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Immunology and Infection

मानव मातृ-भ्रूण इंटरफ़ेस से leukocytes की अलगाव

Published: May 21, 2015 doi: 10.3791/52863
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4, 1,5, 1,5,6
1Perinatology Research Branch, NICHD/NIH/DHHS, 2Department of Obstetrics and Gynecology, University of Michigan, 3Department of Epidemiology and Biostatistics, Michigan State University, 4Department of Molecular Obstetrics and Genetics, Wayne State University, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Wayne State University School of Medicine, 6Department of Immunology and Microbiology, Wayne State University School of Medicine

Abstract

गर्भावस्था प्रजनन ऊतकों में और मातृ-भ्रूण इंटरफेस में ल्यूकोसाइट्स (पत्या basalis और पत्या parietalis) की घुसपैठ की विशेषता है। इस इंटरफ़ेस मातृ एवं भ्रूण के ऊतकों के बीच संपर्क के संरचनात्मक साइट है; इसलिए, यह गर्भावस्था के दौरान कार्रवाई की एक प्रतिरक्षाविज्ञानी साइट है। मातृ-भ्रूण इंटरफेस में घुसपैठ ल्यूकोसाइट्स प्रसव के एक केंद्रीय आरोपण में भूमिका, गर्भावस्था के रखरखाव, और समय खेलते हैं। इसलिए, इन leukocytes के प्ररूपी और कार्यात्मक अभिलक्षण गर्भावस्था से जुड़ी समस्याओं के लिए नेतृत्व कि तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा। कई प्रोटोकॉल पत्या basalis और पत्या parietalis से ल्यूकोसाइट्स घुसपैठ को अलग करने के क्रम में वर्णित किया गया है; हालांकि, ऊष्मायन के अभिकर्मकों, एंजाइमों, और कई बार में निरंतरता की कमी के कारण यह मुश्किल है कि इन परिणामों की तुलना करने के लिए बनाता है। यहाँ बताया कोमल यांत्रिक और enzymatic जे के प्रयोग को जोड़ती है कि एक उपन्यास दृष्टिकोण हैociation तकनीक मातृ-भ्रूण इंटरफेस में मानव ऊतकों से अलग ल्यूकोसाइट्स में बाह्य और intracellular मार्कर की व्यवहार्यता और अखंडता की रक्षा करने के लिए। एक तरफ immunophenotyping, सेल संस्कृति, और सेल छँटाई से, इस प्रोटोकॉल के भविष्य के अनुप्रयोगों के कई और विविध हैं। इस प्रोटोकॉल के बाद, अलग ल्यूकोसाइट्स डीएनए इन विट्रो ल्युकोसैट कार्यक्षमता (यानी, phagocytosis, cytotoxicity, टी-सेल प्रसार, और plasticity, आदि) में मेथिलिकरण, लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति, और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है मातृ-भ्रूण इंटरफेस में। इसके अतिरिक्त, वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग, इस प्रयोगशाला मातृ-भ्रूण इंटरफेस में नए और दुर्लभ ल्यूकोसाइट्स वर्णन करने में सक्षम हो गया है।

Introduction

गर्भावस्था के तीन अलग प्रतिरक्षात्मक चरणों की विशेषता है: 1) आरोपण और एक समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रिया से जुड़े जल्दी गर्भनाल (यानी, आरोपण 'एक खुला घाव' जैसा दिखता है); 2) दूसरी तिमाही और प्रतिरक्षा homeostasis को मातृ-भ्रूण इंटरफेस में एक मुख्य रूप से विरोधी भड़काऊ राज्य के माध्यम से हासिल की है जब गर्भावस्था की तीसरी तिमाही की सबसे; और 3) प्रसव, एक समर्थक भड़काऊ राज्य 1-7। इम्यून कोशिकाओं को मातृ-भ्रूण इंटरफेस में भड़काऊ प्रतिक्रिया के नियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जहां उनकी बहुतायत और गर्भावस्था 6-9 भर स्थानीयकरण बदल जाते हैं।

इंसानों में, मातृ-भ्रूण इंटरफ़ेस मातृ (पत्या) और भ्रूण (जरायु या ट्रोफोब्लास्ट) ऊतकों के बीच सीधे संपर्क के एक क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है। 1) पत्या लाइनों गर्भाशय गुहा नाल द्वारा कवर नहीं है कि parietalis और मुक़ाबला में है: यह इंटरफ़ेस शामिलजरायु laeve करने के लिए; और 2) यह मध्य trophoblasts 10 (चित्रा 1) द्वारा आक्रमण किया जहां नाल के बेसल थाली में स्थित पत्या basalis। संपर्क के इन क्षेत्रों की अंतरंगता मातृ प्रतिरक्षा प्रणाली को 11-13 भ्रूण प्रतिजनी लोगों तक पहुंचाने के लिए शर्तों बनाता है। आश्चर्य नहीं कि ल्यूकोसाइट्स ठेठ स्ट्रोमल प्रकार की कोशिकाओं और ग्रंथियों के कोशिकाओं 8,14,16 के अलावा decidual कोशिकाओं 8,9,14,15 का 30-40% तक शामिल हैं। मातृ-भ्रूण इंटरफेस में leukocytes की भूमिका ट्रोफोब्लास्ट आक्रमण 17 की सीमा, सर्पिल धमनियों 18,19 के पुनर्गठन, मातृ सहिष्णुता 12,20 के रखरखाव, और श्रम 21-26 की दीक्षा भी शामिल है कि कई प्रक्रियाओं शामिल हैं। अनुकूली और IE, टी कोशिकाओं, मैक्रोफेज, न्यूट्रोफिल, बी कोशिकाओं, वृक्ष के समान कोशिकाओं, और एन.के. कोशिकाओं, decidual ऊतकों में पहचान की गई है प्रतिरक्षा प्रणाली, के जन्मजात अंग है, और उनके दोनों की Leukocytesअनुपात और सक्रियण स्थिति हमल 6-10,12,14,24,27-30 भर spatially और अस्थायी भिन्न करने के लिए दिखाया गया है। ल्युकोसैट आबादी और / या समारोह में perturbations सहज गर्भपात 31 प्राक्गर्भाक्षेपक 32, अंतर्गर्भाशयी विकास प्रतिबंध 32,33, और अपरिपक्व श्रम 7,24 के साथ जुड़े रहे हैं। इसलिए, मानव मातृ-भ्रूण इंटरफेस में प्ररूपी विशेषताओं और leukocytes की कार्यक्षमता का अध्ययन गर्भावस्था के विकारों में dysregulated प्रतिरक्षात्मक रास्ते की व्याख्या की सुविधा होगी।

एकाधिक मापदंडों एक साथ 34-36 के मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है कि प्रवाह cytometry है phenotype और leukocytes के कार्यात्मक संपत्तियों का निर्धारण किया सबसे शक्तिशाली उपकरणों में से एक, प्रौद्योगिकी। फ्लो द्वारा ल्यूकोसाइट्स का विश्लेषण करने के लिए, एक एकल कोशिका निलंबन में leukocytes के अलगाव की आवश्यकता है। इसलिए, एक विधि लियू घुसपैठ अलग करने के लिएमातृ-भ्रूण इंटरफ़ेस से kocytes उनके प्ररूपी और कार्यात्मक गुणों का अध्ययन करने की जरूरत है।

कई तरीकों मानव मातृ-भ्रूण इंटरफ़ेस 10,14,25,27,37-39 से ल्यूकोसाइट्स अलग करने के लिए वर्णित किया गया है। कुछ यांत्रिक disaggregation 10,25,27,38 लागू होते हैं, दूसरों के ऊतक हदबंदी के लिए enzymatic पाचन 37,40 का उपयोग करें। मैकेनिकल disaggregation एक कम पैदावार और कम व्यवहार्यता 41, और व्यवहार्यता और कोशिका की सतह मार्कर प्रतिधारण 42 प्रभावित कर सकते हैं एंजाइमी हदबंदी पैदा करता है, क्योंकि इस के साथ साथ वर्णित विधि सेल व्यवहार्यता समझौता किए बिना पृथक leukocytes की उपज बढ़ाने के लिए एंजाइमी पूर्व उपचार के साथ कोमल यांत्रिक हदबंदी को जोड़ती है। विधियों की एक समान संयोजन मातृ-भ्रूण इंटरफ़ेस 39 पर decidual ऊतकों से leukocytes के अलगाव में प्रभावी होने के लिए प्रदर्शन किया गया है। इसलिए, इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल व्यवस्था शामिल हैविरोध करने नलियां, रेज़र ब्लेड, या शल्य कैंची 10,28 के साथ परंपरागत क़ीमा बनाने की तुलना में जब समय और श्रम की बचत करते हुए स्थिरता बढ़ जाती है कि एक स्वत: ऊतक dissociator साथ nical disaggregation। ऊतक हदबंदी के लिए चुना एंजाइम Accutase था। आमतौर पर इस्तेमाल किया collagenase 43 के विपरीत, 44 dispase, और trypsin 45, Accutase (एक सेल टुकड़ी समाधान) सामान्य प्रोटियोलिटिक और कुशल अभी तक कोमल हदबंदी 46,47 कि योगदान करने के collagenolytic गतिविधियों दोनों को जोड़ती है। हदबंदी के बाद, ल्यूकोसाइट्स घनत्व ढाल centrifugation द्वारा decidual कोशिकाओं की कुल आबादी से समृद्ध कर रहे हैं। विभिन्न घनत्व ढाल मीडिया पहले से Percoll (कोलाइडयन सिलिका कणों का एक निलंबन) 48 और Ficoll (एक उच्च कृत्रिम आणविक वजन के साथ sucrose के एक बहुलक) 49 सबसे आम है, जिनमें से उपयोग किया गया है। सूक्रोज बहुलक से अलगाव की बेहतर दक्षता previo कर दिया गया हैusly 50 दिखाया गया है, और इस के साथ साथ आगे वर्णित प्रोटोकॉल इस घनत्व ढाल मीडिया मोनोन्यूक्लियर leukocytes के एक पर्याप्त उच्च शुद्धता है कि उत्पादन साबित होता है।

इसलिए, इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल मानव decidual ऊतकों से ल्यूकोसाइट्स अलग करने के लिए एक घनत्व ढाल मीडिया (1.077 + 0.001 ग्राम / एमएल) के साथ एक स्वचालित ऊतक dissociator, एक सेल टुकड़ी समाधान के साथ enzymatic पाचन, और ल्युकोसैट जुदाई के साथ यांत्रिक ऊतक disaggregation को जोड़ती है। इस प्रोटोकॉल सेल व्यवहार्यता के साथ कोशिका की सतह एंटीजन संरक्षित करने के लिए सिद्ध किया गया है। पृथक ल्यूकोसाइट्स फ्लो और इन विट्रो में कार्यात्मक पढ़ाई के साथ immunophenotyping शामिल है कि कई अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल फ्लो द्वारा immunophenotyping के लिए तैयारी में पत्या basalis और पत्या parietalis से ल्युकोसैट अलगाव के लिए उपयुक्त है। इसके अलावा, अलग कक्षों सेल छँटाई, सेल संस्कृति, शाही सेना अलगाव, और कोशिका विज्ञान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में उल्लेख किया नमूनों के साथ काम करने से पहले, मानव नैतिक अनुमोदन स्थानीय अनुसंधान आचार समिति और संस्थागत समीक्षा बोर्ड से प्राप्त किया जाना चाहिए। संग्रह और अनुसंधान प्रयोजनों के लिए मानव नमूनों के उपयोग के बाल स्वास्थ्य और मानव विकास (NICHD) की Eunice कैनेडी श्राइवर नेशनल इंस्टिट्यूट ऑफ संस्थागत समीक्षा बोर्ड, स्वास्थ्य (एनआईएच) के राष्ट्रीय संस्थानों, स्वास्थ्य और मानव सेवा विभाग (DHHS द्वारा अनुमोदित किया गया , बेथेस्डा, एमडी, संयुक्त राज्य अमरीका) और वेन स्टेट यूनिवर्सिटी (डेट्रोइट, एमआई, संयुक्त राज्य अमरीका)। लिखित सूचित सहमति से पहले ऊतकों के नमूनों का संग्रह करने के लिए सभी गर्भवती महिलाओं से प्राप्त हुई थी।
नोट: पशु रक्त, सेल, या जोखिम के साथ काम करते हुएइस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में ous एजेंटों, यह उचित जैव सुरक्षा और प्रयोगशाला सुरक्षा कार्यों का पालन किया जाना आवश्यक है।

मानव Decidual टिश्यूज 1. विच्छेदन

नोट: बेसल थाली बेस के नीचे और प्लेसेंटा से जुड़ी है और मातृ सतह का प्रतिनिधित्व करता है। chorioamniotic झिल्ली भ्रूणावरण और जरायु शामिल हैं। बेसल थाली पत्या basalis भी शामिल है और जरायु पत्या parietalis (चित्रा 1) शामिल हैं।

  1. पत्या Basalis
    1. प्लेसेंटा (आंकड़े 1 ए और 1 बी) में से एक अंकुर से बेसल थाली का एक टुकड़ा काटना।
    2. ऊपर की ओर का सामना करना पड़ अपरा विल्ली के साथ एक बाँझ काटने बोर्ड पर रखें। अपरा विल्ली दिखा पक्ष आमतौर पर दिखने में बालों वाले ऊतक के साथ खूनी लाल है। बेसल थाली चिकनी और लाल रंग में पीला है।
    3. VILL दूर करने के लिए तीव्र, ठीक बिंदु कैंची और संदंश का प्रयोग करेंous ऊतक और रक्त वाहिकाओं। प्रक्रिया (चित्रा 1C) के दौरान (मुक्त - - 2 + मिलीग्राम और सीए 2 +) 1x पीबीएस में भिगो ऊतक रखें। इन टुकड़ों के 2 से 3 लीजिए और रक्त (चित्रा -1) को हटाने के लिए 1x पीबीएस के साथ उन्हें अच्छी तरह कुल्ला।
  2. पत्या Parietalis
    1. Chorioamniotic झिल्ली का एक टुकड़ा काटना (लगभग 10 सेमी 10 सेमी, चित्रा 1E x)। जरायु ऊपर की ओर का सामना करना पड़ के साथ बोर्ड पर रखें। कोरियोनिक पक्ष खूनी थक्के होता है और आमतौर पर पीले रंग में प्रकाश है।
    2. संभव है (चित्रा 1E) के रूप में रक्त के थक्के के रूप में कई दूर करने के लिए ठीक बिंदु संदंश का प्रयोग करें। 1x पीबीएस स्पष्ट चलाता है जब तक झिल्ली से अतिरिक्त रक्त साफ करने के लिए बाँझ 1X पीबीएस में झिल्ली कुल्ला।
    3. धीरे झिल्ली से decidual परत परिमार्जन करने के लिए एक डिस्पोजेबल बाँझ सेल खुरचनी का प्रयोग करें। मेम पर बाँझ 1x पीबीएस लागू करेंbrane इस प्रक्रिया (चित्रा 1F) को पूरा करते हुए। Decidual ऊतकों लीजिए और बाँझ 1x पीबीएस (चित्रा 1G) के साथ एक 50 मिलीलीटर की प्लास्टिक ट्यूब में उन्हें जगह है।

2. यांत्रिक disaggregation और enzymatic पाचन

  1. एक 50 मिलीलीटर की प्लास्टिक ट्यूब में बाँझ 1x पीबीएस के साथ (चरण 1.1.3 से) पत्या basalis से विच्छेदित ऊतक या (चरण 1.2.3 से) पत्या parietalis धो लें। आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा ऊतक छर्रों लीजिए।
  2. ध्यान से गोली परेशान बिना ऊतक गोली ऊपर स्थित सतह पर तैरनेवाला aspirate।
    नोट: वे लाल रक्त कोशिकाओं होते क्योंकि इस बिंदु पर, छर्रों बहुत ढीले हैं। गोली की मात्रा के बारे में या कम से कम 3 मिलीग्राम है, तो सेल टुकड़ी समाधान के 6 मिलीलीटर 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गरम में गोली फिर से निलंबित। गोली मात्रा के 3 मिलीग्राम से भी बड़ा है, तो अधिक सेल टुकड़ी समाधान जोड़ने (ध बारे में 2 बार जोड़नेऊतकों के नमूनों की ई की मात्रा)।
  3. एक सी ट्यूब से homogenized ऊतकों (पत्या basalis + सेल टुकड़ी समाधान या पत्या parietalis + सेल टुकड़ी समाधान) स्थानांतरण।
  4. स्वचालित dissociator में सी ट्यूब प्लेस और इसी कार्यक्रम चलाते हैं।
    नोट: पत्या basalis के लिए कार्यक्रम चलाने के प्रति 668 कुल दौर के साथ 17 सेकंड के लिए चलाता है। पत्या parietalis के लिए कार्यक्रम चलाने के प्रति 235 कुल दौर के साथ 37 सेकंड के लिए चलाता है। इन कार्यक्रमों में पत्या basalis या अच्छी उपज और सेल व्यवहार्यता के साथ पत्या parietalis से ल्यूकोसाइट्स को अलग-थलग करने के लिए अनुकूलित किया गया है।
  5. ऐसे Accutase के रूप में एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल टुकड़ी समाधान के साथ ऊतकों को पचाने, ऊतकों के यांत्रिक disaggregation के बाद; कोमल आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए (प्रोटियोलिटिक और collagenolytic एंजाइमों में शामिल है कि एक कॉकटेल)।

Leukocytes की 3. अलगाव

  1. ऊष्मायन के बाद, DIGE 1X पीबीएस के 10 एमएल जोड़ेंstion मिश्रण और एक 50 मिलीलीटर की प्लास्टिक ट्यूब में एक 100 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से इसे पारित। पाचन मिश्रण की चिपचिपाहट पर निर्भर करता है, एक के बाद एक मिश्रण के लिए कई सेल strainers उपयोग करने की आवश्यकता हो सकती है।
  2. आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर 1x पीबीएस के साथ ट्यूब और अपकेंद्रित्र भरें। ध्यान से सेल छर्रों से ऊपर 1x पीबीएस निकालें और ठंडा FACS बफर के 5 मिलीलीटर के साथ छर्रों फिर से निलंबित।
    नोट: 6.1 जाने के लिए कदम, एक साथ polymorphonuclear और मोनोन्यूक्लियर ल्यूकोसाइट्स का अध्ययन करने के लिए; मोनोन्यूक्लियर ल्यूकोसाइट्स अध्ययन करने के लिए, 3.3 कदम के लिए जारी।
  3. एक 15 मिलीलीटर की प्लास्टिक ट्यूब करने के लिए 20% के 5 मिलीलीटर घनत्व ढाल मीडिया (1.077 + 0.001 ग्राम / एमएल) जोड़ें और धीरे धीरे घनत्व ढाल मीडिया के शीर्ष पर सेल निलंबन उपरिशायी। नमूना लेयरिंग है, यह सेल निलंबन के साथ घनत्व ढाल मीडिया मिश्रण करने के लिए महत्वपूर्ण नहीं है।
  4. ब्रेक के बिना 4 सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 500 XG पर एक स्विंग बाहर रोटर के साथ अपकेंद्रित्र। यह कोशिकाओं और एल मिश्रण से बचने के लिए ब्रेक बंद करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण हैढाल osing। Leukocytes घनत्व ढाल मीडिया और FACS बफर के बीच इंटरफेस में मिल जाएगा।
  5. एक विंदुक का उपयोग बहुत ही सावधानी से FACS बफर और सेल मलबे में शामिल है कि ऊपरी परत निकालें। इंटरफेस में बैंड decidual मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं और polymorphonuclear leukocytes के एक हिस्से में शामिल है।
  6. एक नया 15 मिलीलीटर की प्लास्टिक ट्यूब करने के लिए पूरी तरह से इंटरफेस में कोशिकाओं स्थानांतरण। FACS बफर के कम से कम 3 गुना अधिक मात्रा में शामिल करें।
  7. कोशिकाओं pelletize करने के लिए 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला Aspirate और FACS बफर के साथ कोशिकाओं को धो लें। आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर एक और centrifugation के साथ कोशिकाओं Pelletize।
    नोट: चरण 6 को देखें, immunophenotyping प्रदर्शन करने के लिए कदम 5. देखते हैं, सेल छँटाई प्रदर्शन करने के लिए चरण 4 देखें, सेल संस्कृति करने के लिए।

4. आवेदन - सेल संस्कृति

  1. यूएसआई व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना RPMI संस्कृति के माध्यम से 1640 के 1 मिलीलीटर में कदम 3.7 से कोशिकाओं को पुनः निलंबितएक स्वचालित सेल काउंटर या एक hemocytometer और एक trypan नीले समाधान 0.4% एनजी।
  2. 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक सेल एकाग्रता बनाने के लिए RPMI संस्कृति के माध्यम से राशि जोड़ें। कोशिकाओं को अब संस्कृति के लिए तैयार हैं।

5. आवेदन - प्राथमिक सेल संस्कृति के लिए मैक्रोफेज के अलगाव

  1. चुंबकीय CD14 microbeads (10 7 कोशिकाओं प्रति 20 μl मोती) के साथ कदम 3.7 से कोशिकाओं लेबल, CD14 + कोशिकाओं को अलग करने के लिए, 15 4 सेल्सियस पर मिनट, और एक चुंबकीय क्षेत्र को लागू करने से कोशिकाओं के अन्य प्रकार से अलग CD14 + कोशिकाओं के लिए सेते हैं। एमएसीएस बफर और चुंबकीय क्षेत्र को हटाने के साथ 2 washes के बाद, एमएसीएस बफर के साथ चुंबकीय बरकरार रखा CD14 + कोशिकाओं elute।
  2. Centrifugation के बाद, फिर से निलंबित कोशिकाओं चढ़ाना (चित्रा 2) के लिए तैयार कर रहे हैं RPMI संस्कृति के माध्यम से 1640 में सेल छर्रों।

6. आवेदन - Immunophenotyping

  1. Immunophenot के लिए कोशिकाओं का उपयोग करने के लिएyping, 1x पीबीएस के 1 मिलीलीटर में कदम 3.7 से कोशिकाओं को फिर से निलंबित। एक स्वचालित सेल काउंटर या एक hemocytometer और एक trypan नीले समाधान 0.4% का उपयोग व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना।
  2. एक फिक्स व्यवहार्यता डाई (चित्रा 3) के साथ कोशिकाओं लेबल। FACS बफर के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें और दाग बफर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए एक FCR अवरोधक के साथ सेते हैं।
  3. Fluorochromes संयुग्मित कोशिकी एंटीबॉडी जोड़ें। उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल में, विरोधी CD3 उपयोग, विरोधी CD19, विरोधी CD14, विरोधी CD15, और विरोधी CD56 एंटीबॉडी (1 टेबल)। अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  4. 1x पीबीएस के साथ 2 washes के बाद, कोशिकाओं कोशिकामापी एक प्रवाह का उपयोग दाग बफर के 500 μl में विश्लेषण किया जाएगा। Decidual ऊतकों में पाया ल्युकोसैट उप आबादी का विश्लेषण किया जाता gating रणनीति का प्रतिनिधित्व चित्रा 4 में दिखाया गया है।

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Representative Results

। मातृ-भ्रूण इंटरफेस में मानव ऊतकों (पत्या basalis और पत्या parietalis) के विच्छेदन के चित्र 1 में दिखाया गया है यह प्रक्रिया पत्या basalis (- डी चित्रा 1 ए) भी शामिल है जो बेसल थाली, के विच्छेदन भी शामिल है। पत्या basalis बेसल प्लेट (चित्रा 1C) से अपरा विल्ली (भ्रूण की ओर) को हटाने के द्वारा प्राप्त की है। पत्या parietalis धीरे कोरियोनिक झिल्ली (चित्रा 1E - एफ) scraping द्वारा एकत्र की है। 2 चुंबकीय सेल छँटाई का उपयोग कर एक शब्द गर्भावस्था में पत्या parietalis से एकत्र पृथक मैक्रोफेज (CD14 +) के आकारिकी पता चलता है। पृथक मैक्रोफेज संस्कृति के 3 दिन बाद साइटोकिन्स को रिहा करने की क्षमता को बनाए रखा (डेटा) नहीं दिखाया। पत्या basalis और पत्या parietalis से अलग व्यवहार्य कोशिकाओं की उपज में 3 चित्र में दिखाया गया है, और यह दोनों में 90% से अधिक है। 5 से पता चलता है न्यूट्रोफिल, मैक्रोफेज, टी कोशिकाओं, और बी कोशिकाओं चित्रा 6 एक शब्द गर्भावस्था में पृथक decidual कोशिकाओं में एन.के., NKT, और टी कोशिकाओं से पता चलता है ।

चित्र 1
चित्रा 1. मानव मातृ-भ्रूण इंटरफ़ेस:। नाल और chorioamniotic झिल्ली (ए) बेसल थाली नाल से विच्छेदित किया जाता है; (बी) बेसल थाली अपरा विल्ली से अलग कर दिया जाता है; (सी) अपरा विल्ली पत्या basalis सहित बेसल थाली से छंटनी की है; (डी) पत्या Basa फूल 1x पीबीएस में rinsed है; (ई) कोरियोनिक झिल्ली का एक टुकड़ा प्राप्त किया जाता है और रक्त के थक्के धीरे हटा रहे हैं; (एफ) पत्या parietalis धीरे scraped है; और (छ) पत्या parietalis (बिंदीदार रेखा) कोरियोनिक झिल्ली से अलग है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा संस्कृति में 2. Decidual मैक्रोफेज। मैक्रोफेज (CD14 + कोशिकाओं) शब्द गर्भावस्था में पत्या parietalis से अलग थे। मैक्रोफेज RPMI1640 10% FBS + 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन 50 एनजी / एमएल MCSF के साथ प्लास्टिक चैम्बर स्लाइड्स में चढ़ाया गया। तस्वीरें चढ़ाना (ए) के समय में ले लिया है और 3 दिनों के बाद संस्कृति (सी) में थे।3 / 52863fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
पत्या basalis से अलग कुल कोशिकाओं की चित्रा 3. कुल सेल व्यवहार्यता। व्यवहार्यता और पत्या parietalis एक फिक्स व्यवहार्यता डाई (कदम 6.2) का उपयोग कर निम्न घनत्व ढाल निर्धारित किया गया था। पृथक कक्षों की व्यवहार्यता लाइव / मृत सेल व्यवहार्यता धुंधला के अनुसार> 95% है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
Decidual ल्युकोसैट उप आबादी के लिए चित्रा 4. Gating रणनीति। Leukocytes FSC और एसएससी के साथ gated थे। जीवित कोशिकाओं तो व्यवहार्यता गेट (लाइव) के अनुसार gated थे। व्यवहार्य कोशिकाओं n में अलग हो गए थेeutrophils (CD15 +) और मैक्रोफेज (CD14 +)। CD14-CD15- आबादी तो आगे एन.के. कोशिकाओं (CD3-CD56 +) NKT कोशिकाओं (CD3 + CD56 +) टी कोशिकाओं (CD3 +) और बी कोशिकाओं (CD19 +) में विभाजित किया गया था। इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें आंकड़ा।

चित्रा 5
। चित्रा decidual ऊतकों में 5. ल्यूकोसाइट उप आबादी न्यूट्रोफिल (CD15 +) और मैक्रोफेज (CD14 +) व्यवहार्यता फाटक के भीतर gated थे; टी कोशिकाओं (CD3 +) और बी कोशिकाओं (CD19 +) CD14-CD15- फाटक के भीतर gated गया। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
Decid में चित्रा 6 दुर्लभ ल्युकोसैट उप आबादीयौन ऊतकों। एन.के. कोशिकाओं (CD56 +) और NKT कोशिकाओं (CD56 + CD3 +) CD14-CD15- फाटक के भीतर gated गया। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एंटीबॉडी सूची कंपनी सूचि नंबर
बी.डी. Pharmingen मानव विरोधी CD56 पीई Cy7 बी.डी. बायोसाइंसेज 557,747
बी.डी. क्षितिज मानव विरोधी CD15-BV605 बी.डी. बायोसाइंसेज 562,980
बी.डी. क्षितिज मानव विरोधी CD14-BUV395 बी.डी. बायोसाइंसेज 563,561
बी.डी. क्षितिज मानव विरोधी CD19-BUV737 बी.डी. बायोसाइंसेज 564,303
बहुत खूब वायलेट 650 मानव विरोधी CD3 एंटीबॉडी Biolegend 317,323

एंटीबॉडी की तालिका 1. सूची ल्युकोसैट सबसेट immunophenotyping के लिए उपयोग

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Discussion

मानव मातृ-भ्रूण इंटरफेस में ल्यूकोसाइट्स घुसपैठ के कार्यात्मक और प्ररूपी गुणों की विशेषता गर्भावस्था से जुड़ी समस्याओं के लिए नेतृत्व कि प्रतिरक्षा तंत्र को समझने के लिए आवश्यक है। कई तकनीकों गर्भावस्था 10,14,25,28,37,42,43 भर में मानव मातृ-भ्रूण इंटरफ़ेस से ल्यूकोसाइट्स को अलग करने के क्रम में वर्णित किया गया है। हालांकि, इन तकनीकों में से प्रत्येक अलग है, हमेशा अलग कक्षों की व्यवहार्यता निर्दिष्ट नहीं करता है, सबसे महत्वपूर्ण बात, एंजाइम या एंजाइम संयोजन विभिन्न उपयोगों की आवश्यकता है अलग हदबंदी बार, ऊतक की मात्रा निर्दिष्ट नहीं करता है, और। इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल व्यवहार्यता का एक उच्च उपज में जिसके परिणामस्वरूप मानव मातृ-भ्रूण इंटरफेस में ल्यूकोसाइट्स (पत्या basalis और पत्या parietalis) घुसपैठ के अलगाव की अनुमति देता है और विस्तृत वाणिज्यिक अभिकर्मकों के बारे में जानकारी, बफर तैयारी, ऊतक मात्रा में है, और ऊष्मायन बार valida प्रदान करता हैहमारी प्रयोगशाला में टेड।

ल्युकोसैट अलगाव की प्रक्रिया का पहला महत्वपूर्ण कदम ऊतक हदबंदी है; इस चरण यांत्रिक desegregation और / या एंजाइमी हदबंदी शामिल है। मैकेनिकल desegregation सफलतापूर्वक पत्या parietalis (चित्रा 1F) को अलग-थलग जब जरायु scraping द्वारा और पत्या basalis (चित्रा 1C) 10,28 को अलग-थलग जब बेसल थाली से अपरा विल्ली trimming द्वारा किया जाता है। इसलिए, इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल प्रारंभिक कदम के रूप में दोनों प्रक्रियाओं में शामिल हैं। हालांकि, यह पत्या basalis से ल्यूकोसाइट्स को अलग-थलग जब भ्रूण ल्यूकोसाइट्स के प्रदूषण का कारण बन सकती है, जो बेसल प्लेट (मातृ ऊतकों) और अपरा विल्ली (भ्रूण के ऊतकों) अच्छी तरह जुड़े होते हैं पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है। भ्रूण संक्रमण से बचने के लिए, प्रोटोकॉल के साथ साथ छंटनी बेसल थाली दो या तीन बार (चित्रा -1) धोने की सिफारिश की। सेल scraping के बाद या trimmingपत्या basalis या पत्या parietalis से, यांत्रिक ऊतक disaggregation के लिए एक अतिरिक्त कदम 39 सिफारिश की गई है। इस कदम की सिफारिश की है क्योंकि मजबूती से बाह्य मैट्रिक्स 6,7 करने के लिए उन्हें देते हैं कि मातृ-भ्रूण इंटरफ़ेस एक्सप्रेस कोशिका आसंजन अणुओं में घुसपैठ ल्यूकोसाइट्स। इसलिए, इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल नलियां, रेज़र ब्लेड, या शल्य कैंची 10,28 के साथ परंपरागत क़ीमा बनाने की तुलना में जब समय और श्रम की बचत करते हुए स्थिरता बढ़ जाती है कि एक स्वत: ऊतक dissociator के साथ यांत्रिक disaggregation शामिल है।

ऊतक हदबंदी की प्रक्रिया में एक दूसरा महत्वपूर्ण कदम enzymatic पृथक्करण है। एकल एंजाइम और विभिन्न एंजाइमों का एक संयोजन पत्या basalis से घुसपैठ ल्यूकोसाइट्स अलग करने के लिए इस्तेमाल किया और पत्या 10,14,25,28,37,42,43 parietalis किया गया है। कई मामलों में, उन एंजाइमों प्रयोगशाला में हाथ से एक निश्चित एकाग्रता के लिए तैयारइतिहास मानव त्रुटि के अधीन किया जा सकता है। यहाँ, इसके बजाय, एक के लिए तैयार करने के लिए उपयोग शुद्ध collagenase / तटस्थ प्रोटीज कॉकटेल, Accutase, प्रयोगशाला में लागू किया गया है; एक वाणिज्यिक एंजाइम के रूप में, यह सेल संस्कृति 51 में विश्वसनीय परिणाम प्रदान करने के लिए दिखाया गया है। सतह खोने 51 प्रतिजन बिना Accutase (एक सेल टुकड़ी समाधान), प्रभावी रूप से सबसे महत्वपूर्ण बात, scraping और बिना संस्कृति प्लेटों से मैक्रोफेज अलग करने के लिए जाना जाता है। यह तैयार एंजाइम भी समय के साथ, अपने सेल संस्कृति 52 के लिए अनुमति देता है, यह एक लंबी अवधि के लिए स्थायी रहते हैं कि व्यवहार्य अलग कक्षों में जिसके परिणामस्वरूप, मानव और पशुओं के तंत्रिका तंत्र के ऊतकों की पाचन प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल किया गया है। इसके अलावा, इस समाधान भी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के ऊतकों 52 से अलग कक्षों में CD24 प्रतिजनकता बरकरार रखता है। Liberase -1, collagenase और तटस्थ प्रोटीज का एक और कॉकटेल, न तो Accutase और न ही Liberase-1 मुक्त डीएनए समुच्चय उत्पन्न करने के लिए जब तुलना में; हालांकि, Accutase छ हैऊतक हदबंदी 52 के दौरान Liberase -1 की तुलना में entler। इस वजह से, Accutase पाचन 52 के बाद सेल समुच्चय को अलग कर देना नहीं है। इस सीमा को पार करने के लिए, के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल पत्या basalis और पत्या parietalis से पहले समाधान के साथ ऊतक हदबंदी करने का स्वत: ऊतक disaggregation भी शामिल है। Accutase भी CD44, एक कैंसर स्टेम कोशिका की सतह मार्कर 53 के संरक्षण में ट्रिप्सिन को अपनी श्रेष्ठता का प्रदर्शन किया है। हमारी प्रयोगशाला का लगातार अध्ययन टुकड़ी समाधान सतह एंटीजन को बरकरार रखता है कि उल्लेख किया है। दरअसल, गर्भावस्था से जुड़ी समस्याओं और सामान्य गर्भधारण के बीच मतभेद मैक्रोफेज (CD14 + कोशिकाओं), न्यूट्रोफिल (CD15 + कोशिकाओं), टी कोशिकाओं (CD3 + कोशिकाओं), और बी कोशिकाओं में कई बाह्य और intracellular मार्करों की अभिव्यक्ति में पाया गया है (CD19 + कोशिकाओं), सहित CD80, CD86, CD163, CD209, ICAM3, CD45RO, CD45RA, CXCR3, CCR7, CCR6, सीडी 4, सीडी 8, CD25, FOXP3, CD24, CD38, CD27, CD38, CD43, CD23, आईजीएम, आईजीडी, CD5, टी-शर्त, GATA-3, और RORγt, और साइटोकाइन रिलीज में। प्रतिनिधि परिणाम के रूप में दिखाया इसलिए, इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल मानव मातृ-भ्रूण इंटरफेस में घुसपैठ leukocytes के immunophenotyping के लिए इष्टतम है।

इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण लाभ यह व्यवहार्य कोशिकाओं के एक उच्च उपज के साथ leukocytes के अलगाव के लिए अनुमति देता है। प्रतिनिधि डेटा अलग कक्षों की> 90% व्यवहार्य हैं कि पता चलता है। इस प्रोटोकॉल मातृ-भ्रूण इंटरफेस में मानव ऊतकों से अलग कक्षों के कार्यात्मक गुणों के अध्ययन की अनुमति दी है के रूप में इस महान महत्व का है। उदाहरण के लिए, decidual मैक्रोफेज और उत्तेजना के तहत साइटोकाइन रिहाई के अध्ययन की संस्कृतियों इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया गया है।

1) ऊतक collecti: वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग सफल परिणाम प्राप्त करने के लिए, यह निम्नलिखित कारकों पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण हैपर प्रसव के बाद 1-2 घंटे के भीतर किया जाना चाहिए, और इन ऊतकों अलग कक्षों की व्यवहार्यता की रक्षा करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x पीबीएस के साथ एक कंटेनर में रखा जाना चाहिए; इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में 2) मैकेनिकल ऊतक disaggregation, मान्य समय पर एक स्वत: homogenizer का उपयोग किया जाना चाहिए; 3) सेल टुकड़ी समाधान के साथ ऊष्मायन की अवधि को अपनी गतिविधि इस समय कम हो जाने के बाद के बाद से 1 घंटे से कम होना चाहिए; 4) सेल टुकड़ी समाधान के साथ ऊष्मायन के तापमान इस एंजाइम की गतिविधि इष्टतम प्राप्त करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाना चाहिए; भंवर का उपयोग कोशिकाओं की अखंडता को नुकसान पहुंचा सकता है क्योंकि 5) सेल गोली हेरफेर () अलग कक्षों विभेदित और अचानक हेरफेर आसानी से उनकी व्यवहार्यता को कम कर सकते हैं कि याद micropipettes के साथ धीरे से किया जाना चाहिए; 6) बफर और अपकेंद्रित्र तापमान सेल निलंबन के रूप में ही तापमान पर रखा जाना चाहिए; 7) अलग कक्षों immunophenotyping के लिए कार्रवाई या तुरंत इस्तेमाल किया जाना चाहिएately उनकी व्यवहार्यता तेजी से कम कर देता है; immunophenotyping जब प्रदर्शन और 8), नमूने अच्छे परिणाम के लिए कोशिकामापी तुरंत एक प्रवाह का उपयोग कर हासिल किया जाना चाहिए।

इस प्रोटोकॉल की सीमाओं में से एक समान कार्य करता है, जैसे, ट्रिप्सिन, dispase द्वितीय, और collagenase साथ अन्य एंजाइमों की तुलना में महंगा है जो Accutase की लागत है। हालांकि, पर और उन एंजाइमों से ऊपर प्रदर्शित करता है Accutase लाभ है कि बेहतर कर रहे हैं। प्रोटोकॉल का एक दूसरा सीमा इसलिए, महंगा हो सकता है, एक आम प्रयोगशाला साधन नहीं है और जो एक स्वचालित ऊतक dissociator, की आवश्यकता है। इस सीमा को पार करने के लिए, ऊतक desegregation भी छोटे शल्य कैंची का उपयोग किया जा सकता है; लंबी अवधि व्यवहार्य कोशिकाओं की उपज को कम करने के लिए प्रदर्शन किया गया है के बाद से हालांकि, इस कदम 3-5 मिनट से अधिक नहीं कर सकते हैं। सभी dissociations परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए एक ही शोधकर्ता द्वारा किया जाना चाहिए।

सारांश में, समर्थकtocol इस के साथ साथ मातृ-भ्रूण इंटरफेस में मानव ऊतकों से अलग ल्यूकोसाइट्स में बाह्य और intracellular मार्कर की अखंडता की रक्षा करने के लिए कोमल यांत्रिक और enzymatic ऊतक हदबंदी तकनीकों के उपयोग को जोड़ती है एक उपन्यास दृष्टिकोण प्रदान करता है। एक तरफ immunophenotyping, सेल संस्कृति, और सेल छँटाई से, इस प्रोटोकॉल के भविष्य के अनुप्रयोगों के कई और विविध हैं। हम सफलतापूर्वक decidual ल्युकोसैट कार्यक्षमता (यानी, cytotoxicity, टी-सेल प्रसार और plasticity, आदि), और decidual ऊतकों से अलग ल्यूकोसाइट्स में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन के लिए इन विट्रो अध्ययन के लिए ल्यूकोसाइट्स (डेटा नहीं अलग करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया गया है दिखाया गया है)। दरअसल, वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग, हमारी प्रयोगशाला मातृ-भ्रूण इंटरफेस में नए और दुर्लभ ल्यूकोसाइट्स वर्णन करने में सक्षम हो गया है।

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Acknowledgments

इस काम के बाल स्वास्थ्य और मानव विकास के Eunice कैनेडी श्राइवर नेशनल इंस्टीट्यूट, एनआईएच / DHHS द्वारा समर्थित किया गया। यह काम भी मातृ, प्रसवकालीन और बाल स्वास्थ्य में वेन स्टेट यूनिवर्सिटी प्रसवकालीन पहल से, भाग में, का समर्थन किया था। हम कृतज्ञता पांडुलिपि की उसके आलोचकों की रीडिंग के लिए मॉरीन McGerty (वेन स्टेट यूनिवर्सिटी) स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection
Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers  Any vendor 20012-027
1X phosphate buffered saline (PBS) Life Technologies (1X PBS)
Large and small Petri dishes Any vendor
Dissociation
Accutase Life Technologies A11105-01 (cell detachment solution)
Sterile 2 ml safe-lock conical tubes Any vendor
50 ml conical centrifuge tubes Any vendor
100 µm cell strainers FALCON/Corning 352360
5 ml round bottom polystyrene test tubes Any vendor
Transfer pipettes Any vendor
C tubes Miltenyi Biotec 130-093-237
Cell Culture
RPMI culture medium 1640  Life Technologies 22400-089 (1X) (10% FBS and 1% P/S)
Plastic chamber slides Thermo Scientific 177437
Incubator Thermo Scientific Corporation HEPA Class 100
Water bath Fisher Scientific ISOTEMP 110
Cell counter Nexelcom Cellometer Auto2000
Microscope Olympus Olympus CKX41
Cell Separation
MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201
Cell separator Miltenyi Biotec 130-042-109
30 μm pre-separation filters Miltenyi Biotec 130-041-40
Multistand Miltenyi Biotec 130-042-303
15 ml safe-lock conical tubes Any Vendor
MACS buffer  (0.5% bovine serum albumin, 2 mM EDTA and 1X PBS)
Reagents
FcR Blocking Miltenyi Biotec 130-059-901 (Fc Block)
Anti-human cell surface antigen antibodies  BD Biosciences (Table 1)
Bovine serum albumin  Sigma A7906
LIVE/DEAD viability dye BD Biosciences 564406
Lyse/Fix buffer  BD Biosciences 346202
FACS buffer  (0.1% BSA, 0.05% Sodium Azide, and 1X PBS, pH=7.4)
Staining buffer  BD Biosciences 554656
Trypan Blue solution 0.4% Life Technologies 15250-011
Ficoll GE Healthcare 17-1440-02 20% density gradient media (1.077 + 0.001 g/ml)
Additional Instruments
Incubator with shaker Thermo Scientific MAXQ 4450
Flow cytometer BD Biosciences LSR-Fortessa
Centrifuge  Beckman Coulter SpinChron DLX
Vacuum system Any vendor
Automatic tissue dissociator  Miltenyi Biotec gentleMACS Dissociator

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Xu, Y., Plazyo, O., Romero, R., Hassan, S. S., Gomez-Lopez, N. Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface. J. Vis. Exp. (99), e52863, doi:10.3791/52863 (2015).

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