Summary
Använda högupplösta differential interferens kontrast (DIC) mikroskopi, är en ex vivo observation av misshandeln av rörliga ependymala cilier ligger inom mus hjärnventriklarna framgår av levande avbildning. Tekniken möjliggör en inspelning av den unika ciliära slå frekvens och slå vinkel samt deras intracellulära kalcium svängning stimuleringsegenskaper.
Abstract
Multiciliated ependymalceller linje kamrarna i den vuxna hjärnan. Onormal funktion eller struktur ependymala cilier är förknippad med olika neurologiska underskott. Den nuvarande ex vivo levande avbildning av rörliga ependymala flimmerhår teknik möjliggör en detaljerad studie av ciliära dynamik efter flera steg. Dessa steg inkluderar: möss eutanasi med koldioxid enligt protokoll från The University of Toledos Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC); craniectomy följt av hjärnan bort och sagittal hjärnan dissektion med en vibratome eller vass kniv för att få mycket tunna snitt genom hjärnan laterala ventriklarna där ependymceller cilier kan visualiseras. Inkubation av hjärnans skivor i en anpassad glasbottnad platta innehållande Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) / hög-glukos vid 37 ° C i närvaro av 95% / 5% O2 / CO 2 blandning är viktigt att hålla vävnaden vid liv underexperimentet. En video av flimmerhåren slå sedan spelats in med en hög upplösning differential interferens kontrast mikroskop. Videon är sedan analyseras ruta för ruta för att beräkna strålkroppen slå frekvensen. Detta möjliggör exakt klassificering av de ependymala celler i tre kategorier eller typer baserat på deras ciliära stryk frekvens och vinkel. Dessutom tillåter denna teknik användningen av höghastighets fluorescens bildanalys för att karaktärisera de unika intracellulära kalciumsvängningsegenskaper ependymalceller samt effekten av farmakologiska medel på kalcium svängningar och strålkroppen slå frekvensen. Dessutom är denna teknik lämpar sig för immunofluorescens avbildning för ciliär struktur och ciliär proteinlokaliseringsstudier. Detta är särskilt viktigt vid diagnos och fenotyp sjukdomsstudier. Den största begränsningen av tekniken tillskrives minskningen i levande rörliga cilier rörelsen som hjärnvävnaden börjar dö.
Introduction
Cilier är sensoriska mikrotubuli baserade organeller som sträcker sig från cellytan till den extracellulära miljön. Beroende på deras mikrotubuli organisation kan cilier delas in i två typer - "9 + 0" eller "9 + 2". Funktionellt, baserat på deras rörlighet, dessa kan klassas som rörliga eller icke-rörliga flimmerhår 1. Primär cilier är en term som vanligen används för att beteckna "9 + 0" icke-rörliga cilier. Dessa har nio parallella doublet mikrotubuli (betecknas med "9") och en central par mikrotubuli är frånvarande i den centrala manteln (betecknas med "0"). Men några "9 + 0" cilier, såsom nodal cilier, som reglerar embryo lateralitet är rörliga 2. Å andra sidan, är motila cilier kännetecknas, förutom de nio parallella mikrotubuli dubletter, genom ytterligare ett centralt par av mikrotubuli dubletter och associerad med dynein motorproteiner för att underlätta motilitet. Dessutom är vissa "9+2 "Cilier såsom lukt cilier är icke-rörliga 3. Ependymala celler som bekläder ventriklar i hjärnan och den centrala kanalen av ryggmärgen kännetecknas av motila flimmerhår som driva cerebrospinalvätskan (CSF) längs hjärnans ventriklar 4.
Det övergripande målet med denna metod är att göra det lättare att studera rörliga flimmerhår dynamik och strukturella avvikelser. Hjärnans hälsa och utveckling är starkt beroende av en effektiv spridning av CSF i hjärnan kamrarna. Exempelvis normala CSF-flödet och vätskebalansen kräver normalt slå och funktionell ependymceller cilier 5,6, som i sin tur spelar kritiska roller i regleringen den riktade rörelsen av neuronala celler och stamcells migrering 7. Som sådan onormal ependymala cilier funktion eller struktur kan leda till onormal CSF flöde, som är associerad med hydrocefalus, ett medicinskt tillstånd i vilket det finns en onormal ansamling av CSF i ventriklar bregn. Detta kan alltså orsaka ökat intrakraniellt tryck och progressiv utvidgning av huvudet, kramper, tunnelseende och psykisk funktionsnedsättning 8.
Fördelarna med denna teknik jämfört med befintliga metoder är att det tillåtet för första gången att rapportera tre distinkta ependymal celltyper: I, II och III, baserat på deras unika ciliära slå frekvens och slå vinkel. Dessa ependymalceller är lokaliserade inom vissa regioner i hjärnan kamrarna. Dessutom kan effekterna av ålder och farmakologiska medel, såsom alkohol och cilostazol på ändring av ependymala celltyper eller deras lokaliseringar påvisas, vilket inte var möjligt innan denna klassificering av ependymalceller. Cilostazol är en hämmare av fosfodiesteras-3, ett enzym som metaboliserar cAMP till AMP och det reglerar också intracellulär kalcium 9. Använda hög hastighet fluorescens bildanalys kan avbildning och bestämning av den unika intracellulärakalcium svängnings egenskaperna hos ependymalceller. Till exempel, både alkohol och cilostazol ändras avsevärt ependymceller ciliära slå frekvens samt de intracellulära kalcium svängningar egenskaper, vilket i sin tur kan leda till en förändring i cerebrospinalvätskan volymersättning med ependymal flimmerhår 10. Sammanfattningsvis denna teknik var nyckeln till att ge det första beviset på tre distinkta typer av ependymala celler med olika kalciumsvängningsegenskaper.
I följande avsnitt är en detaljerad steg-för-steg-översikt över förfarandet, ägnar stor uppmärksamhet åt förberedelser och hantering vävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedurerna för användning av djur har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) The University of Toledo i enlighet med riktlinjerna i Institutional Animal Care och användning kommittén vid National Institutes of Health och Guide för skötsel och användning av försöksdjur.
1. Brain Utvinning, Sektione och Vävnadsberedning
- Offer vildtyp musstam C57BL / 6 genom djupt euthanizing med CO2-kvävning under 5 min. Försäkra döden genom halshuggning.
- Rengör musen huvudet med 70% etanol.
- Utför craniectomy använder steril sax och pincett genom att först dra skinnet av, börjar med hjässan för att exponera skallen.
- Sedan, när skallen exponeras, avlägsna skallen genom avskalning benet stycket-för-bit, med början från den bakre sidan och rör sig mot den främre sidan. Var försiktig med att inte förstöra hjärnan kamrarna.
- Samla hela hjärnan.
- Placera hjärnan i en 100 mm petriskål innehållande DMEM / hög-glukos kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin / streptomycin-lösning innehållande 10 tusen enheter / ml penicillin och 10 tusen xg / ml streptomycin och förvärmda till 37 ° C.
- Skiva hjärnan på median sagittalplan för hand med en vass kniv, och få den första 100-200 mm sektion från varje halv under användning av en vibratom.
- Skölj hjärnvävnaden med förvärmda 37 ° C fosfatbuffrad saltlösning (1 x PBS) -lösning.
- Placera omedelbart hjärnan avsnitt i DMEM / hög glukos media förvärmas till 37 ° C.
2. Live Imaging Konfigurering och inställning
- Placera vävnadssnitt hjärnan i 30 mm glasbottnade odlingsskålar innehållande 1 ml DMEM / hög-glukos media. Justera mikroskopets sluten kammarmiljön till 37 ° C, 95% / 5% O2 / CO-2-innehåll (figur 1
- Med hjälp av en 60X objektiv oljeimmersion lins, samla ependymalceller / flimmerhår bilder genom att först placera en oljedroppe på 60X objektiv och fokusera på cellerna med regelbundna DIC transmitterat ljus.
- Följ sedan riktning mot DMEM bubblan rörelsen som en guide till platsen för den rörliga ependymala cilier som ciliära misshandel skapar ett slags bubbla rörelse i området. Välj ett område som innehåller friska celler med rörliga flimmerhår i hjärnans laterala ventrikeln genom att använda DIC filtret. När ependymceller cilier finns, justera ljus och fokus för att få en tillfredsställande bild.
- Ställ in levande imaging parametrarna enligt ett särskilt ändamål använder metamorfa bildbehandlingsprogram. I det aktuella demonstrationen, förvärva tjugofyra-bitarsbilder med kameran binning inställd på 1 x 1 kombinerad med 60X objektiv och 5-10 ms exponeringstid.
- Samla DIC bilderna genom att öppna mikroskopet öppningen till en optimal nivå för att få ett minimum exposure tid. Observera levande bilder strömmen till kameran för att ge snabb och omedelbar bildtagning utan dröjsmål. Beräkna hastighet av cilier slå baserat på kravet på de minimala exponeringstider för att erhålla tillräcklig bildkontrast.
3. Datavisualisering och analys
- Beräkna antalet flimmerhår misshandel genom räkning av antalet av misshandel i en minut. Gör detta genom att minska hastigheten på video och räkna antalet slag med användning av en cellräknare eller liknande verktyg.
- För att beräkna frekvensen av misshandel, multiplicera exponeringstiden då videon är inspelad med antalet ramar eller tidsförlopp bilder som förvärvats för att få antalet sekunder. (Exempel: exponeringstid 5 ms 200 bildrutor = 1,000 ms eller 1 sek).
- Beräkna antalet misshandel på en sekund för att erhålla den frekvens, som är uttryckt som antalet slå per en sekund. Gör detta genom att dividera antalet flimmerhår misshandel under en sekund tid interval (Exempel: cilier slår 50 gånger i en 200 bildrutor video inspelad på exponeringstid på 5 ms dvs 5 ms x 200 ramar = 1 sekund, nu dela 50 slag med 1 sek = 50 Hz).
- Beräkna strålkroppen slå vinkel genom att utvärdera den väg som det ependymala flimmerhår under både ström- och återvinning stroke. Utför detta i enlighet med ett tidigare beskrivna metoden, med smärre ändringar 11. Den exakta rörelse enskilda cilier observeras under hela kryssen cykeln.
- På ett acetat ark placeras över bildskärmen, dra en horisontell linje utmed det ependymala kant och en vertikal linje genom mittlinjen position cilier vid början av arbetsslaget.
- Rita den exakta positionen för cilie bildruta för bildruta eftersom det rör sig framåt under arbetstakten. På ett liknande sätt, plotta rörelsen hos flimmerhåren under återhämtningstakten.
- Beräkna strålkroppen slå vinkel från den största avvikelsen i cilie från mittlinjen under than arbetsslag samt återvinning stroke.
4. Kalcium signalinspelnings
- Efter skivning i hjärnan, helt kort skölj hjärnan skiva med 1x PBS eller Dulbeccos PBS (pH 7,0). Framställ färsk Fluo-2 för att undvika fluorescensdämpning och för att erhålla god signal-brusförhållande.
- Bered en mM stamlösning av Fluo-2-lösning i dimetylsulfoxid (DMSO), blanda och vortexblanda lösningen under åtminstone 5 minuter för att säkerställa att Fluo-2 är homogent löst i DMSO.
- Späd Fluo-2 stamlösning i 500 ml DMEM / hög-glukos kompletterat med 2% B27 förvärmda till 37 ° C till en slutkoncentration av 20 mg / ml.
OBS: B-27 är en optimerad serumfria kosttillskott som innehåller vitamin A, antioxidant cocktail och insulin som används för att stödja kort eller lång sikt av hippocampus och andra CNS-neuroner. - Omedelbart inkubera hjärnan skiva med 20 mg / ml Fluo-2 under 30 min vid 37 ° C i en glasbottenplatta.
- För att bestämma den optimala lastnings koncentrationen av kalcium fluorofor Fluo-2 och för att undvika celltoxicitet kalciumfärgämne, utmaning celler med ATP, och kontrollera cellviabiliteten genom att bestämma tidsförloppet och toppmagnitud av kalciumsignaler i beroende av ATP.
- Spela in video för kalcium svängning vid en infångningshastighet av 5 ms under minst en sekund (200 bilder per sekund), med excitations- och emissionsvåglängder av 488 nm och 515 nm, respektive (film 2).
- För att skilja kalciumsignal från autofluorescens eller rörelse artefakter i Fluo-2, se till att de stödnivåer som avges vid 515 nm övervakas separat.
OBS: Fluo-2 är inte den kalcium fluoremetric lämpligt att kvantifiera intracellulärt kalcium. Men det är ett utmärkt dynamisk kalcium färgämne för att detektera snabb kalcium förändringar, såsom kalcium svängningar. För mer exakt kalcium kvantifiering är Fura-2 rekommenderas. Emellertid är de dynamiska förändringar av Fura-2 begränsad genom dess ratiometrisknaturen hos färgämnet. - Följ formlerna som tillhandahålls av tillverkaren för att beräkna de exakta fria intracellulära kalciumvärden. Exempel [Ca2 +] = Kd × (R - R min) / (R max - R). Där Kd är dissociationskonstanten av färgämnet från det frisatta kalcium, R är den uppmätta fluorescensen vid 488, och Rmin och Rmax är fluorescens mått vid minimal och maximal jonkoncentration 12.
5. immunofluorescensmikroskopi
- Fäst hjärnsektioner med fosfatbuffrad saltlösning innehållande 4% paraformaldehyd (PFA) och 2% sackaros i 10 min. Alternativt, fixa hela hjärnan med 4% PFA och sedan avsnittet i 50 mm sektioner med hjälp av en kryostat.
- Tvätta vävnaden tre gånger med 1 x PBS under 5 minuter varje gång.
- Inkubera hjärnan skiva med en solutipå av 0,1% Triton-X i 1x PBS i 5 minuter, skölj sedan tre gånger med 1 x PBS under 5 minuter varje gång.
- Inkubera hjärnan skiva med mus primär antikropp, antiacetylated en-tubulin, användes vid en utspädning av 1: 5000 i 10% FBS i 1 x PBS under en timme vid rumstemperatur (RT) eller över natten vid 4 ° C.
- Tvätta vävnaden tre gånger med 1 x PBS under 5 minuter varje gång.
- Inkubera hjärnan skiva i sekundär antikropp, fluorescein-anti-mus IgG vid en utspädning av 1: 500 i 10% FBS i 1 x PBS-lösning under 1 h vid RT.
- Innan observation under ett fluorescensmikroskop, motfärg sektionen med 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) under 5 min för att färga kärnan (eller DNA) 13. För att minimera fotoblekning, avbildar sektionerna omedelbart med minimal exponeringstid möjlig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mätning ependymal flimmerhår funktion i levande mushjärna
Den metod som beskrivs i detta protokoll används för att övervaka ependymal flimmerhår funktion och struktur i den friska vävnaden dissekeras från mushjärna samt att övervaka och studera flimmerhår slå frekvens. Stegen följas för att åstadkomma en fullständig experiment visas i ett schematiskt flödesschema (Figur 1). Det rekommenderas starkt att försöket genomförs inom en kort tidsperiod för att hålla den rörliga flimmerhåren så aktiv som möjligt. Ett representativt time-lapse film och bilder av ependymalceller och deras rörliga cilier visas också (Film 1 och figur 2a). Dataanalys i den erhållna strömmen åstadkoms genom att räkna misshandeln och vinkel mönster av den rörliga cilier. Kriterierna för att dividera cilier i tre typer presenteras i Tabell 1. Förekomsten av ependymala cilier är konrmed med en ciliär markör, acetylerad-a-tubulin, och de ependymala cellerna motfärgades med DAPI (DNA-markör) för att visa kärnan (figur 2b). Baserat på våra observationer av ependymala celler i hjärnan laterala ventrikeln från minst 22 oberoende experiment, kunde vi klassificera ependymalceller i tre typer baserat på deras ciliära stryk frekvens. Dessutom visade vi att etanol vid 0,25% koncentration tryckt signifikant cilier slå frekvens oberoende av deras typ (fig 3). Ännu viktigare, dessa uppgifter är i konsistens med våra tidigare fynd 10.
Mätning kalciumsignalering genom ependymala cilier
Det har tidigare visats att böjning av cilier kan utlösa en cilie beroende intracellulärt kalcium signalering 14-16. Denna teknik gör det möjligt för forskare att undersöka och mäta den intracellulära kalciumsignalen i hjärnan kamrarna
Figur 1:. Ependymala cilier bildprotokoll flödesschema ependymala cilier avbildning protokollet visar steg för att slutföra ett experiment med utgångspunkt från mus brainextraction, sektionering och vävnadspreparat för bildtagning och analys. En ungefärlig en timmes tidslinje presenteras med steg-för-steg.
e 2 "src =" / filer / ftp_upload / 52853 / 52853fig2.jpg "/>
Figur 2:. Ependymala flimmerhår lokalisering i hjärnventriklarna Här visas ependymalceller från den laterala ventrikeln av en mushjärna. (A) DIC bilder av enskilda ependymalceller (botten pilar) och flimmerhår (bästa pilar) visas. (B) En överlagring bild av en hjärnsektion färgas med antikroppar mot en ciliär markör, acetylerade a-tubulin, som visas i grönt (överst pilar) och motfärgades med en nukleär / DNA-markör, DAPI, som visas i blått (botten pilar) . Observera att panelerna a och b representerar olika hjärnsektioner.
Figur 3:. Alkohol och skillnader i cilier slå frekvenser bland typer av ependymala celler i mushjärna laterala ventrikeln Den ex vivo hjärna skiva inkuberades utan (kontroll) eller med (Ethanol) 0,25% alkohol under 5 min. Jämfört med kontroll, alkoholbehandling signifikant minskade cilier slå frekvens, såsom anges med en asterisk. Minst 5-10 oberoende preparat användes för varje ependymal celltyp och behandlingsgrupp.
Film 1: Registrering av ependymala flimmerhår i typ III ependymalceller Här visas inspelningar av ependymal cilier, som kännetecknas av att slå frekvens och vinkel unika för typ III ependymalceller från hjärnans tredje ventrikel.. Denna siffra har tidigare rapporterats 10 och används med tillstånd.
Film 2: Intracellulär kalcium svängning i ependymalceller Här visas inspelningar av kalcium svängningar av ependymalceller genom en del av hjärnans sido ven.tricle efter inkubering av hjärnan skiva med 20 mg / ml indikator kalcium, Fluo-2, under 30 min vid 37 ° C. Hjärnan sektionens kalciumnivå studerades och pseudo-färgade. Den färgfältet anger ependymalceller "kalciumnivå; där svart-lila och rött-gult representerar låga och höga kalciumnivåer, respektive. För intracellulär kalcium kvantifiering kommer ependymal cell kalcium beräknas från flera enskilda ependymalceller, som nämns i protokollet text och i genomsnitt mellan kontroll- och behandlingsgrupperna. Videon av kalcium svängning registrerades vid 200 bildrutor per sekund med excitations- och emissionsvåglängder av 488 nm och 515 nm, respektive. Denna siffra har tidigare rapporterats 10 och används med tillstånd.
| Ependymala celltyp | Cilier slå frekvens | Cilier malningsvinkel |
| Typ I | > 60 Hz | <90 ° |
| Typ II | 30-60 Hz | 90-135 ° |
| Typ III | <30 Hz | > 135 ° |
Tabell 1:. Typer av ependymala cilier Klassificeringen av ependymala cilier i typ I, II eller III bygger främst på malnings frekvens och slå vinkel ependymala cilier belägen inom distinkta områden av hjärnans tredje ventrikel. Delar av dessa data har tidigare rapporterats och återanvändes här med tillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrivs här är ett protokoll för framställning av musen hjärnvävnad för både live-imaging och fluorescensmikroskopi som ger en snabb och känslig noggrann observation av ependymala flimmerhår i hjärnan kamrarna. Denna teknik är inte begränsad till endast den laterala ventrikeln; det skulle kunna användas för att observera cilier i andra hjärn ventriklar. Denna bildteknik ger en live stream som liknar rörelse CSF genom ciliär stryk i en ex vivo inställning. Dessutom möjliggör den analys av riktnings förflyttning av cilier. Detta är främst underlättas genom användning av en hög upplösning DIC och fluorescens avbildning systemet. En fördel med detta system är att mikroskopet är innesluten i en miljökammare, som möjliggör en fin reglering av temperatur, fuktighet och koldioxid två nivåer. Dessa är mycket kritiska parametrar som bör övervägas för överlevnaden av celler och vävnader när uppträder live imaging expertisiments. Systemet är även utrustad med automatisk XY och Z moduler samt en digitalkamera och våglängdsfilter switcher, som alla är viktiga funktioner för att underlätta avbildning av dynamiska cellulära beteenden såsom cilier rörelser. Mikroskopet är ansluten till en dator och förvärvet av högkvalitativa bilder underlättas genom avbildning programvara.
Med hjälp av denna teknik för att klassificera ependymalceller i olika typer erbjuder ett betydande framsteg jämfört med existerande / tidigare metoder som används för att studera ependymal cilier. Till exempel kan effekten av vissa farmakologiska eller toxiska medel såsom alkohol på annat sätt minimeras eller upphävs om ependymalceller betraktas som en population 17. Det är viktigt att komma ihåg att trots att egenskaperna hos cilier slå frekvenser och vinklar är mycket olika bland dessa tre typer av ependymceller cilier, har vi precis börjat att förstå fysiologi av dessa celler. Därför, Enligt vårt tidigare arbete, är vår klassificering tillräckligt robust om proceduren utförs korrekt som beskrivs i detta protokoll.
Identifiera distinkt ependymal cilier är fundamentalt viktigt att få en grundläggande förståelse för ependymala fysiologi. Denna metod gör det möjligt att skilja mellan tre olika typer av ependymalceller unikt och speciellt positionerade i tredje ventrikeln när det gäller att slå frekvens och vinkel, vilket leder till indelning i tre olika typer (tabell 1). För att bekräfta att skillnaderna i cilier slår frekvenser inte beror på skillnader i livskraften hos de ependymalceller eller skillnader i djur ålder, rekommenderas att endast intakta och undetached ependymala remsor eller skivor som är anslutna till neuronal vävnad och minst 100 mm tjockt användes. Dessutom bör ciliära malnings frekvens mätas vid olika ställen längs varje ependymala sektion. Vi har tidigare visat att ciliernas slagfrekvens data som genereras med hjälp av denna teknik har varit genomgående reproducerbar bland 87 experimentella observationer 10. Därför är ependymalceller exakt klassificeras beroende på deras ciliary stryk. Dessutom, vid användning av farmakologiska medel som är kända för att minska ciliära malnings frekvens, cilier slå frekvensen bör teoretiskt återgå till normal malningsfrekvens efter avlägsnande av dessa farmakologiska medel.
Ett kritiskt steg i detta protokoll är främst hänförlig till hantering av hjärnvävnaden och den tid som behövs för att slutföra experimentet. Det är absolut nödvändigt att hantera hjärnvävnaden försiktigt för att bevara strukturen och funktionen av ependymala cilier liksom för att minska skada på ömtålig vävnad. Viktigare, och för att undvika försämring och död av hjärnvävnaden, vilket skulle kunna vara en begränsande faktor för att lyckas med denna teknik är det mycket recommended att de åtgärder som rör denna teknik utförs i så nära till en timme som möjligt. Emellertid skulle denna begränsning övervinnas i framtiden med framstegen inom odling och växande ependymal eller liknande celltyper med rörlig cilier in vitro eller med hjälp av alternativa närings medier. Användning av alternativa näringsmedia såsom aCSF och Earles salter för inkubation av hjärnan skivor har visats i litteraturen 5. Men i våra händer, var användningen av DMEM / hög glukos mer fördelaktigt än aCSF möjligen på grund av närvaron av höga halter av glukos (4.500 mg / ml) i mediet som en potentiell energikälla. Således använde viktigaste kriteriet för att bedöma lönsamheten av vävnaden och därmed giltigheten av tillvägagångssättet är att bedöma cilier stryk, eftersom detta är en representativ tecken på levande celler.
Live avbildning av ependymala cilier erbjuder ett kraftfullt verktyg för att analysera nedströms signalvägar av cilier aktiveringsåsom kalciumsignalering och svängningar. Till exempel, genom att använda levande fluorescens avbildning, har det visats att oberoende av ependymala celler / flimmerhår typ är ependymalceller kännetecknas av unik kalcium svängningsegenskaper 10. Allt som allt är detta protokoll som är relevanta för både grundläggande vetenskaplig kunskap och klinisk praxis. Från grundvetenskapligt perspektiv, erbjuder denna teknik en bedömning av de funktionella och fysiologiska roller ependymceller cilier struktur, funktion och nedströms mekanistiska signalvägar. Ur klinisk praxis perspektiv, är denna metod mycket relevant för sökandet efter läkemedel som riktar ependymala cilier som ett nytt terapeutiskt mål för neurologiska sjukdomar såsom hydrocefalus och alkoholmissbruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/HIGH GLUCOSE | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-SP | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-2395 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Fluo-2 | TEF Labs | #0200 | |
| DMSO | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1500 | |
| Anti-acetylated a-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T7451 | clone 6-11B1 |
| FITC Anti-mouse antibody | Vector Labs | FI-2000 | |
| Cell Culture plate | VWR Vista Vision | 30-2041 | |
| Cover Slip (18 x 18) | VWR Vista Vision | 16004.326 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | Leica VT1200S | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM1860 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | Nikon TE2000 | 60X oil |
| Microscope cover glass 24 x 60 mm2 | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| DAPI filter cube | Chroma Technology |
References
- AbouAlaiwi, W. A., Lo, S. T., Nauli, S. M. Primary cilia: Highly sophisticated biological sensors. Sensors. 9 (9), 7003-7020 (2009).
- Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking kif3b motor protein. Cell. 95 (6), 829-837 (1998).
- Satir, P., Christensen, S. T. Overview of structure and function of mammalian cilia. Annual review of physiology. 69, 377-400 (2007).
- Delbigio, M. R. The ependyma - a protective barrier between brain and cerebrospinal-fluid. Glia. 14 (1), 1-13 (1995).
- Genzen, J. R., Platel, J. C., Rubio, M. E. Bordey A. Ependymal cells along the lateral ventricle express functional p2x(7) receptors. Purinergic signalling. 5 (3), 299-307 (2009).
- Appelbe, O. K., et al. Disruption of the mouse jhy gene causes abnormal ciliary microtubule patterning and juvenile hydrocephalus. Developmental biology. 382 (1), 172-185 (2013).
- Sawamoto, K., et al. New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain (New York, N.Y.). Science. 311 (5761), 629-632 (2006).
- Banizs, B., et al. Dysfunctional cilia lead to altered ependyma and choroid plexus function, and result in the formation of hydrocephalus. Development. 132 (23), 5329-5339 (2005).
- Kawanabe, Y., et al. Cilostazol prevents endothelin-induced smooth muscle constriction and proliferation. PloS one. 7 (9), e44476 (2012).
- Liu, T., Jin, X., Prasad, R. M., Sari, Y., Nauli, S. M. Three types of ependymal cells with intracellular calcium oscillation are characterized by distinct cilia beating properties. J Neurosci Res. 92 (9), 1199-1204 (2014).
- Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: Comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
- Nauli, S. M., Jin, X., AbouAlaiwi, W. A., El-Jouni, W., Su, X., Zhou, J. Non-motile primary cilia as fluid shear stress mechanosensors. Methods in enzymology. 525, 1-20 (2013).
- AbouAlaiwi, W. A., et al. Survivin-induced abnormal ploidy contributes to cystic kidney and aneurysm formation. Circulation. 129 (6), 660-672 (2014).
- AbouAlaiwi, W. A., et al. Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades. Circulation research. 104 (7), 860-869 (2009).
- Jin, X., et al. Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli. Cell Mol Life Sci. 71 (11), 2165-2178 (2014).
- Praetorius, H. A., Spring, K. R. Bending the mdck cell primary cilium increases intracellular calcium. The Journal of membrane biology. 184 (1), 71-79 (2001).
- Smith, C. M., Radhakrishnan, P., Sikand, K., O'Callaghan, C. The effect of ethanol and acetaldehyde on brain ependymal and respiratory ciliary beat frequency. Cilia. 2 (1), 5 (2013).
