Summary
उच्च संकल्प अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना, माउस मस्तिष्क निलय के भीतर स्थित गतिशील ependymal सिलिया की पिटाई की एक पूर्व vivo अवलोकन रहते इमेजिंग द्वारा प्रदर्शन किया है। तकनीक के लिए एक अनूठा सिलिअरी पिटाई आवृत्ति की रिकॉर्डिंग और पिटाई के कोण के साथ ही उनके intracellular कैल्शियम दोलन पेसिंग गुणों की अनुमति देता है।
Abstract
Multiciliated ependymal कोशिकाओं वयस्क मस्तिष्क में निलय लाइन। असामान्य समारोह या ependymal सिलिया की संरचना विभिन्न न्यूरोलॉजिकल घाटे के साथ जुड़ा हुआ है। गतिशील ependymal सिलिया तकनीक के पूर्व vivo रहते इमेजिंग वर्तमान में कई चरणों का पालन सिलिअरी गतिशीलता का एक विस्तृत अध्ययन के लिए अनुमति देता है। इन चरणों में शामिल हैं: चूहों कार्बन डाइऑक्साइड के साथ इच्छामृत्यु टोलेडो के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के विश्वविद्यालय के प्रोटोकॉल के अनुसार; एक vibratome या तेज ब्लेड के साथ मस्तिष्क को हटाने और बाण के समान मस्तिष्क विच्छेदन द्वारा पीछा craniectomy ependymal सिलिया देखे जा सकते हैं, जहां मस्तिष्क पार्श्व निलय, के माध्यम से बहुत पतली वर्गों को प्राप्त करने के लिए। 95% / 5% हे की उपस्थिति में 2 / सीओ 2 मिश्रण 37 डिग्री सेल्सियस पर Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) / उच्च ग्लूकोज युक्त एक स्वनिर्धारित गिलास नीचे थाली में मस्तिष्क के स्लाइस की ऊष्मायन जीवित ऊतक रखने के लिए आवश्यक है दौरानप्रयोग। सिलिया धड़कन का एक वीडियो तो एक उच्च संकल्प अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोप का उपयोग कर दर्ज की गई है। वीडियो तो सिलिअरी पिटाई आवृत्ति की गणना करने के फ्रेम से फ्रेम का विश्लेषण किया जाता है। यह उनकी सिलिअरी पिटाई आवृत्ति और कोण के आधार पर तीन श्रेणियों या प्रकारों में ependymal कोशिकाओं के अलग वर्गीकरण की अनुमति देता है। इसके अलावा, इस तकनीक ependymal कोशिकाओं की अनूठी intracellular कैल्शियम दोलन गुणों के साथ-साथ कैल्शियम दोलनों पर औषधीय एजेंटों के प्रभाव और रोमक पिटाई आवृत्ति चिह्नित करने के लिए उच्च गति प्रतिदीप्ति इमेजिंग विश्लेषण के उपयोग की अनुमति देता है। इसके अलावा, इस तकनीक सिलिअरी संरचना और रोमक प्रोटीन स्थानीयकरण के अध्ययन के लिए immunofluorescence इमेजिंग के लिए उपयुक्त है। इस रोग के निदान और phenotype के अध्ययन में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। मस्तिष्क के ऊतकों को मरने के लिए शुरू होता है के रूप में तकनीक की मुख्य सीमा लाइव गतिशील सिलिया आंदोलन में कमी करने के लिए जिम्मेदार ठहराया है।
Introduction
Cilia बाह्य वातावरण को कोशिका की सतह से करता हूं कि संवेदी सूक्ष्मनलिका आधारित अंगों हैं। "9 + 0" या "9 + 2" - अपने सूक्ष्मनलिका संगठन पर निर्भर करता है, सिलिया दो प्रकार में वर्गीकृत किया जा सकता है। कार्यात्मक, उनकी गतिशीलता के आधार पर, इन गतिशील या गैर गतिशील सिलिया 1 के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है। प्राथमिक सिलिया सामान्यतः "9 + 0" गैर गतिशील सिलिया निरूपित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। ये ('9' से चिह्नित) नौ समानांतर नक़ल सूक्ष्मनलिकाएं है और सूक्ष्मनलिकाएं के एक केंद्रीय जोड़ी ('0' से चिह्नित) केंद्रीय म्यान के भीतर अनुपस्थित है। हालांकि, भ्रूण laterality विनियमित जो इस तरह के नोडल सिलिया के रूप में कुछ "9 + 0" सिलिया, 2 गतिशील होते हैं। दूसरी ओर, गतिशील सिलिया सूक्ष्मनलिका दोहरी की अतिरिक्त केंद्रीय जोड़ी ने नौ समानांतर सूक्ष्मनलिका दोहरी के अलावा, विशेषता है और गतिशीलता की सुविधा के लिए dynein मोटर प्रोटीन के साथ जुड़े। इसके अलावा, कुछ "9ऐसे घ्राण सिलिया के रूप में दो "सिलिया 3 गैर गतिशील होते हैं। मस्तिष्क निलय और रीढ़ की हड्डी के मध्य नहर अस्तर Ependymal कोशिकाओं मस्तिष्क निलय 4 साथ मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) प्रेरित करना है कि गतिशील सिलिया की विशेषता है।
इस विधि के समग्र लक्ष्य सिलिया की गतिशीलता और संरचनात्मक असामान्यताओं गतिशील का अध्ययन की सुविधा के लिए है। मस्तिष्क के स्वास्थ्य और विकास को भारी मस्तिष्क निलय के भीतर सीएसएफ के कुशल संचलन पर निर्भर करते हैं। उदाहरण के लिए, सामान्य सीएसएफ प्रवाह और तरल पदार्थ संतुलन सामान्य पिटाई और बदले में neuronal कोशिकाओं की दिशात्मक आंदोलन को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और सेल प्रवास 7 स्टेम जो कार्यात्मक ependymal सिलिया 5,6, की आवश्यकता होती है। इस तरह, असामान्य ependymal सिलिया समारोह या जलशीर्ष के साथ जुड़ा हुआ है, जो असामान्य सीएसएफ प्रवाह, को जन्म दे सकता संरचना के रूप में, एक चिकित्सा शर्त है जिसमें बी के निलय में सीएसएफ के एक असामान्य संग्रह नहीं हैबारिश। इस फलस्वरूप intracranial दबाव और सिर, ऐंठन, सुरंग दृष्टि से प्रगतिशील वृद्धि, और मानसिक विकलांगता 8 बढ़ सकता है।
मौजूदा तरीकों पर इस तकनीक का लाभ यह तीन अलग ependymal प्रकार की कोशिकाओं रिपोर्ट करने के लिए पहली बार के लिए अनुमति दी है कि: मैं उनके अद्वितीय सिलिअरी पिटाई आवृत्ति और कोण की धड़कन के आधार पर द्वितीय और तृतीय,। ये ependymal कोशिकाओं मस्तिष्क निलय में कुछ क्षेत्रों के भीतर स्थानीयकृत हैं। इसके अलावा, उम्र और जैसे शराब और ependymal प्रकार की कोशिकाओं या उनके localizations के फेरबदल पर cilostazol के रूप में औषधीय एजेंटों के प्रभाव ependymal कोशिकाओं के इस वर्गीकरण से पहले संभव नहीं था, जो प्रदर्शन किया जा सकता है। Cilostazol फॉस्फोडाइस्टरेज़-3 के एक अवरोध करनेवाला, एएमपी शिविर metabolizes कि एक एंजाइम है और यह भी intracellular कैल्शियम 9 नियंत्रित करता है। उच्च गति प्रतिदीप्ति इमेजिंग विश्लेषण का प्रयोग अनूठा इंट्रासेल्युलर की इमेजिंग और बढ़ाता की अनुमति देता हैependymal कोशिकाओं के कैल्शियम दोलन गुण। उदाहरण के लिए, शराब और cilostazol दोनों काफी बदले में, ependymal सिलिया 10 से मस्तिष्कमेरु द्रव की मात्रा प्रतिस्थापन में बदलाव के लिए ले जा सकता है जो ependymal सिलिअरी पिटाई आवृत्ति के रूप में अच्छी तरह से intracellular कैल्शियम दोलनों गुण, बदल दिया। सारांश में, इस तकनीक को विभिन्न कैल्शियम दोलन गुणों के साथ ependymal कोशिकाओं के तीन अलग-अलग प्रकार का पहला सबूत प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण था।
निम्न अनुभाग में, प्रक्रिया का विस्तृत कदम दर कदम सिंहावलोकन ऊतक तैयारी और से निपटने के लिए करीब ध्यान दे, प्रदान की जाती है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
पशु उपयोग के लिए प्रक्रियाओं के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान और देखभाल और उपयोग के लिए गाइड में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के दिशा निर्देशों के अनुसार टोलेडो विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया प्रयोगशाला पशु की।
1. ब्रेन निकालना, सेक्शनिंग और ऊतक तैयारी
- गहराई से 5 मिनट के लिए सीओ 2 asphyxiation के साथ euthanizing से जंगली प्रकार माउस तनाव C57BL 6 / बलिदान। गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से मौत आश्वासन देता हूं।
- 70% इथेनॉल के साथ माउस सिर को साफ करें।
- पहले खोपड़ी को बेनकाब करने के सिर के ऊपर से शुरू होने वाले बंद त्वचा खींच कर बाँझ कैंची और संदंश का उपयोग craniectomy प्रदर्शन करते हैं।
- फिर, खोपड़ी सामने आ रहा है, जब हड्डी टुकड़ा-दर-टुकड़ा छीलने पीछे की ओर से शुरू करने और पूर्वकाल पक्ष की ओर बढ़ द्वारा खोपड़ी को हटा दें। मस्तिष्क निलय को नष्ट करने के लिए नहीं सावधान रहो।
- पूरे दिमाग लीजिए।
- पेनिसिलिन की 10,000 इकाइयों / एमएल और स्ट्रेप्टोमाइसिन और पूर्व गर्म के 10,000 माइक्रोग्राम / मिलीग्राम से युक्त 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक DMEM / उच्च ग्लूकोज और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान युक्त एक 100 मिमी पेट्री डिश में मस्तिष्क रखें 37 डिग्री सेल्सियस के लिए।
- एक तेज ब्लेड के साथ हाथ से मंझला बाण के समान विमान पर मस्तिष्क टुकड़ा है, और एक vibratome का उपयोग प्रत्येक छमाही से पहले 100-200 मिमी अनुभाग प्राप्त करते हैं।
- पूर्व गर्म 37 डिग्री सेल्सियस फॉस्फेट बफर खारा (1x पीबीएस) समाधान के साथ मस्तिष्क के ऊतकों कुल्ला।
- इसके तत्काल बाद DMEM / उच्च ग्लूकोज मीडिया 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गरम में मस्तिष्क खंड जगह है।
2. लाइव इमेजिंग विन्यास और सेटअप
- DMEM / उच्च ग्लूकोज मीडिया के 1 मिलीलीटर युक्त 30 मिमी गिलास नीचे संस्कृति बर्तन में मस्तिष्क ऊतक वर्गों रखें। 95% / 5% 2 हे / सीओ 2 सामग्री 37 डिग्री सेल्सियस, (चित्रा 1 के लिए माइक्रोस्कोप संलग्न चैम्बर वातावरण को समायोजित करें
- एक 60x उद्देश्य तेल विसर्जन लेंस का प्रयोग, पहले 60X उद्देश्य लेंस पर एक तेल बूंद रखकर और नियमित रूप से जिला उद्योग केंद्र के साथ कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करके ependymal कोशिकाओं / सिलिया छवियों को इकट्ठा प्रकाश प्रेषित।
- सिलिअरी मार क्षेत्र में बुलबुला आंदोलन की तरह बना तब के रूप में, गतिशील ependymal सिलिया के स्थान के लिए एक गाइड के रूप में DMEM बुलबुला आंदोलन की दिशा का पालन करें। डीआईसी फिल्टर का उपयोग कर मस्तिष्क के पार्श्व वेंट्रिकल में गतिशील सिलिया के साथ स्वस्थ कोशिकाओं से युक्त एक क्षेत्र का चयन करें। Ependymal सिलिया पाए जाते हैं एक बार, प्रकाश को समायोजित करने और एक संतोषजनक छवि प्राप्त करने के लिए ध्यान केंद्रित।
- MetaMorph इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक विशेष उद्देश्य के अनुसार रहते इमेजिंग मापदंडों सेट करें। वर्तमान प्रदर्शन में, उद्देश्य 60X और 5-10 मिसे जोखिम समय के साथ संयुक्त 1 एक्स 1 के लिए कैमरा binning सेट के साथ चौबीस-बिट छवियों को प्राप्त।
- एक न्यूनतम EXP है के क्रम में एक इष्टतम स्तर तक माइक्रोस्कोप एपर्चर खोलने के द्वारा डीआईसी छवियों को इकट्ठाosure समय। बिना किसी देरी के तेजी से और तत्काल छवि अधिग्रहण प्रदान करने के लिए कैमरे के लिए जीना छवियों धारा को ध्यान से देखें। पर्याप्त छवि के विपरीत प्राप्त करने के लिए कम से कम जोखिम बार की आवश्यकता के आधार पर सिलिया की धड़कन की गति की गणना।
3. डेटा दृश्य और विश्लेषण
- 1 मिनट में मार की संख्या की गणना के द्वारा सिलिया मार की संख्या की गणना। वीडियो की गति कम और एक सेल काउंटर या इसी तरह के उपकरण का उपयोग कर धड़क रहा है की संख्या की गणना के द्वारा इस करो।
- मार की आवृत्ति की गणना करने के लिए, वीडियो सेकंड की संख्या प्राप्त करने के लिए अधिग्रहण कर लिया फ्रेम या समय चूक छवियों की संख्या से दर्ज की गई है, जिस पर जोखिम समय गुणा। (उदाहरण: जोखिम समय 5 मिसे 200 फ्रेम = 1,000 मिसे या 1 सेकंड)।
- एक सेकंड प्रति पिटाई की संख्या के रूप में व्यक्त किया जाता है, जो आवृत्ति प्राप्त करने के लिए एक दूसरे में मार की संख्या की गणना। एक-दूसरे के लिए समय के अंतर से अधिक सिलिया मार की संख्या से विभाजित करके यह मत करोवैल (उदाहरण: सिलिया = 1 सेकंड 5 मिसे यानी 5 मिसे X 200 फ्रेम के लोगों तक पहुंचाने के समय में दर्ज एक 200 फ्रेम वीडियो में 50 बार धड़कता है, अब 1 सेकंड = 50 हर्ट्ज से 50 धड़कता विभाजित)।
- दोनों बिजली और वसूली स्ट्रोक के दौरान ependymal सिलिया द्वारा उठाए गए पथ का मूल्यांकन द्वारा रोमक पिटाई कोण की गणना। मामूली संशोधनों के साथ 11, एक पहले से वर्णित विधि के अनुसार इस प्रदर्शन करते हैं। व्यक्तिगत सिलिया की सटीक आंदोलन पूरी तरह हरा चक्र के दौरान मनाया जाता है।
- मॉनीटर पर रखा एक एसीटेट पत्रक पर, ependymal बढ़त और बिजली स्ट्रोक के शुरू में सिलिया के midline स्थिति के माध्यम से एक खड़ी रेखा के साथ एक क्षैतिज रेखा खींचना।
- यह शक्ति स्ट्रोक के दौरान आगे बढ़ता रहता है के रूप में फ्रेम से पपनी फ्रेम की सटीक स्थिति प्लॉट। एक समान तरीके में, वसूली स्ट्रोक के दौरान सिलिया के आंदोलन साजिश है।
- टी दौरान midline से पपनी की अधिकतम विचलन से सिलिअरी पिटाई कोण की गणनाबिजली स्ट्रोक के साथ-साथ वसूली स्ट्रोक वह।
4. कैल्शियम सिग्नल रिकॉर्डिंग
- मस्तिष्क टुकड़ा करने की क्रिया के बाद, संक्षेप में 1x पीबीएस या है Dulbecco पीबीएस (पीएच 7.0) के साथ मस्तिष्क टुकड़ा कुल्ला। प्रतिदीप्ति शमन से बचने के लिए और अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात प्राप्त करने के लिए नए सिरे से Fluo-2 तैयार करें।
- , Dimethylsulfoxide (DMSO) में Fluo -2 समाधान के 1 मिमी शेयर समाधान तैयार मिश्रण और Fluo-2 homogenously DMSO में भंग कर रहा है कि यह सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 5 मिनट के लिए समाधान भंवर।
- 2% B27 के साथ पूरक DMEM / उच्च ग्लूकोज की 500 मिलीलीटर में Fluo-2 शेयर समाधान पतला 20 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म।
नोट: बी -27 विटामिन ए, एंटीऑक्सीडेंट कॉकटेल और हिप्पोकैम्पस और अन्य सीएनएस न्यूरॉन्स की छोटी या लंबी अवधि व्यवहार्यता का समर्थन करने के लिए इस्तेमाल किया इंसुलिन युक्त एक अनुकूलित सीरम मुक्त पूरक है। - इसके तत्काल बाद एक गिलास नीचे थाली में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 20 मिलीग्राम / एमएल Fluo-2 के साथ मस्तिष्क टुकड़ा सेते हैं।
- कैल्शियम फ्लोरोफोरे Fluo-2 का इष्टतम लोड हो रहा है एकाग्रता का निर्धारण करने और एटीपी के साथ कैल्शियम डाई सेल विषाक्तता, चुनौती कोशिकाओं से बचने के लिए, और एटीपी के जवाब में समय के पाठ्यक्रम और कैल्शियम संकेतों के शिखर परिमाण निर्धारित करने से सेल व्यवहार्यता की जाँच करें।
- 488 एनएम और 515 एनएम, क्रमशः (मूवी 2) की उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ, 1 सेकंड (प्रति सेकंड 200 फ्रेम) की एक न्यूनतम के लिए 5 मिसे के एक पर कब्जा दर पर कैल्शियम दोलन के लिए वीडियो रिकॉर्ड।
- Autofluorescence या आंदोलन कलाकृतियों से Fluo-2 कैल्शियम संकेत भेद करने के लिए, 515 एनएम पर उत्सर्जित तीव्रता अलग से नजर रखी है कि सुनिश्चित करते हैं।
नोट: Fluo-2 intracellular कैल्शियम यों के लिए उपयुक्त कैल्शियम fluoremetric नहीं है। हालांकि, यह जैसे कैल्शियम दोलनों के रूप में तेजी से कैल्शियम परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक उत्कृष्ट गतिशील कैल्शियम डाई है। अधिक सटीक कैल्शियम मात्रा का ठहराव के लिए, Fura-2 की सिफारिश की है। हालांकि, Fura-2 के गतिशील परिवर्तन अपनी ratiometric द्वारा सीमित हैंडाई की प्रकृति। - सटीक मुक्त intracellular कैल्शियम मूल्यों की गणना करने के लिए निर्माता द्वारा प्रदान फार्मूले का पालन करें। उदाहरण [सीए 2 +] = कश्मीर डी × (आर - आर मिनट) / (आर अधिकतम - आर)। कश्मीर घ जारी किया कैल्शियम से डाई की हदबंदी लगातार कहां है, आर 488 पर मापा प्रतिदीप्ति है, और आर मिनट और आर अधिकतम न्यूनतम और अधिकतम आयन एकाग्रता 12 पर प्रतिदीप्ति अनुपात हैं।
5. immunofluorescence माइक्रोस्कोपी
- 4% paraformaldehyde (पीएफए) और 10 मिनट के लिए 2% सूक्रोज युक्त फॉस्फेट बफर खारा समाधान के साथ मस्तिष्क वर्गों को ठीक करें। वैकल्पिक रूप से, एक cryostat का उपयोग 50 मिमी वर्गों में 4% तो पीएफए और धारा के साथ पूरे मस्तिष्क को ठीक।
- 5 मिनट के लिए हर बार 1x पीबीएस के साथ ऊतक तीन बार धोएं।
- एक soluti के साथ मस्तिष्क टुकड़ा सेते5 मिनट के लिए 1X पीबीएस में 0.1% ट्राइटन एक्स के पर, फिर 5 मिनट के लिए हर बार 1x पीबीएस के साथ तीन बार कुल्ला।
- रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर कमरे के तापमान (आर टी) या कम एक घंटे के लिए 1x पीबीएस में 10% FBS के में 5000: माउस प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ मस्तिष्क टुकड़ा सेते हैं, 1 की एक कमजोर पड़ने पर इस्तेमाल किया एक ट्यूबिलिन, antiacetylated।
- 5 मिनट के लिए हर बार 1x पीबीएस के साथ ऊतक तीन बार धोएं।
- माध्यमिक एंटीबॉडी में मस्तिष्क टुकड़ा सेते हैं, 1 की एक कमजोर पड़ने पर fluorescein विरोधी माउस आईजीजी: आरटी पर 1 घंटे के लिए 1x पीबीएस समाधान में 500 में 10 में% FBS के।
- 5 मिनट के नाभिक (या डीएनए) 13 दाग के लिए 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) के साथ खंड counterstain एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे अवलोकन, इससे पहले। संभव न्यूनतम जोखिम समय के साथ वर्गों तुरंत photobleaching, छवि को कम से कम करने के लिए।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
लाइव माउस मस्तिष्क में ependymal सिलिया समारोह मापने
इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि माउस मस्तिष्क के रूप में अच्छी तरह से नजर रखने और सिलिया पिटाई आवृत्ति का अध्ययन करने से विच्छेदित ताजा ऊतक में ependymal सिलिया समारोह और संरचना पर नजर रखने के लिए किया जाता है। एक पूरा प्रयोग को पूरा करने के लिए पीछा चरणों का एक योजनाबद्ध फ़्लोचार्ट (चित्रा 1) में चित्रित कर रहे हैं। यह अत्यधिक प्रयोग के रूप में संभव के रूप में सक्रिय गतिशील सिलिया रखने के लिए एक छोटी समय सीमा के भीतर आयोजित किया जाता है की सिफारिश की है। एक प्रतिनिधि फिल्म समय चूक और ependymal कोशिकाओं और उनके गतिशील सिलिया की छवियों को भी दिखाया जाता है (1 मूवी और चित्रा 2A)। प्राप्त स्ट्रीम में डेटा विश्लेषण चलती सिलिया की पिटाई और कोण पैटर्न की गणना के द्वारा पूरा किया है। तीन प्रकार में विभाजित सिलिया के लिए मापदंड ependymal सिलिया की उपस्थिति आत्मविश्वास है तालिका 1 में प्रस्तुत कर रहे हैंनाभिक को दिखाने के लिए एक सिलिअरी मार्कर, acetylated-एक ट्यूबिलिन साथ rmed, और ependymal कोशिकाओं DAPI (डीएनए मार्कर) के साथ counterstained कर रहे हैं (चित्रा 2 बी)। कम से कम 22 स्वतंत्र प्रयोगों से मस्तिष्क पार्श्व वेंट्रिकल में ependymal कोशिकाओं की हमारी टिप्पणियों के आधार पर हम उनकी सिलिअरी पिटाई आवृत्ति के आधार पर तीन प्रकार में ependymal कोशिकाओं को वर्गीकृत करने में सक्षम थे। इसके अलावा, हम 0.25% एकाग्रता में इथेनॉल काफी उनके प्रकार (चित्रा 3) की परवाह किए बगैर सिलिया पिटाई आवृत्ति दमित कि प्रदर्शन किया। इससे भी महत्वपूर्ण बात, इन आंकड़ों हमारे पिछले निष्कर्ष 10 के साथ सामंजस्य में हैं।
Ependymal सिलिया से मापने कैल्शियम संकेतन
यह पहले से सिलिया के झुकने 14-16 संकेत एक पपनी पर निर्भर intracellular कैल्शियम गति प्रदान कर सकते हैं दिखाया गया है। इस तकनीक के शोधकर्ताओं की जांच करने और मस्तिष्क निलय के भीतर intracellular कैल्शियम संकेत को मापने के लिए अनुमति देता है
चित्रा 1:। Ependymal सिलिया इमेजिंग प्रोटोकॉल फ़्लोचार्ट Ependymal सिलिया इमेजिंग प्रोटोकॉल एक प्रयोग है, माउस brainextraction से शुरू सेक्शनिंग और छवि अधिग्रहण और विश्लेषण करने के लिए ऊतक तैयारी पूरी करने के लिए कदम दिखाता है। एक अनुमानित एक घंटे के समय कदम दर कदम प्रक्रिया के साथ प्रस्तुत किया है।
ई 2 "src =" / फ़ाइलें / ftp_upload / 52,853 / 52853fig2.jpg "/>
चित्रा 2:। मस्तिष्क निलय में Ependymal सिलिया स्थानीयकरण यहाँ दिखाया एक माउस मस्तिष्क के पार्श्व वेंट्रिकल से ependymal कोशिकाओं रहे हैं। (क) व्यक्तिगत ependymal कोशिकाओं (नीचे तीर) और सिलिया (ऊपर तीर) के डीआईसी छवियों दिखाए जाते हैं। (ख) एक मस्तिष्क अनुभाग का ओवरले छवि एक सिलिअरी मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग है, हरे (ऊपर तीर) में दिखाया गया है एक ट्यूबिलिन, acetylated, और नीले रंग के नीचे (तीर) में दिखाया गया है कि एक परमाणु / डीएनए मार्कर, DAPI के साथ counterstained । पैनल ए और बी अलग मस्तिष्क वर्गों का प्रतिनिधित्व करते हैं कि कृपया ध्यान दें।
चित्रा 3:। शराब और माउस मस्तिष्क पार्श्व वेंट्रिकल की ependymal कोशिकाओं के प्रकार के बीच आवृत्तियों की धड़कन सिलिया में मतभेद पूर्व vivo मस्तिष्क टुकड़ा ई ((नियंत्रण) के बिना या के साथ incubated किया गया थाthanol) 5 मिनट के लिए 0.25% शराब। एक तारक से संकेत के रूप नियंत्रण की तुलना में, शराब उपचार काफी सिलिया पिटाई आवृत्ति कम किया है। कम से कम 5-10 स्वतंत्र तैयारियों प्रत्येक ependymal सेल प्रकार और उपचार के समूह के लिए इस्तेमाल किया गया।
मूवी 1: प्रकार III ependymal कोशिकाओं में ependymal सिलिया की रिकॉर्डिंग यहाँ दिखाया मस्तिष्क की तीसरी वेंट्रिकल से तृतीय ependymal कोशिकाओं टाइप करने के लिए आवृत्ति और अद्वितीय कोण से हराकर विशेषता ependymal सिलिया की रिकॉर्डिंग कर रहे हैं।। यह आंकड़ा पहले से 10 सूचित किया गया है और अनुमति के साथ पुन: उपयोग किया गया था।
मूवी 2: ependymal कोशिकाओं में intracellular कैल्शियम दोलन यहाँ दिखाया मस्तिष्क के पार्श्व उपक्रम के एक वर्ग के माध्यम से ependymal कोशिकाओं के कैल्शियम दोलनों की रिकॉर्डिंग कर रहे हैं।37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए, 20 मिलीग्राम / एमएल कैल्शियम सूचक, fluo-2 के साथ मस्तिष्क टुकड़ा incubating के बाद tricle। मस्तिष्क खंड के कैल्शियम के स्तर का अध्ययन किया गया था और छद्म रंग। रंग पट्टी ependymal कोशिकाओं 'कैल्शियम स्तर इंगित करता है; जहां काले बैंगनी और लाल-पीला क्रमश: निम्न और उच्च कैल्शियम के स्तर का प्रतिनिधित्व करते हैं। प्रोटोकॉल पाठ में उल्लेख किया है और नियंत्रण और उपचार समूहों के बीच औसत रूप intracellular कैल्शियम मात्रा का ठहराव के लिए, ependymal सेल कैल्शियम, कई व्यक्ति ependymal कोशिकाओं से गणना की जाएगी। कैल्शियम दोलन की वीडियो क्रमशः 488 एनएम और 515 एनएम, की उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ प्रति सेकंड 200 तख्ते पर दर्ज किया गया था। यह आंकड़ा पहले से 10 सूचित किया गया है और अनुमति के साथ पुन: उपयोग किया गया था।
| Ependymal सेल प्रकार | Cilia पिटाई आवृत्ति | Cilia पिटाई कोण |
| प्रकार मैं | > 60 हर्ट्ज | <90 ° |
| प्रकार द्वितीय | 30-60 हर्ट्ज | 90-135 ° |
| प्रकार III | <30 हर्ट्ज | > 135 ° |
तालिका 1:। Ependymal सिलिया के प्रकार प्रकार मैं में ependymal सिलिया के वर्गीकरण, द्वितीय या तृतीय मुख्य रूप से पिटाई आवृत्ति पर और मस्तिष्क की तीसरी वेंट्रिकल की अलग क्षेत्रों के भीतर स्थित ependymal सिलिया के कोण की धड़कन आधारित था। इस डेटा के कुछ हिस्सों में पहले से सूचित किया गया है और अनुमति के साथ यहां पुन: उपयोग कर रहे थे।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
लाइव-इमेजिंग और मस्तिष्क निलय के भीतर ependymal सिलिया की एक तेजी से और संवेदनशील करीब अवलोकन प्रदान करता है कि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी दोनों के लिए माउस मस्तिष्क के ऊतकों की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल यहाँ है वर्णित है। इस तकनीक को केवल पार्श्व वेंट्रिकल तक ही सीमित नहीं है; यह अन्य मस्तिष्क निलय में सिलिया निरीक्षण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। इस इमेजिंग तकनीक एक पूर्व vivo सेटिंग में सिलिअरी पिटाई से सीएसएफ के आंदोलन के जैसा एक लाइव स्ट्रीम प्रदान करता है। इसके अलावा, यह सिलिया की दिशात्मक आंदोलन के विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है। यह मुख्य रूप से एक उच्च संकल्प डीआईसी और प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रणाली के उपयोग से मदद की है। इस प्रणाली का एक लाभ यह खुर्दबीन तापमान, आर्द्रता और सीओ 2 का स्तर का एक अच्छा विनियमन के लिए अनुमति देता है जो एक पर्यावरण कक्ष में संलग्न है। ये रहते इमेजिंग अनुभव जब प्रदर्शन कोशिकाओं और ऊतकों के अस्तित्व के लिए विचार किया जाना चाहिए कि बहुत महत्वपूर्ण मापदंडों हैंiments। इस प्रणाली को भी इस तरह के सिलिया आंदोलनों के रूप में गतिशील सेलुलर व्यवहार की इमेजिंग की सुविधा के लिए महत्वपूर्ण विशेषताएं हैं, जो सभी के लिए स्वत: XY और जेड मॉड्यूल के साथ-साथ एक डिजिटल कैमरा और तरंग दैर्ध्य फिल्टर स्विचर, से सुसज्जित है। माइक्रोस्कोप एक कंप्यूटर से जुड़ा है और उच्च गुणवत्ता के चित्र के अधिग्रहण सॉफ्टवेयर इमेजिंग द्वारा सुविधा है।
अलग प्रकार में ependymal कोशिकाओं को वर्गीकृत करने के लिए इस तकनीक का उपयोग ependymal सिलिया का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल मौजूदा / पिछले विधियों पर एक महत्वपूर्ण उन्नति प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, इस तरह के शराब के रूप में कुछ औषधीय या जहरीले एजेंटों के प्रभाव अन्यथा कम से कम या ependymal कोशिकाओं एक जनसंख्या 17 के रूप में माना जाता है कि अगर निरस्त माना जा सकता है। यह आवृत्तियों और कोण की धड़कन सिलिया की विशेषताओं ependymal सिलिया के इन तीन प्रकार के बीच में बहुत अलग हैं कि इस तथ्य के बावजूद, हम सिर्फ इन कोशिकाओं के शरीर क्रिया विज्ञान को समझने के लिए शुरू कर दिया है, कि मन में रखने के लिए महत्वपूर्ण है। अतइस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रक्रिया के रूप में ठीक से किया जाता है, तो हमारे पिछले काम के अनुसार, हमारे वर्गीकरण काफी मजबूत है।
अलग ependymal सिलिया की पहचान ependymal शरीर क्रिया विज्ञान की एक बुनियादी समझ हासिल करने के लिए मूल रूप से महत्वपूर्ण है। इस विधि के तीन अलग अलग प्रकार के (1 टेबल) में वर्गीकरण करने के लिए अग्रणी है, विशिष्ट और विशेष रूप से पिटाई आवृत्ति और कोण के संबंध में तीसरे निलय के भीतर तैनात ependymal कोशिकाओं के तीन अलग-अलग प्रकार के बीच भेद करने के लिए यह संभव बनाता है। आवृत्तियों की धड़कन सिलिया में मतभेद ependymal कोशिकाओं की या जानवर की उम्र में अंतर करने के लिए व्यवहार्यता में मतभेद के कारण नहीं कर रहे हैं, इसकी पुष्टि करने के लिए आदेश में यह सिफारिश की है कि न्यूरोनल ऊतक के लिए और कम से जुड़े होते हैं कि केवल बरकरार है और undetached ependymal स्ट्रिप्स या स्लाइस मोटी कम से कम 100 मिमी उपयोग किया जाता है। इसके अलावा, रोमक पिटाई आवृत्ति प्रत्येक ependymal अनुभाग के साथ विभिन्न स्थानों पर मापा जाना चाहिए। हम पहले से इस तकनीक का उपयोग कर उत्पन्न सिलिअरी हरा आवृत्ति डेटा 87 प्रयोगात्मक टिप्पणियों 10 के बीच लगातार प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हो गया है कि प्रदर्शन किया है। इसलिए, ependymal कोशिकाओं सही उनके सिलिअरी पिटाई के आधार पर वर्गीकृत किया जाता है। सिलिअरी पिटाई आवृत्ति कम करने के लिए जाना जाता है जो औषधीय एजेंटों का उपयोग करते समय इसके अलावा, सिलिया पिटाई आवृत्ति सैद्धांतिक रूप से उन औषधीय एजेंटों को निकालने के बाद सामान्य पिटाई आवृत्ति करने के लिए वापस आ जाना चाहिए।
इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम मस्तिष्क के ऊतकों और प्रयोग को पूरा करने के लिए आवश्यक समय से निपटने के लिए मुख्य रूप से संबंधित है। यह ependymal सिलिया की संरचना और समारोह को संरक्षित करने के साथ-साथ कमजोर ऊतक को आघात को कम करने के क्रम में धीरे मस्तिष्क के ऊतकों को संभालने के लिए आवश्यक है। अधिक महत्वपूर्ण है, और इस तकनीक की सफलता के लिए एक सीमित कारक हो सकता है जो मस्तिष्क के ऊतकों की गिरावट और मौत से बचने के लिए, यह अत्यधिक recommende हैइस तकनीक से संबंधित चरणों संभव के रूप में एक घंटे के करीब के रूप में प्रदर्शन कर रहे हैं कि डी। हालांकि, इस सीमा के इन विट्रो में या वैकल्पिक पोषक मीडिया के उपयोग के साथ गतिशील सिलिया के साथ संवर्धन और बढ़ती ependymal या समान प्रकार की कोशिकाओं के क्षेत्र में प्रगति के साथ भविष्य में दूर किया जा सकता है। ऐसे aCSF और मस्तिष्क के स्लाइस की ऊष्मायन के लिए है Earle लवण के रूप में वैकल्पिक पोषक मीडिया के उपयोग के साहित्य 5 में प्रदर्शन किया गया है। हालांकि, हमारे हाथ में है, DMEM / उच्च ग्लूकोज के उपयोग की वजह से एक संभावित ऊर्जा स्रोत के रूप में मध्यम में ग्लूकोज की उच्च राशि (4,500 मिलीग्राम / एमएल) की उपस्थिति के लिए संभवतः aCSF से ज्यादा फायदेमंद था। इस जीवित कोशिकाओं के एक प्रतिनिधि पर हस्ताक्षर के रूप में इस प्रकार, मुख्य कसौटी, ऊतक और इसलिए दृष्टिकोण की वैधता का आकलन है सिलिया पिटाई की व्यवहार्यता का आकलन किया।
Ependymal सिलिया के रहते इमेजिंग सिलिया सक्रियण के बहाव के संकेत दे रास्ते का विश्लेषण करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता हैजैसे कैल्शियम संकेतन और दोलनों के रूप में। उदाहरण के लिए, जी प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग, यह उस पर ध्यान दिए बिना ependymal सेल / सिलिया प्रकार का प्रदर्शन किया गया है, ependymal कोशिकाओं अद्वितीय कैल्शियम दोलन गुणों 10 की विशेषता है। सब सब में, इस प्रोटोकॉल बुनियादी वैज्ञानिक ज्ञान और नैदानिक अभ्यास दोनों के लिए प्रासंगिक है। बुनियादी विज्ञान के नजरिए से इस तकनीक ependymal सिलिया संरचना, समारोह और नीचे की ओर यंत्रवत संकेत दे रास्ते के कार्यात्मक और शारीरिक भूमिकाओं में से एक आकलन प्रदान करता है। नैदानिक अभ्यास के नजरिए से इस पद्धति ऐसी जलशीर्ष और शराब के दुरुपयोग के रूप में मस्तिष्क संबंधी बीमारियों के लिए एक नई चिकित्सकीय लक्ष्य के रूप में ependymal सिलिया लक्ष्य है कि दवाओं के लिए खोज के लिए प्रासंगिक है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/HIGH GLUCOSE | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-SP | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-2395 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Fluo-2 | TEF Labs | #0200 | |
| DMSO | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1500 | |
| Anti-acetylated a-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T7451 | clone 6-11B1 |
| FITC Anti-mouse antibody | Vector Labs | FI-2000 | |
| Cell Culture plate | VWR Vista Vision | 30-2041 | |
| Cover Slip (18 x 18) | VWR Vista Vision | 16004.326 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | Leica VT1200S | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM1860 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | Nikon TE2000 | 60X oil |
| Microscope cover glass 24 x 60 mm2 | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| DAPI filter cube | Chroma Technology |
References
- AbouAlaiwi, W. A., Lo, S. T., Nauli, S. M. Primary cilia: Highly sophisticated biological sensors. Sensors. 9 (9), 7003-7020 (2009).
- Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking kif3b motor protein. Cell. 95 (6), 829-837 (1998).
- Satir, P., Christensen, S. T. Overview of structure and function of mammalian cilia. Annual review of physiology. 69, 377-400 (2007).
- Delbigio, M. R. The ependyma - a protective barrier between brain and cerebrospinal-fluid. Glia. 14 (1), 1-13 (1995).
- Genzen, J. R., Platel, J. C., Rubio, M. E. Bordey A. Ependymal cells along the lateral ventricle express functional p2x(7) receptors. Purinergic signalling. 5 (3), 299-307 (2009).
- Appelbe, O. K., et al. Disruption of the mouse jhy gene causes abnormal ciliary microtubule patterning and juvenile hydrocephalus. Developmental biology. 382 (1), 172-185 (2013).
- Sawamoto, K., et al. New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain (New York, N.Y.). Science. 311 (5761), 629-632 (2006).
- Banizs, B., et al. Dysfunctional cilia lead to altered ependyma and choroid plexus function, and result in the formation of hydrocephalus. Development. 132 (23), 5329-5339 (2005).
- Kawanabe, Y., et al. Cilostazol prevents endothelin-induced smooth muscle constriction and proliferation. PloS one. 7 (9), e44476 (2012).
- Liu, T., Jin, X., Prasad, R. M., Sari, Y., Nauli, S. M. Three types of ependymal cells with intracellular calcium oscillation are characterized by distinct cilia beating properties. J Neurosci Res. 92 (9), 1199-1204 (2014).
- Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: Comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
- Nauli, S. M., Jin, X., AbouAlaiwi, W. A., El-Jouni, W., Su, X., Zhou, J. Non-motile primary cilia as fluid shear stress mechanosensors. Methods in enzymology. 525, 1-20 (2013).
- AbouAlaiwi, W. A., et al. Survivin-induced abnormal ploidy contributes to cystic kidney and aneurysm formation. Circulation. 129 (6), 660-672 (2014).
- AbouAlaiwi, W. A., et al. Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades. Circulation research. 104 (7), 860-869 (2009).
- Jin, X., et al. Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli. Cell Mol Life Sci. 71 (11), 2165-2178 (2014).
- Praetorius, H. A., Spring, K. R. Bending the mdck cell primary cilium increases intracellular calcium. The Journal of membrane biology. 184 (1), 71-79 (2001).
- Smith, C. M., Radhakrishnan, P., Sikand, K., O'Callaghan, C. The effect of ethanol and acetaldehyde on brain ependymal and respiratory ciliary beat frequency. Cilia. 2 (1), 5 (2013).
