنيف أهداب بطانية عصبية في النوع الأول، واستند الثاني أو الثالث في المقام الأول على وتيرة الضرب والضرب زاوية أهداب بطانية عصبية تقع في مناطق مختلفة من البطين الثالث للمخ. أجزاء من هذه البيانات قد أعلنت في وقت سابق وتم إعادة استخدامها هنا بتصريح.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هو موضح هنا هو بروتوكول لإعداد أنسجة المخ الماوس لكل من يعيش التصوير والفحص المجهري مضان التي توفر الملاحظة السريعة والحساسة وثيقة من أهداب بطانية عصبية داخل البطينات الدماغية. ولا تقتصر هذه التقنية إلى البطين الجانبي فقط؛ يمكن استخدامه لمراقبة أهداب في البطينات الدماغية الأخرى. وتوفر هذه التقنية التصوير والبث المباشر التي تمثل حركة CSF التي كتبها الهدبية الضرب في بيئة خارج الحي. علاوة على ذلك، تمكن من تحليل لحركة الاتجاه للأهداب. ومما يسهل ذلك أساسا عن طريق استخدام دقة عالية DIC ونظام التصوير مضان. ومن مزايا هذا النظام هو أن يتم وضع المجهر في غرفة البيئية، والذي يسمح لتنظيم جيد للحرارة والرطوبة ومستويات CO 2. هذه هي المعايير الضرورية جدا التي ينبغي النظر فيها من أجل بقاء الخلايا والأنسجة عند أداء والخبير التصوير الحيiments. وقد تم تجهيز النظام أيضا التلقائي مع XY وZ وحدات وكذلك وحدات التحويل الكاميرا والطول الموجي فلتر رقمي، وكلها سمات هامة لتسهيل التصوير من السلوكيات الحيوية الخلوية مثل حركات أهداب. يتم توصيل المجهر لجهاز الكمبيوتر ويتم تسهيل الحصول على صور عالية الجودة عن طريق التصوير البرمجيات.

باستخدام هذه التقنية لتصنيف خلايا البطانة العصبية إلى أنواع متميزة تقدم تقدما كبيرا على الطرق الحالية / السابقة تستخدم لدراسة أهداب بطانية عصبية. على سبيل المثال، وتأثير بعض العوامل الدوائية أو السامة مثل الكحول ويمكن الحد من خلاف أو يبطل إذا تعتبر خلايا البطانة العصبية كما السكانية واحد 17. من المهم أن نأخذ في الاعتبار أنه على الرغم من حقيقة أن خصائص أهداب الضرب ترددات وزوايا مختلفة جدا بين هذه الأنواع الثلاثة من أهداب بطانية عصبية، لقد بدأت للتو في فهم علم وظائف الأعضاء من هذه الخلايا. من هناوفقا لعملنا السابق، وتصنيف لدينا هو قوي بما فيه الكفاية إذا تم تنفيذ الإجراء بشكل صحيح كما هو موضح في هذا البروتوكول.

تحديد أهداب بطانية عصبية متميزة المهم بشكل أساسي للحصول على فهم أساسي للعلم وظائف الأعضاء بطانية عصبية. هذا الأسلوب يجعل من الممكن التمييز بين ثلاثة أنواع متميزة من خلايا البطانة العصبية فريد وعلى وجه التحديد وضعه في البطين الثالث في ما يتعلق تواتر الضرب وزاوية، مما أدى إلى تصنيف إلى ثلاثة أنواع مختلفة (الجدول 1). من أجل التأكد من أن الاختلافات في أهداب بفوزه على الترددات ليست بسبب الاختلافات في بقاء خلايا البطانة العصبية أو الاختلافات في سن الحيوان، فمن المستحسن أن شرائط البطانة العصبية سليمة وundetached فقط أو شرائح التي تعلق على الأنسجة العصبية، وفي تستخدم أقل من 100 مم. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن تقاس الهدبي تردد الضرب في مواقع مختلفة على كل جزء بطانية عصبية. لقد أثبتنا سابقا أن البيانات تردد الهدبية ضربات تم إنشاؤها باستخدام هذه التقنية تم استنساخه باستمرار بين 87 الملاحظات التجريبية 10. وبالتالي، تصنف خلايا البطانة العصبية بدقة اعتمادا على الضرب الهدبية الخاصة بهم. وعلاوة على ذلك، عند استخدام وكلاء الدوائية التي هي معروفة لخفض وتيرة الهدبية الضرب، وينبغي تكرار الضرب أهداب تعود نظريا إلى تردد الضرب الطبيعي بعد إزالة تلك كلاء الدوائية.

A خطوة حاسمة في هذا البروتوكول هو ذات الصلة أساسا إلى التعامل مع أنسجة المخ والوقت اللازم لإتمام التجربة. لا بد من التعامل مع أنسجة المخ بلطف من أجل الحفاظ على بنية ووظيفة أهداب بطانية عصبية وكذلك للحد من الصدمة إلى الأنسجة الهشة. الأهم من ذلك، وتجنب تدهور وموت أنسجة الدماغ، الذي يمكن أن يكون العامل المحدد لنجاح هذا الأسلوب، فمن اوصت غايةد أن يتم تنفيذ الخطوات المرتبطة بهذا الأسلوب في أقرب إلى ساعة واحدة ممكن. ومع ذلك، يمكن التغلب على هذا القيد في المستقبل مع التقدم في زراعة والبطانة العصبية المتزايدة أو أنواع الخلايا مماثلة مع أهداب متحركة في المختبر أو مع استخدام وسائل الإعلام المغذية بديل. وقد ثبت استخدام وسائل الإعلام الغذائية البديلة مثل ACSF وأملاح ايرل للحضانة شرائح الدماغ في الأدب 5. ومع ذلك، في أيدينا، كان استخدام DMEM / ارتفاع الجلوكوز أكثر فائدة من ACSF وربما يعود ذلك إلى وجود كمية عالية من الجلوكوز (4500 ملغ / مل) في المتوسطة كمصدر للطاقة المحتملين. وبالتالي، استخدام المعيار الرئيسي لتقييم جدوى من الأنسجة، وبالتالي على صحة النهج بتقييم أهداب الضرب، وهذا هو علامة تمثيلية من الخلايا الحية.

تصوير حي لأهداب بطانية عصبية يوفر أداة قوية لتحليل مسارات إشارات المصب تفعيل أهدابمثل إشارات الكالسيوم والتذبذبات. على سبيل المثال، باستخدام التصوير مضان الحية، وقد ثبت أنه بغض النظر عن بطانية عصبية نوع من الخلايا / أهداب، وتتميز خلايا البطانة العصبية بالكالسيوم فريد خصائص التذبذب 10. الكل في الكل، وهذا البروتوكول هو صلة بكل من المعرفة العلمية الأساسية والممارسة السريرية. من وجهة نظر العلوم الأساسية، هذه التقنية تقدم تقييما للأدوار الوظيفية والفسيولوجية للبنية أهداب بطانية عصبية، وظيفة والمصب مسارات الإشارات الميكانيكية. من منظور الممارسة السريرية، وهذه الطريقة هي ذات أهمية كبيرة للبحث عن المخدرات التي تستهدف أهداب البطانة العصبية كهدف علاجي جديد لعلاج الاضطرابات العصبية مثل استسقاء الرأس وتعاطي الكحول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

أعلنت أي تضارب في المصالح.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/HIGH GLUCOSE Cellgro Mediatech Inc. 10-013-CV
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone SH30088-03
Penicillin/Streptomycin Thermo Scientific SV30010
Phosphate buffered saline Thermo Scientific SH30256-01
Paraformaldehyde  Electron Microscopy Sciences 15710-SP
Sucrose Sigma-Aldrich S-2395
Triton-X Sigma-Aldrich T9284
Fluo-2  TEF Labs #0200
DMSO
B27 Gibco 17504044
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI Vector Labs H-1500
Anti-acetylated a-tubulin antibody Sigma-Aldrich T7451  clone 6-11B1
FITC Anti-mouse antibody Vector Labs FI-2000
Cell Culture plate VWR Vista Vision 30-2041
Cover Slip (18 x 18) VWR Vista Vision 16004.326
Vibratome Leica Biosystems Leica VT1200S
Cryostat Leica Biosystems Leica CM1860
Inverted Fluorescence Microscope Nikon  Nikon TE2000 60X oil 
Microscope cover glass 24 x 60 mm2 VWR Vista Vision 16004-312
Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1500
DAPI filter cube Chroma Technology

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. AbouAlaiwi, W. A., Lo, S. T., Nauli, S. M. Primary cilia: Highly sophisticated biological sensors. Sensors. 9 (9), 7003-7020 (2009).
  2. Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking kif3b motor protein. Cell. 95 (6), 829-837 (1998).
  3. Satir, P., Christensen, S. T. Overview of structure and function of mammalian cilia. Annual review of physiology. 69, 377-400 (2007).
  4. Delbigio, M. R. The ependyma - a protective barrier between brain and cerebrospinal-fluid. Glia. 14 (1), 1-13 (1995).
  5. Genzen, J. R., Platel, J. C., Rubio, M. E. Bordey A. Ependymal cells along the lateral ventricle express functional p2x(7) receptors. Purinergic signalling. 5 (3), 299-307 (2009).
  6. Appelbe, O. K., et al. Disruption of the mouse jhy gene causes abnormal ciliary microtubule patterning and juvenile hydrocephalus. Developmental biology. 382 (1), 172-185 (2013).
  7. Sawamoto, K., et al. New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain (New York, N.Y.). Science. 311 (5761), 629-632 (2006).
  8. Banizs, B., et al. Dysfunctional cilia lead to altered ependyma and choroid plexus function, and result in the formation of hydrocephalus. Development. 132 (23), 5329-5339 (2005).
  9. Kawanabe, Y., et al. Cilostazol prevents endothelin-induced smooth muscle constriction and proliferation. PloS one. 7 (9), e44476 (2012).
  10. Liu, T., Jin, X., Prasad, R. M., Sari, Y., Nauli, S. M. Three types of ependymal cells with intracellular calcium oscillation are characterized by distinct cilia beating properties. J Neurosci Res. 92 (9), 1199-1204 (2014).
  11. Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: Comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
  12. Nauli, S. M., Jin, X., AbouAlaiwi, W. A., El-Jouni, W., Su, X., Zhou, J. Non-motile primary cilia as fluid shear stress mechanosensors. Methods in enzymology. 525, 1-20 (2013).
  13. AbouAlaiwi, W. A., et al. Survivin-induced abnormal ploidy contributes to cystic kidney and aneurysm formation. Circulation. 129 (6), 660-672 (2014).
  14. AbouAlaiwi, W. A., et al. Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades. Circulation research. 104 (7), 860-869 (2009).
  15. Jin, X., et al. Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli. Cell Mol Life Sci. 71 (11), 2165-2178 (2014).
  16. Praetorius, H. A., Spring, K. R. Bending the mdck cell primary cilium increases intracellular calcium. The Journal of membrane biology. 184 (1), 71-79 (2001).
  17. Smith, C. M., Radhakrishnan, P., Sikand, K., O'Callaghan, C. The effect of ethanol and acetaldehyde on brain ependymal and respiratory ciliary beat frequency. Cilia. 2 (1), 5 (2013).

Tags

علم الأعصاب، العدد 100، أهداب متحركة، البطين الجانبي، السائل النخاعي، والتصوير الحي، استسقاء الرأس.
التصوير المباشر لالبطانة العصبية سيليا في البطينات الجانبية للدماغ الفأر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Al Omran, A. J., Saternos, H. C.,… More

Al Omran, A. J., Saternos, H. C., Liu, T., Nauli, S. M., AbouAlaiwi, W. A. Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (100), e52853, doi:10.3791/52853 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter