Summary
Usando contraste de interferência diferencial (DIC) microscopia de alta resolução, uma observação ex vivo do espancamento de cílios ependymal móveis localizados dentro dos ventrículos do cérebro do rato é demonstrado pelo live-imagiologia. A técnica permite que uma gravação da frequência de batimento ciliar ângulo único e batendo bem como as suas propriedades de estimulação do cálcio intracelular oscilação.
Abstract
Células ependimárias Multiciliated alinhar os ventrículos no cérebro adulto. Função ou estrutura de cílios ependimária anormal está associado com várias deficiências neurológicas. A corrente ex vivo de imagens ao vivo da motilidade técnica cílios ependymal permite um estudo detalhado da dinâmica ciliares seguir várias etapas. Essas etapas incluem: ratos eutanásia com dióxido de carbono de acordo com protocolos de The University of Animal Care Institucional de Toledo e Comitê de Uso (IACUC); craniectomia seguido por remoção do cérebro e dissecção cérebro sagital com um vibratome ou lâmina afiada para obter secções muito finas através dos ventrículos laterais do cérebro, onde os cílios ependimária podem ser visualizadas. A incubação das fatias do cérebro de uma placa com fundo de vidro personalizado contendo meio de Eagle modificado (DMEM) / alta concentração de glicose de Dulbecco a 37 ° C na presença de 95% / 5% de O2 / CO2 mistura é essencial para manter o tecido vivo duranteo experimento. Um vídeo do espancamento cílios é então gravado utilizando um de alta resolução de contraste de interferência diferencial microscópio. O vídeo é então analisado quadro a quadro para calcular a freqüência de batimento ciliar. Isso permite a classificação distinta das células ependimárias em três categorias ou tipos com base na sua freqüência de batimento ciliar e ângulo. Além disso, esta técnica permite o uso de análise de imagem de fluorescência de alta velocidade para caracterizar as propriedades únicas de oscilação de cálcio intracelulares de células ependimais, bem como o efeito de agentes farmacológicos sobre as oscilações de cálcio e a frequência de batimento ciliar. Além disso, esta técnica é adequado para imagiologia de imunofluorescência para a estrutura ciliar e localização de proteínas ciliar estudos. Isto é particularmente importante em estudos de diagnóstico da doença e fenótipo. A principal limitação da técnica é atribuída à diminuição no movimento ciliar móveis vivo como o tecido cerebral começa a morrer.
Introduction
Os cílios são organelos à base de microtúbulos sensoriais que se estendem a partir da superfície da célula para o meio extracelular. Dependendo da sua organização de microtúbulos, cílios podem ser classificados em dois tipos - "9 + 0" ou "9 + 2". Funcionalmente, com base na sua motilidade, estes podem ser classificados como motilidade ou não-móveis cílios 1. Cílios é um termo comumente usado para designar "9 + 0" cílios não-móveis. Estes têm nove microtúbulos doublet paralelas (indicado por '9') e um par central de microtúbulos está ausente no interior da bainha central (indicado por "0"). No entanto, alguns "9 + 0" cílios, cílios, como nodal, que regulam lateralidade embrião são móveis 2. Por outro lado, os cílios móveis são caracterizados, para além das nove dupletos microtúbulos paralelas, por um par central adicional de dupletos microtúbulo e com proteínas do motor associado dineína para facilitar a motilidade. Além disso, alguns "92 "cílios, como cílios olfatórios são não-móveis 3. Células ependimárias que revestem os ventrículos cerebrais e no canal central da medula espinhal são caracterizados por cílios móveis que impulsionam o líquido cefalorraquidiano (LCR) ao longo dos ventrículos cerebrais 4.
O objetivo geral deste método é facilitar o estudo da dinâmica cílios e anormalidades estruturais móveis. Saúde e desenvolvimento do cérebro dependem fortemente a circulação eficiente de líquor dentro dos ventrículos cerebrais. Por exemplo, o fluxo de FCS normal e equilíbrio de fluidos necessitam de batimento normal e funcional cílios ependimária 5,6, o que por sua vez, desempenham papéis críticos na regulação do movimento direccional de células neuronais e migração de células estaminais 7. Como tal, a função dos cílios ependimária anormal ou estrutura pode conduzir ao fluxo CSF anormal, que está associada com hidrocefalia, uma condição médica na qual há uma acumulação anormal de CSF nos ventrículos do bchuva. Isto pode, por conseguinte, causar aumento da pressão intracraniana e alargamento progressivo da cabeça, convulsões, visão em túnel, e deficiência mental 8.
As vantagens desta técnica em relação aos métodos existentes é que ele permitiu, pela primeira vez para relatar três tipos de células ependymal distintas: I, II, e III, com base em sua única freqüência de batimento ciliar e batendo ângulo. Estas células ependimárias são localizados dentro de certas regiões nos ventrículos cerebrais. Além disso, os efeitos da idade e agentes farmacológicos, tais como álcool e cilostazol na alterando os tipos de células ependimais ou suas localizações pode ser demonstrada, o que não era possível antes de esta classificação de células ependimais. Cilostazole é um inibidor da fosfodiesterase-3, uma enzima que metaboliza cAMP em AMP e também regula o cálcio intracelular 9. Usando a análise de imagens de fluorescência de alta velocidade permite imagens e de quantificação do intracelular exclusivoPropriedades de oscilação de cálcio das células ependimárias. Por exemplo, tanto o álcool e o cilostazol alterou significativamente a frequência de batimento ciliar ependimal, bem como as oscilações de cálcio intracelulares propriedades, que por sua vez, pode conduzir a uma mudança no volume do fluido cerebrospinal de substituição pelos cílios ependimária 10. Em resumo, esta técnica foi a chave para proporcionar a primeira evidência de três tipos distintos de células ependimais com diferentes propriedades de oscilação de cálcio.
Na seção seguinte, um panorama detalhado passo-a-passo do procedimento é fornecida, prestando muita atenção a preparação do tecido e manuseio.
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Protocol
Os procedimentos para o uso de animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional (IACUC) da Universidade de Toledo, em conformidade com as orientações do Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional dos Institutos Nacionais de Saúde e do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
1. Extração de cérebro, Seccionamento e Preparação de tecidos
- Sacrifício de tipo selvagem estirpe de ratinhos C57BL / 6 por profundamente eutanásia com CO2 asfixia por 5 min. Assegurar morte por deslocamento cervical.
- Limpe a cabeça de rato com etanol 70%.
- Execute craniectomia usando tesouras e pinças esterilizadas por primeira puxando a pele fora, começando com o topo da cabeça para expor o crânio.
- Então, quando o crânio é exposta, remover o crânio por raspagem a peça-a-peça óssea, a partir do lado posterior e movendo-se para o lado anterior. Seja cauteloso para não destruir os ventrículos cerebrais.
- Recolher todo o cérebro.
- Inserir o cérebro em um prato de 100 milímetros de Petri contendo DMEM / alta de glucose suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e solução de penicilina / estreptomicina a 1% contendo 10.000 unidades / ml de penicilina e 10.000 ug / ml de estreptomicina e pré-aquecido a 37 ° C.
- Corte o cérebro sobre o plano sagital mediano à mão com uma lâmina afiada, e obter a primeira seção de 100-200 mm de cada metade usando um vibratome.
- Lavar o tecido cerebral com uma solução pré-aquecida até 37 ° C de fosfato tamponado salino (PBS 1x).
- Colocar imediatamente a secção do cérebro em meio DMEM / Glucose de alta pré-aquecido a 37 ° C.
2. Ao vivo de imagem Configuração e instalação
- Coloque as secções de tecido de cérebro em placas de cultura de 30 milímetros de fundo de vidro contendo 1 ml de meio DMEM / alta concentração de glicose. Ajuste ambiente câmara fechada do microscópio a 37 ° C, 95% / 5% de O2 / CO2 teor (Figura 1
- Usando uma lente de imersão em óleo objetivo 60X, recolher as células ependimárias / imagens cílios colocando primeiro uma gota de óleo na lente objetiva 60X e incidindo sobre as células com DIC normal transmitida luz.
- Em seguida, segue a direcção do movimento da bolha de DMEM como um guia para a localização dos cílios ependimária móveis como agressões ciliares criar uma espécie de movimento de espuma na área. Escolha uma área que contém as células saudáveis com cílios móveis no ventrículo lateral do cérebro usando o filtro DIC. Uma vez que o cílios ependimária são encontrados, ajustar a luz e concentrar para se obter uma imagem satisfatória.
- Defina os parâmetros de imagem ao vivo de acordo com um propósito específico usando software de imagem Metamorph. No presente demonstração, adquirir vinte imagens de quatro bits com o conjunto de binning câmera para 1 x 1 combinado com 60X objetiva e 5-10 tempo de exposição ms.
- Recolher as imagens DIC abrindo a abertura microscópio para um nível óptimo de forma a ter um mínimo de exposure tempo. Observe as imagens ao vivo da câmera para fornecer aquisição de imagem rápida e imediata, sem atraso. Calcula-se a velocidade de batimento ciliar com base no requisito de os tempos de exposição mínimos a obter suficiente contraste de imagem.
3. Visualização e Análise de Dados
- Calcular o número de batimentos ciliares através da contagem do número de pancadas em 1 min. Para fazer isso, diminuindo a velocidade de vídeo e contando o número de batidas, utilizando um contador de células ou ferramenta semelhante.
- Para calcular a frequência de espancamentos, multiplicar o tempo de exposição em que o vídeo é gravado pelo número de quadros ou imagens de lapso de tempo adquiridos para obter o número de segundos. (Exemplo: o tempo de exposição 5 ms 200 frames = 1.000 ms ou 1 seg).
- Calcular o número de pancadas em um segundo para obter a frequência que é expressa como o número de bater por uma seg. Fazer isso através da divisão do número de espancamentos cílios mais de um segundo de tempo entreval (Exemplo: cílios bate 50 vezes em um vídeo gravado em 200 frames tempo de exposição de 5 ms ou seja, 5 ms x 200 quadros = 1 seg; agora dividir 50 batimentos por 1 segundo = 50 Hz).
- Calcule o ângulo de batimento ciliar por avaliar o caminho percorrido pelos cílios ependymal durante tanto os cursos de potência e recuperação. Executar esta de acordo com um método previamente descrito, com modificações menores 11. O movimento preciso de cílios individual é observada durante o ciclo de batimento completa.
- Numa folha de etilo colocado sobre o monitor, desenhar uma linha horizontal ao longo da borda ependimal e uma linha vertical através da posição de linha média dos cílios no início do curso de expansão.
- Traçar a posição precisa do quadro a quadro cílio como ele se move para a frente durante o golpe de energia. De um modo semelhante, o movimento de traçar o cílios durante o curso de recuperação.
- Calcule o ângulo de batimento ciliar do desvio máximo do cílio da linha média durante tele curso de potência, bem como o curso de recuperação.
4. O cálcio gravação de sinal
- Depois de cortar o cérebro, brevemente enxaguado a fatia de cérebro com 1x PBS ou PBS de Dulbecco (pH 7,0). Preparar uma solução fresca de Fluo-2 para evitar a extinção de fluorescência e para obter uma boa relação sinal-para-ruído.
- Preparar uma solução-mãe mM de Fluo-2 solução em dimetilsulfóxido (DMSO), misturar e agitar com vortex a solução durante pelo menos 5 minutos para assegurar que Fluo-2 é homogeneamente dissolvido em DMSO.
- Dilui-se a solução stock de Fluo-2 em 500 ml de DMEM / alta de glucose suplementado com 2% B27 pré-aquecido a 37 ° C, a uma concentração final de 20 mg / ml.
NOTA: B-27 é um suplemento sem soro optimizado contendo vitamina A, antioxidantes e cocktail de insulina usado para suportar a viabilidade a curto ou a longo prazo do hipocampo e outros neurónios do SNC. - Incubar imediatamente a fatia de cérebro com 20 mg / ml de Fluo-2 durante 30 min a 37 ° C em uma placa com fundo de vidro.
- Para determinar a concentração de carga óptima de cálcio fluoróforo Fluo-2 e para evitar toxicidade celular corante de cálcio, as células com falta de ATP, e verificar a viabilidade celular através da determinação do decurso de tempo e magnitude do pico de sinais de cálcio em resposta a ATP.
- Gravar o vídeo de oscilação de cálcio a uma taxa de captura de 5 ms para um mínimo de 1 seg (200 quadros por segundo), com excitação e emissão de comprimentos de onda de 488 nm e 515 nm, respectivamente (Filme 2).
- Para distinguir o sinal de Fluo-2 cálcio de autofluorescência ou artefatos de movimento, assegurar que as intensidades emitidos em 515 nm é monitorizada separadamente.
NOTA: Fluo-2 não é o cálcio fluoremetric adequado para quantificar o cálcio intracelular. No entanto, é um corante de cálcio dinâmica excelente para detectar mudanças rápidas de cálcio, tais como oscilações de cálcio. Para a quantificação mais precisa de cálcio, recomenda Fura-2. No entanto, as alterações dinâmicas de Fura-2 estão limitadas pela sua raciométricanatureza do corante. - Siga as fórmulas fornecidas pelo fabricante para calcular exatamente os valores de cálcio intracelulares livres. Exemplo [Ca2 +] = K d × (R - R min) / (Rmax - R). Onde K d é a constante de dissociação do corante a partir do cálcio libertado, R é a fluorescência medida a 488, e Rmin e Rmax é a proporção de fluorescência no mínimo e máximo de concentração de iões 12.
5. imunofluorescência Microscopia
- Fixar as secções de cérebro com solução salina tamponada de fosfato contendo 4% de paraformaldeído (PFA) e sacarose a 2% durante 10 min. Em alternativa, fixar todo o cérebro com 4% PFA seção e, em seguida, em 50 seções mm utilizando um criostato.
- Lavar o tecido três vezes com 1x PBS durante 5 min de cada vez.
- Incubar a fatia do cérebro com um solutiem 0,1% de Triton-X em 1x PBS durante 5 min, em seguida, lavar três vezes com 1x PBS durante 5 min de cada vez.
- Incubar a fatia cerebral com o anticorpo primário do rato, um antiacetylated-tubulina, utilizado a uma diluição de 1: 5000 em FBS a 10% em 1x PBS, durante uma hora à temperatura ambiente (TA) ou durante a noite a 4 ° C.
- Lavar o tecido três vezes com 1x PBS durante 5 min de cada vez.
- Incubar a fatia de cérebro de anticorpo secundário, IgG anti-rato fluoresceína, a uma diluição de 1: 500 em FBS a 10% em solução de PBS 1x durante 1 h à TA.
- Antes de observação sob um microscópio de fluorescência, a secção de contraste com 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) durante 5 min para corar o núcleo (ou ADN) 13. Para minimizar fotobranqueamento, imagem as seções imediatamente com tempo mínimo de exposição possível.
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Representative Results
Medir a função dos cílios ependymal no cérebro do rato vivo
O método descrito neste protocolo é usado para monitorar a função dos cílios ependymal e estrutura no tecido fresco dissecado do cérebro do rato, bem como para monitorar e estudar freqüência de batimento ciliar. Os passos seguidos para alcançar uma experiência completa estão descritos em um fluxograma esquemático (Figura 1). É altamente recomendável que o experimento é conduzido dentro de um curto espaço de tempo, a fim de manter os cílios móveis tão ativo quanto possível. Um filme e imagens das células ependimárias e seus cílios móveis time-lapse representante também são mostrados (Filme 1 e Figura 2a). A análise dos dados no fluxo obtido é realizada através da contagem do padrão de batimento e ângulo do movimento ciliar. Os critérios para dividir os cílios em três tipos são apresentados na Tabela 1. A presença de cílios ependimária é confirmada com um marcador ciliar, acetilada-a-tubulina, e as células ependimais são contrastadas com DAPI (marcador de DNA) para mostrar o núcleo (Figura 2b). Com base em nossas observações de células ependimárias no ventrículo lateral do cérebro a partir de pelo menos 22 experimentos independentes, fomos capazes de classificar células ependimárias em três tipos com base na sua freqüência de batimento ciliar. Além disso, demonstrou-se que o etanol a uma concentração de 0,25% reprimida significativamente frequência de batimento ciliar, independentemente do seu tipo (Figura 3). Mais importante ainda, esses dados estão em consistência com os nossos achados anteriores 10.
Medindo a sinalização de cálcio pelos cílios ependimária
Foi previamente mostrado que a flexão dos cílios pode desencadear um cílio dependente de sinalização intracelular de cálcio 14-16. Esta técnica permite aos pesquisadores examinar e medir o sinal de cálcio intracelular dentro dos ventrículos cerebrais
Figura 1:. Ependimária fluxograma protocolo imagem cílios protocolo imagem cílios ependimárias ilustra passos para completar um experimento a partir do mouse brainextraction, corte e preparação do tecido para aquisição e análise de imagens. Uma linha de tempo aproximada uma hora é apresentada com um procedimento passo-a-passo.
e 2 "src =" / files / ftp_upload / 52853 / 52853fig2.jpg "/>
Figura 2:. Localização cílios ependimárias nos ventrículos cerebrais Mostrado aqui são células ependimárias do ventrículo lateral do cérebro do rato. (A) imagens DIC de células individuais ependimais (setas) e cílios inferiores (superiores setas) são mostrados. (B) uma imagem sobreposta de uma secção de cérebro é corado com o anticorpo contra um marcador ciliar, um acetilada-tubulina, mostrado em verde (setas em cima), e contra-coradas com um marcador nuclear / de ADN, DAPI, mostrado em azul (setas de baixo) . Por favor, note que os painéis a e b representam diferentes seções do cérebro.
Figura 3:. O álcool e as diferenças de frequências de batimento ciliar entre tipos de células ependimais do ventrículo lateral do cérebro do rato A fatia cerebral ex vivo foi incubada sem (controlo) ou com (EThanol) 0,25% de álcool, durante 5 min. Em comparação com o controlo, tratamento do álcool diminuiu significativamente frequência batimento ciliar, como indicado por um asterisco. Pelo menos 5-10 preparações independentes foram utilizados para cada tipo de tratamento e grupo de células ependimal.
Filme 1: Gravação de cílios ependymal no tipo III células ependimárias Mostrado aqui são gravações de cílios ependymal, caracterizadas por bater freqüência e ângulo exclusivo para tipo III células ependimárias do terceiro ventrículo do cérebro.. Esta figura foi previamente relatada 10 e foi reutilizado com permissão.
Filme 2: oscilação O cálcio intracelular em células ependimárias Mostrado aqui são gravações de oscilações de cálcio de células ependimárias através de uma seção de ven laterais do cérebro.tricle após incubação a fatia de cérebro com 20 mg / ml de indicador de cálcio, Fluo-2, durante 30 min a 37 ° C. Nível de cálcio da seção cérebro foi estudado e colorido pseudo-. A barra de cores indica o nível de cálcio das células ependimárias; onde o preto-roxo e vermelho-amarelo representam níveis baixos e altos de cálcio, respectivamente. Para a quantificação de cálcio intracelular, o cálcio celular ependimária serão calculados a partir de várias células ependimais individuais, tal como referido no texto do protocolo e uma média entre os grupos de controlo e de tratamento. O vídeo de oscilação de cálcio foi registada a 200 quadros por segundo com excitação e emissão de comprimentos de onda de 488 nm e 515 nm, respectivamente. Esta figura foi previamente relatada 10 e foi reutilizado com permissão.
| Tipo de célula ependimária | Freqüência de batimento dos cílios | Cilia ângulo espancamento |
| Tipo I | > 60 Hz | <90 ° |
| Tipo II | 30-60 Hz | 90-135 ° |
| Tipo III | <30 Hz | > 135 ° |
Tabela 1:. Tipos de cílios ependimária A classificação dos cílios ependimária em tipo I, II ou III foi baseada principalmente na frequência de batimento e batendo ângulo de cílios ependimária localizado dentro de regiões distintas do terceiro ventrículo do cérebro. Partes de estes dados têm sido relatados previamente e foram reutilizados aqui com permissão.
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Discussion
Descrito aqui é um protocolo para a preparação do tecido cerebral do rato, tanto para live-imagem e microscopia de fluorescência que fornece uma observação atenta rápido e sensível dos cílios ependymal dentro dos ventrículos cerebrais. Esta técnica não é limitada apenas ao ventrículo lateral; que poderia ser utilizado para observar o cílios nas outras ventrículos cerebrais. Esta técnica de imagem fornece uma transmissão ao vivo que se assemelha o movimento do CSF por batimento ciliar num ambiente ex vivo. Além disso, ele permite a análise do movimento direccional dos cílios. Isto é facilitado principalmente pelo uso de um sistema de imagem de fluorescência de alta resolução e DIC. Uma vantagem deste sistema é que o microscópio está encerrado numa câmara ambiental, o que permite uma boa regulação da temperatura, da humidade e níveis de CO 2. Estes são parâmetros muito importantes que devem ser considerados para a sobrevivência das células e tecidos ao realizar exper imagens ao vivoiments. O sistema também é equipado com XY e Z módulos automáticas, bem como um switcher câmera e comprimento de onda de filtro digital, todos os quais são características importantes para facilitar imagiologia de comportamentos celulares dinâmicos, como os movimentos ciliares. O microscópio é conectado a um computador e a aquisição de imagens de alta qualidade é facilitada pela imagem do software.
Usando esta técnica para classificar células ependimárias em tipos distintos oferece um avanço significativo em relação / métodos anteriores existentes utilizados para estudar os cílios ependymal. Por exemplo, o efeito de certos agentes farmacológicos ou tóxicos como o álcool poderia ser de outra forma minimizada ou anulada se as células ependimárias são considerados como uma população 17. É importante ter em mente que, apesar do fato de que as características dos cílios batendo freqüências e ângulos são muito diferentes entre esses três tipos de cílios ependymal, que estão apenas começando a entender a fisiologia dessas células. Conseqüentemente, De acordo com o nosso trabalho anterior, nossa classificação é robusto o suficiente, se o procedimento for realizado corretamente, conforme descrito neste protocolo.
Identificar cílios ependymal distinta é fundamentalmente importante para ganhar uma compreensão básica da fisiologia ependymal. Este método faz com que seja possível distinguir entre três tipos diferentes de células ependimais e exclusivamente especificamente posicionados dentro do terceiro ventrículo no que diz respeito à frequência de batimento e de ângulo, o que leva à classificação em três tipos diferentes (Tabela 1). A fim de confirmar que as diferenças de frequências de batimento ciliar não são devidas a diferenças na viabilidade das células ependimais ou a diferenças na idade do animal, recomenda-se que as tiras ependimais única intactas e undetached ou fatias que estão ligados ao tecido neuronal e no menos 100 mm de espessura são utilizados. Além disso, a freqüência de batimento ciliar deve ser medido em diferentes locais ao longo de cada seção ependymal. Temos demonstrado anteriormente que os dados de frequência do batimento ciliar gerados usando esta técnica tem sido consistentemente reprodutível entre 87 observações experimentais 10. Assim, as células ependimais são classificados com precisão, dependendo do seu batimento ciliar. Além disso, quando se utiliza agentes farmacológicos que são conhecidos por diminuir a frequência de batimento ciliar, a frequência de batimento ciliar, teoricamente, deveria retornar à frequência batimento normal após a remoção desses agentes farmacológicos.
Uma etapa fundamental neste protocolo está relacionado principalmente ao lidar com o tecido cerebral eo tempo necessário para completar a experiência. É imperativo para lidar com o tecido cerebral suavemente, a fim de preservar a estrutura e função dos cílios ependimal, bem como para reduzir o trauma para o tecido frágil. Mais importante, e para evitar a deterioração e a morte do tecido cerebral, o que poderia ser um factor limitante para o sucesso desta técnica, é altamente recd que os passos relacionados com esta técnica são realizados em tão perto quanto possível uma hora. No entanto, esta limitação pode ser superada no futuro, com os avanços da cultura e crescente ependymal ou tipos de células semelhantes com cílios móveis in vitro ou com o uso de mídia alternativa nutritiva. O uso de meios nutritivos alternativos tais como aCSF e sais de Earle para a incubação das fatias de cérebro foi demonstrada na literatura 5. No entanto, nas nossas mãos, o uso de DMEM / alta concentração de glicose foi mais benéfico do que aCSF possivelmente devido à presença de uma quantidade elevada de glucose (4500 mg / ml) no meio como uma fonte de energia potencial. Assim, o principal critério utilizado para avaliar a viabilidade do tecido e, por conseguinte, a validade da abordagem está a avaliar batimento ciliar, como este é um sinal representativo de células vivas.
Imagens ao vivo de cílios ependymal oferece uma ferramenta poderosa para analisar vias de sinalização a jusante de ativação cíliostal como a sinalização de cálcio e oscilações. Por exemplo, utilizando imagiologia de fluorescência vivo, demonstrou-se que, independentemente do tipo de célula / cílios ependimal, células ependimais são caracterizados por propriedades de cálcio única oscilação 10. Tudo somado, este protocolo é relevante tanto para o conhecimento científico básico e prática clínica. Do ponto de vista da ciência básica, esta técnica oferece uma avaliação dos papéis funcionais e fisiológicas da estrutura dos cílios ependymal, a função ea jusante vias de sinalização mecanicistas. Do ponto de vista clínico prática, este método é altamente relevante para a busca de drogas que alvejam cílios ependimárias como um novo alvo terapêutico para doenças neurológicas, como hidrocefalia e abuso de álcool.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/HIGH GLUCOSE | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-SP | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-2395 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Fluo-2 | TEF Labs | #0200 | |
| DMSO | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1500 | |
| Anti-acetylated a-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T7451 | clone 6-11B1 |
| FITC Anti-mouse antibody | Vector Labs | FI-2000 | |
| Cell Culture plate | VWR Vista Vision | 30-2041 | |
| Cover Slip (18 x 18) | VWR Vista Vision | 16004.326 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | Leica VT1200S | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM1860 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | Nikon TE2000 | 60X oil |
| Microscope cover glass 24 x 60 mm2 | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| DAPI filter cube | Chroma Technology |
References
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