Abstract
يتميز الحمل عن طريق تسلل الكريات البيض في الأنسجة التناسلية وعلى واجهة الأم والجنين (القاعدي الساقط والساقط الجداري). هذه الواجهة هو الموقع التشريحي للاتصال بين الأم وأنسجة الجنين. وبالتالي، فإنه هو موقع المناعية للعمل خلال فترة الحمل. التسلل الكريات البيض في واجهة الأم والجنين دورا أساسيا في غرس والصيانة الحمل، وتوقيت التسليم. ولذلك، فإن الأوصاف المظهرية والوظيفية لهذه الكريات البيض توفر نظرة ثاقبة الآليات التي تؤدي إلى اضطرابات الحمل. وقد وصفت عدة بروتوكولات من أجل عزل التسلل الكريات البيض من القاعدي الساقط والجدارية الساقط. ومع ذلك، فإن عدم الاتساق في الكواشف، والإنزيمات، ومرات من الحضانة يجعل من الصعب مقارنة هذه النتائج. الموصوفة هنا هو نهج الرواية التي تجمع بين استخدام ديس الميكانيكية والأنزيمية لطيفتقنيات ociation للحفاظ على سلامة ونزاهة علامات خارج الخلية والخلايا في الكريات البيض معزولة عن الأنسجة البشرية في واجهة الأم والجنين. وبصرف النظر عن المناعي، زراعة الخلايا، والفرز الخلية، والتطبيقات المستقبلية من هذا البروتوكول عديدة ومتنوعة. بعد هذا البروتوكول، والكريات البيض معزولة يمكن استخدامها لتحديد الحامض النووي والتعبير عن الجينات المستهدفة، في وظائف المختبر الكريات البيض (أي البلعمة، سمية الخلايا وانتشار الخلايا التائية، واللدونة، وما إلى ذلك)، وإنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية في واجهة الأم والجنين. بالإضافة إلى ذلك، باستخدام بروتوكول وصفها، لقد كان هذا المختبر قادرة على وصف الكريات البيض جديدة ونادرة في واجهة الأم والجنين.
Introduction
يتميز الحمل عن طريق ثلاث مراحل متميزة المناعية: 1) غرس والمشيمة المبكرة المرتبطة استجابة الموالية للالتهابات (أي زرع يشبه "جرح مفتوح ')؛ 2) الثلث الثاني من الحمل وأكثر من الثلث الثالث من الحمل عندما يتم تحقيق توازن المناعة من خلال دولة في الغالب مضادة للالتهابات في واجهة الأم والجنين. و3) الولادة، دولة الموالية للالتهابات 1-7. الخلايا المناعية تلعب دورا هاما في تنظيم الاستجابة الالتهابية في واجهة الأم والجنين حيث وفرة والتغيير توطين طوال فترة الحمل 6-9.
في البشر، واجهة الأم والجنين تمثل مساحة الاتصال المباشر بين الأم (الساقط) والجنين (المشيمه أو الأرومة الغاذية) الأنسجة. هذه الواجهة تشمل ما يلي: 1) الجدارية والساقط الذي يبطن تجويف الرحم لم تتم تغطيتها عن طريق المشيمة وهي في تجاورلأجرد المشيمه. و2) القاعدي الساقط، وتقع في لوحة القاعدية من المشيمة حيث غزت من قبل trophoblasts فراغي 10 (الشكل 1). العلاقة الحميمة من هذه المناطق للاتصال تخلق الظروف لتعرض الجنين الأنتيجين إلى الأمهات الجهاز المناعي 11-13. ليس من المستغرب أن الكريات البيض يشكلون ما يقرب من 30-40٪ من الخلايا الساقطية 8،9،14،15 بالإضافة إلى خلايا انسجة من نوع نموذجية والخلايا الغدية 8،14،16. دور الكريات البيض في واجهة الأم والجنين يشمل العمليات المتعددة التي تشمل الحد من الأرومة الغاذية الغزو 17، وتدبير الشرايين دوامة 18،19، والحفاظ على التسامح الأمهات 12،20، والشروع في العمل 21-26. الكريات البيض من كل من التكيف وأطرافه الفطرية في الجهاز المناعي، أي خلايا T، الضامة، وقد تم تحديد العدلات، والخلايا B والخلايا الجذعية، والخلايا القاتلة الطبيعية، في الأنسجة الساقطية، وعلىوقد ثبت النسب وحالة التنشيط تختلف مكانيا وزمانيا طوال فترة الحمل 6-10،12،14،24،27-30. وترتبط اضطرابات في عدد الكريات البيض و / أو وظيفة مع الإجهاض العفوي 31، تسمم الحمل 32، وزن الولادة 32،33، والخدج العمل 7،24. ولذلك، فإن دراسة الصفات المظهرية وظيفة الكريات البيض في واجهة الأم والجنين البشري تسهيل توضيح من مسارات المناعية dysregulated في اضطرابات الحمل.
واحدة من أقوى الأدوات المستخدمة لتحديد النمط الظاهري وخصائص وظيفية من الكريات البيض والتدفق الخلوي والتكنولوجيا التي تسمح للتحليل الكمي للمعلمات متعددة في وقت واحد 34-36. لتحليل الكريات البيضاء التي التدفق الخلوي، مطلوب عزل الكريات البيض في تعليق وحيد الخلية. لذلك، وهي طريقة لفصل التسلل ليووهناك حاجة kocytes من واجهة الأم والجنين لدراسة المظهرية وخصائصها الوظيفية.
وقد وصفت عدة طرق لعزل الكريات البيض من واجهة الأم والجنين البشري 10،14،25،27،37-39. في حين أن بعض تطبيق تصنيف الميكانيكية 10،25،27،38، والبعض الآخر يستخدم الهضم الأنزيمي 37،40 لتفكك الأنسجة. لأن تفصيل الميكانيكية تنتج العائد أقل وانخفاض الجدوى 41، وتفارق الأنزيمية يمكن أن تؤثر على سلامة وسطح الخلية الاحتفاظ علامة 42، الأسلوب هو موضح هنا يجمع بين التفكك الميكانيكية لطيف مع الأنزيمية ما قبل المعالجة لزيادة الغلة من الكريات البيض معزولة دون المساس بقاء الخلية. وقد تجلى مزيج مماثل من الطرق لتكون فعالة في عزل الكريات البيض من أنسجة الساقطية في واجهة الأم والجنين 39. ولذلك، فإن بروتوكول الموصوفة هنا ينطوي ميكاتصنيف nical مع dissociator الأنسجة التلقائي الذي يزيد من الاتساق مع توفير الوقت والعمل بالمقارنة مع تنميق التقليدي مع معارضة المشارط، شفرات الحلاقة، أو مقص جراحي 10،28. كان الإنزيم الذي تم اختياره لتفكك النسيج Accutase. على عكس كولاجيناز تستخدم عادة 43، dispase 44، والتربسين 45، Accutase (حل مفرزة الخلية) يجمع بين بروتين العام وأنشطة حال الكولاجين التي تسهم في كفاءة تفارق بعد لطيف 46،47. بعد التفكك، وإثراء الكريات البيض من مجموع السكان من الخلايا الساقطية التي كتبها التدرج الكثافة الطرد المركزي. وقد وسائل الإعلام المختلفة الكثافة التدرج تستخدم في السابق، والأكثر شيوعا منها Percoll (تعليق جسيمات السيليكا الغروية) 48 و Ficoll (البوليمر من السكروز مع ارتفاع الوزن الجزيئي الاصطناعية) 49. وكانت كفاءة متفوقة من العزلة التي فرضها البوليمر السكروز previoأظهرت usly 50، والبروتوكول وصفها أيضا هنا يثبت أن هذه الوسائط التدرج الكثافة تنتج نقاء عالية بما فيه الكفاية من الكريات البيض وحيدات النوى.
وبالتالي، فإن بروتوكول الموصوفة هنا يجمع بين تصنيف الأنسجة الميكانيكية مع dissociator التلقائي الأنسجة، والهضم الأنزيمي مع حل مفرزة الخلية، وفصل الكريات البيض مع وسائل الإعلام التدرج الكثافة (1.077 + 0.001 غ / مل) لعزل الكريات البيض من أنسجة الساقطية الإنسان. وقد ثبت هذا البروتوكول للحفاظ على مستضدات سطح الخلية مع بقاء الخلية. الكريات البيض معزولة يمكن استخدامها لتطبيقات متعددة تشمل المناعي مع التدفق الخلوي والدراسات الفنية في المختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
هذا البروتوكول هو المناسب لالكريات البيض بمعزل عن القاعدي الساقط والجدارية الساقط استعدادا لالمناعي التدفق الخلوي. وعلاوة على ذلك، فإن الخلايا المعزولة يمكن استخدامها لفرز الخلايا، زراعة الخلايا، والعزلة RNA، وعلم الخلايا. قبل العمل مع العينات المشار إليها في هذا البروتوكول، يجب الحصول على الموافقة الأخلاقية الإنسان من لجنة أخلاقيات البحوث المحلية ومجالس المراجعة المؤسسية. تمت الموافقة على جمع واستخدام العينات البشرية لأغراض البحث من قبل مجالس المراجعة المؤسسية للمعهد الوطني يونيس كينيدي شرايفر لصحة الطفل والتنمية البشرية (معاهد الصحة القومية) والمعاهد الوطنية للصحة (NIH)، وزارة الصحة والخدمات البشرية (DHHS في بيثيسدا، MD، الولايات المتحدة الأمريكية) وجامعة ولاية واين (MI ديترويت، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحصول على موافقة خطية من علم جميع النساء الحوامل قبل مجموعة من عينات الأنسجة.
ملاحظة: بينما كان يعمل مع دم الحيوانات، والخلايا، أو مخاطروكلاء الأوس كما هو مذكور في هذا البروتوكول، فمن الضروري أن السلامة الأحيائية المناسبة والإجراءات الواجب اتباعها سلامة المختبرات.
1. تشريح لساقطي الأنسجة البشرية
ملاحظة: لوحة القاعدية هي قاعدة تحت وتعلق على المشيمة وتمثل سطح الأمهات. وتشمل الأغشية chorioamniotic السلى والمشيمه. تتضمن لوحة القاعدية والقاعدي الساقط ويتضمن المشيمه في الجدارية الساقط (الشكل 1).
- الساقط القاعدي
- تشريح قطعة من لوحة القاعدية من فلقة واحدة من المشيمة (أرقام 1A و 1B).
- وضعه على لوح التقطيع العقيمة مع الزغابات المشيمية التي تواجه التصاعدي. الجانب تظهر الزغابات المشيمية عادة الدموية الحمراء مع النسيج شعر في المظهر. لوحة القاعدية على نحو سلس وشاحب اللون الأحمر.
- استخدام حادة، ومقص غرامة نقطة وملقط لإزالة VILLالأنسجة والأوعية الدموية الأوس. الحفاظ على الأنسجة غارقة في برنامج تلفزيوني 1X (كا 2+ - والمغنيسيوم 2+ - مجانا) أثناء عملية (الشكل 1C). جمع 2-3 من هذه القطع وشطف لهم بدقة مع 1X PBS لإزالة الدم (1D الشكل).
- الساقط الجداري
- تشريح قطعة من الأغشية chorioamniotic (حوالي 10 سم x 10 سم، الشكل 1E). وضعه على متن الطائرة مع المشيمه تواجه التصاعدي. ويتضمن الجانب المشيمي الجلطات الدموية وعادة ما يكون ضوء مصفر اللون.
- استخدام ملقط غرامة نقطة لإزالة أكبر عدد ممكن من جلطات الدم ممكن (الشكل 1E). شطف الغشاء في العقيمة برنامج تلفزيوني 1X لتنظيف الدم الزائد من الغشاء حتى يدير برنامج تلفزيوني 1X واضح.
- استخدام مكشطة الخلية معقمة المتاح لكشط بلطف طبقة الساقطية من الغشاء. تطبيق العقيمة 1X PBS على ذاكرةالغشاء حين الانتهاء من هذه العملية (الشكل 1F). جمع الأنسجة الساقطية ووضعها في أنبوب بلاستيكي 50 مل العقيمة مع برنامج تلفزيوني 1X (الشكل 1G).
2. الميكانيكية تصنيفها والأنزيمية الهضم
- غسل تشريح الأنسجة من القاعدي الساقط (من الخطوة 1.1.3) أو الجدارية الساقط (من الخطوة 1.2.3) مع العقيمة برنامج تلفزيوني 1X في أنبوب بلاستيكي 50 مل. جمع الكريات الأنسجة عن طريق الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
- نضح طاف تقع فوق بيليه الأنسجة بعناية من دون إزعاج بيليه.
ملاحظة: عند هذه النقطة، الكريات هي فضفاضة جدا لأنها تحتوي على خلايا الدم الحمراء. إذا كان حجم الكرية حوالي أو أقل من 3 مل، وإعادة تعليق بيليه في 6 مل من محلول مفرزة الخلية قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية. إذا كان بيليه هو أكبر من 3 مل من حجم، إضافة المزيد من حل مفرزة الخلية (إضافة حوالي 2 مرات عشرحجم (ه) من عينات الأنسجة). - نقل الأنسجة المتجانس (القاعدي الساقط + انفصال الخلايا حل أو الساقط الجداري + حل مفرزة الخلية) إلى أنبوب C.
- وضع أنبوب C في dissociator التلقائي وتشغيل البرنامج المقابل.
ملاحظة: البرنامج لالقاعدي الساقط يعمل لمدة 17 ثانية مع 668 مجموع طلقة في التشغيل. برنامج للالجدارية الساقط يعمل لمدة 37 ثانية مع 235 مجموع طلقة في التشغيل. وقد تم تخصيص هذه البرامج لعزل الكريات البيض من القاعدي الساقط أو الجدارية الساقط مع العائد الجيد وبقاء الخلية. - بعد تصنيف الميكانيكية للأنسجة، هضم الأنسجة مع متوفرة تجاريا حل مفرزة الخلية مثل accutase. (كوكتيل يحتوي على بروتين وأنزيمات حال الكولاجين) لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الإثارة لطيف.
3. عزل الكريات البيضاء
- بعد الحضانة، إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني 1X إلى digestion خليط وتمريرها من خلال خلية مصفاة 100 ميكرون إلى 50 مل أنبوب بلاستيكي. اعتمادا على التصاق الخليط الهضم، واحدة قد تحتاج إلى استخدام عدة مصافى خلية للخليط واحد.
- ملء الأنبوب مع برنامج تلفزيوني 1X وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق على RT. إزالة برنامج تلفزيوني 1X فوق الكريات خلية بعناية واعادة تعليق الكريات مع 5 مل من الجليد الباردة FACS العازلة.
ملاحظة: لدراسة النوى وحيدات النوى الكريات البيض معا، انتقل إلى الخطوة 6.1. لدراسة الكريات البيض وحيدات النوى، انتقل إلى الخطوة 3.3. - إضافة 5 مل من 20٪ سائل الإعلام التدرج الكثافة (1.077 + 0.001 غ / مل) إلى 15 مل أنبوب بلاستيكي وتراكب ببطء تعليق الخلية على رأس وسائل الإعلام التدرج الكثافة. في حين طبقات العينة، فمن المهم عدم خلط وسائل الإعلام التدرج الكثافة مع تعليق الخلية.
- أجهزة الطرد المركزي مع الدوار سوينغ بها في 500 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 مئوية دون فرامل. من المهم جدا لإيقاف الفرامل لتجنب الخلط الخلايا ولosing التدرج. ويمكن الاطلاع على الكريات البيض في واجهة بين وسائل الإعلام كثافة التدرج وعازلة FACS.
- إزالة الطبقة العليا التي تحتوي على FACS العازلة والخلايا الحطام بعناية فائقة باستخدام ماصة. الفرقة في واجهة تحتوي الخلايا وحيدة النواة الساقطية وجزء من الكريات البيض النوى.
- نقل الخلايا في واجهة تماما إلى 15 مل جديد أنبوب من البلاستيك. إضافة على الأقل 3 مرات أكثر حجم العازلة FACS.
- أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق لبلتيز الخلايا. نضح طاف وغسل الخلايا مع العازلة FACS. بلتيز الخلايا مع الطرد المركزي أخرى في 300 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
ملاحظة: لإجراء زراعة الخلايا، انظر الخطوة 4. لإجراء فرز الخلايا، انظر الخطوة 5. لأداء المناعي، انظر الخطوة 6.
4. تطبيقات - خلية ثقافة
- إعادة تعليق الخلايا من الخطوة 3.7 في 1 مل من RPMI مستنبت 1640. عد خلايا قابلة للحياة باليودنانوغرام عداد الخلايا التلقائي أو عدادة الكريات وحل التريبان الأزرق 0.4٪.
- تضيف ما يصل مقدار RPMI مستنبت لجعل تركيز خلية من 1 × 10 6 خلية / مل. الخلايا هي الآن جاهزة للثقافة.
5. تطبيقات - عزل الضامة للثقافة الخلية الأولية
- عزل CD14 + الخلايا مغناطيسيا تسمية الخلايا من الخطوة 3.7 مع بلي CD14 (20 حبات ميكرولتر في 10 7 الخلايا)، واحتضان لمدة 15 دقيقة على 4 ج، وCD14 منفصل + خلايا من أنواع أخرى من الخلايا من خلال تطبيق مجال مغناطيسي. بعد 2 يغسل مع MACS العازلة وإزالة الحقل المغناطيسي للأرض، أزل CD14 + الخلايا الاحتفاظ مغناطيسيا مع العازلة MACS.
- بعد الطرد المركزي، إعادة تعليق الكريات خلية في RPMI مستنبت 1640. الخلايا جاهزة للطلاء (الشكل 2).
6. تطبيقات - المناعي الظاهري
- استخدام الخلايا للimmunophenotyping، اعادة تعليق الخلايا من الخطوة 3.7 في 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X. عد خلايا قابلة للحياة باستخدام عداد الخلية التلقائي أو عدادة الكريات وحل التريبان الأزرق 0.4٪.
- تسمية الخلايا مع صبغة الجدوى قابل للتثبيت (الشكل 3). غسل الخلايا مرتين مع العازلة FACS واعادة تعليق الخلايا في المخزن وصمة عار. احتضان مع مانع FCR لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- إضافة الأجسام المضادة الخلية مترافق إلى fluorochromes. على سبيل المثال، في هذا البروتوكول، استخدم مكافحة CD3، ومكافحة CD19، ومكافحة CD14، ومكافحة CD15، ومكافحة CD56 الأجسام المضادة (الجدول 1). احتضان لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
- بعد 2 يغسل مع برنامج تلفزيوني 1X، وسيتم تحليل الخلايا في 500 ميكرولتر من العازلة وصمة عار باستخدام قياس التدفق الخلوي. ويرد تمثيل استراتيجية النابضة المستخدمة لتحليل الفرعية من السكان الكريات البيض الموجودة في الأنسجة الساقطية في الشكل (4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
. يظهر تشريح الأنسجة البشرية في واجهة الأم والجنين (القاعدي الساقط والساقط الجداري) في الشكل رقم 1 ويشمل هذا الإجراء تشريح لوحة القاعدية، والذي يتضمن القاعدي الساقط (الشكل 1A - D). يتم الحصول على القاعدي الساقط عن طريق إزالة الزغب المشيمي (الجانب الجنين) من لوحة القاعدية (الشكل 1C). يتم جمع الجدارية الساقط عن طريق كشط بلطف الغشاء المشيمي (الشكل 1E - F). يبين الشكل 2 مورفولوجيا الضامة معزولة (CD14 +) التي تم جمعها من الجدارية الساقط في فترة الحمل باستخدام فرز الخلايا المغناطيسي. حافظت الضامة معزولة القدرة على إطلاق سراح السيتوكينات بعد 3 أيام من ثقافة (لا تظهر البيانات). يظهر العائد من خلايا قابلة للحياة معزولة عن القاعدي الساقط والجدارية الساقط في الشكل (3)، وأنه أكبر من 90٪ في كل منهما.
الشكل 1. الإنسان الأم والجنين واجهة: المشيمة والأغشية chorioamniotic يتم تشريح (A) لوحة القاعدية من المشيمة. يتم فصل (B) لوحة القاعدية من الزغب المشيمي. وقلص (C) المشيمة الزغب من لوحة القاعدية بما في ذلك القاعدي الساقط. (D) الساقط الباسا يتم شطف الدعاوى في برنامج تلفزيوني 1X. (E) جزء من الغشاء المشيمي يتم الحصول على وتتم إزالة جلطات الدم برفق. وكشط بلطف (F) الساقط الجداري. ويتم فصل (G) الجدارية الساقط (الخط المنقط) من الغشاء المشيمي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. الضامة ساقطي في الثقافة. الضامة (خلايا CD14 +) كانت معزولة عن الجدارية الساقط في فترة الحمل. كانت مطلية الضامة في الشرائح غرفة من البلاستيك مع RPMI1640 + 10٪ FBS + 1٪ البنسلين، الستربتوميسين + 50 نانوغرام / مل MCSF. تم التقاط الصور في وقت الطلاء (A) وبعد 3 أيام في الثقافة (C).3 / 52863fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم تحديد الشكل 3. مجموع بقاء الخلية. الجدوى من مجموع خلايا معزولة عن القاعدي الساقط والجدارية الساقط التدرج الكثافة التالي باستخدام صبغة الجدوى قابل للتثبيت (الخطوة 6.2). بقاء الخلايا المعزولة هي> 95٪ وفقا لتلطيخ بقاء الخلية الحية / الميت. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. استراتيجية المحاصرة لالكريات البيض الساقطية الفرعية من السكان. وبوابات الكريات البيضاء مع FSC وSSC. الخلايا الحية وثم بوابات وفقا لبوابة جدوى (لايف). تم فصل خلايا قابلة للحياة في نeutrophils (CD15 +) والضامة (CD14 +). ثم فصل السكان CD14-CD15- إلى مزيد من الخلايا القاتلة الطبيعية (CD3-CD56 +)، وخلايا NKT (CD3 + CD56 +)، وخلايا T (CD3 +)، والخلايا B (CD19 +). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الشكل.
تم بوابات الرقم 5. خلايا الدم البيضاء السكان الفرعية في الأنسجة الساقطية العدلات (CD15 +) والضامة (CD14 +) داخل بوابة الجدوى؛ تم بوابات خلايا T (CD3 +) والخلايا B (CD19 +) داخل بوابة CD14 CD15-. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 6. الكريات البيض النادرة السكان الفرعي في decidتم بوابات الأنسجة السياقية. الخلايا القاتلة الطبيعية (CD56 +) والخلايا NKT (CD56 + CD3 +) داخل بوابة CD14 CD15-. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| قائمة الأجسام المضادة | شركة | كتالوج رقم |
| BD Pharmingen المضادة البشرية CD56-PE-Cy7 | BD العلوم البيولوجية | 557747 |
| BD الأفق المضادة للبشرية CD15-BV605 | BD العلوم البيولوجية | 562980 |
| BD الأفق المضادة للبشرية CD14-BUV395 | BD العلوم البيولوجية | 563561 |
| BD الأفق المضادة للبشرية CD19-BUV737 | BD العلوم البيولوجية | 564303 |
| الرائعة فيوليت 650 المضادة للالبشري CD3 الأجسام المضادة | Biolegend | 317323 |
الجدول 1. قائمة الأجسام المضادة المستخدمة لالكريات البيض فرعية المناعي
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
توصيف الخصائص الفنية والمظهرية لالتسلل الكريات البيض في واجهة الأم والجنين البشري ضروري لفهم الآليات المناعية التي تؤدي إلى اضطرابات الحمل. وقد وصفت عدة تقنيات من أجل عزل الكريات البيض من واجهة الأم والجنين البشري طوال فترة الحمل 10،14،25،28،37،42،43. ومع ذلك، كل هذه التقنيات هو واضح، يستخدم الانزيمات أو مجموعات انزيم مختلفة، ويتطلب مرات التفكك مختلفة، لا تحدد كميات من الأنسجة، والأهم من ذلك، لا تحدد دائما بقاء الخلايا المعزولة. بروتوكول الموصوفة هنا يسمح للعزلة التسلل الكريات البيض في واجهة الأم والجنين البشري (القاعدي الساقط والساقط الجداري) مما أدى إلى ارتفاع العائد من الجدوى ويقدم معلومات مفصلة عن الكواشف التجارية، وإعداد العازلة، كميات الأنسجة، وحضانة مرات validaتيد في مختبرنا.
الخطوة الهامة الأولى من عملية الكريات البيض العزلة هي تفارق الأنسجة. هذه الخطوة تنطوي على إلغاء الفصل العنصري الميكانيكية و / أو تفارق الأنزيمية. يتم تنفيذ إلغاء الفصل العنصري الميكانيكية بنجاح عن طريق كشط المشيماء عندما عزل الجدارية الساقط (الشكل 1F) وتقليم الزغب المشيمي من لوحة القاعدية عندما عزل القاعدي الساقط (الشكل 1C) 10،28. ولذلك، فإن بروتوكول الموصوفة هنا يشمل كلا من الإجراءات كخطوات أولية. ومع ذلك، فمن المهم أن نرى أن لوحة القاعدية (أنسجة الأم) والزغب المشيمي (أنسجة الجنين) هي التي تعلق وثيق، والتي يمكن أن يتسبب في تلويث الكريات البيض الجنين عندما عزل الكريات البيض من القاعدي الساقط. لتجنب التلوث الجنين، وبروتوكول توصي الوثيقة غسل قلص لوحة القاعدية مرتين أو ثلاث مرات (الشكل 1D). بعد تجريف الخلية أو التشذيبمن القاعدي الساقط أو الجدارية الساقط، وقد أوصى خطوة إضافية لتصنيف الأنسجة الميكانيكية 39. ويوصى هذه الخطوة لأن الكريات البيض التسلل في واجهة صريحة جزيئات التصاق الخلية الأم والجنين أن نعلق لهم بحزم إلى المصفوفة خارج الخلية 6،7. ولذلك، فإن بروتوكول الموصوفة هنا ينطوي على تصنيف الميكانيكية مع dissociator الأنسجة التلقائي الذي يزيد من الاتساق مع توفير الوقت والعمل بالمقارنة مع تنميق التقليدي مع المشارط، شفرات الحلاقة، أو مقص جراحي 10،28.
والخطوة الثانية الحاسمة في عملية تفكك الأنسجة تفارق الأنزيمية. وقد استخدمت الانزيمات واحدة ومجموعة من الإنزيمات المختلفة لعزل الكريات البيض التسلل من القاعدي الساقط والساقط الجداري 10،14،25،28،37،42،43. في كثير من الحالات، تلك الإنزيمات على استعداد لتركيز معين باليد في مختبرحزب المحافظين قد تكون عرضة للخطأ البشري. هنا، بدلا من ذلك، وجاهزة للاستخدام كولاجيناز النقاء / محايد كوكتيل البروتيني، Accutase، تم تنفيذه في المختبر. كما انزيم التجاري، فقد تبين لتقديم نتائج يمكن الاعتماد عليها في الثقافة خلية 51. ومن المعروف Accutase (حل مفرزة الخلية) لفصل فعال الضامة من لوحات ثقافة دون كشط، والأهم من ذلك، دون أن تفقد سطح المستضدات 51. كما تم استخدام هذا الإنزيم على استعداد لمعالجة هضم أنسجة الجهاز العصبي الإنسان والحيوان، مما أدى إلى الخلايا المعزولة التي لا تزال قابلة للحياة مستدامة لفترة طويلة، مع مرور الوقت، يسمح للثقافة زنزاناتهم 52. وعلاوة على ذلك، فإن هذا الحل أيضا يحافظ استضداد CD24 في الخلايا المعزولة من أنسجة الجهاز العصبي المركزي 52. بالمقارنة مع Liberase-1، كوكتيل آخر من كولاجيناز والبروتيني محايد، لا Accutase ولا Liberase-1 توليد المجاميع DNA الحرة؛ ومع ذلك، Accutase هو زentler من Liberase-1 خلال الأنسجة التفكك 52. لهذا السبب، Accutase لا ننأى المجاميع الخلية بعد عملية الهضم 52. للتغلب على هذا القيد، وبروتوكول الموصوفة هنا يتضمن تصنيف الأنسجة التلقائي للالقاعدي الساقط والساقط الجداري قبل تفكك الأنسجة مع الحل. وقد أثبتت Accutase أيضا تفوقها إلى التربسين في الحفاظ على CD44، وهو الجذعية السرطانية سطح الخلية علامة 53. وقد لاحظ دراساتنا المختبر باستمرار أن حل مفرزة يحافظ على المستضدات السطحية. في الواقع، تم العثور على الاختلافات بين اضطرابات الحمل والحمل الطبيعية في التعبير عن العديد من علامات الخلية والخلايا في الضامة (CD14 + الخلايا)، العدلات (CD15 + الخلايا)، خلايا T (CD3 + الخلايا)، والخلايا B (CD19 + الخلايا)، بما في ذلك CD80، CD86، CD163، CD209، ICAM3، CD45RO، CD45RA، CXCR3، CCR7، CCR6، CD4، CD8، CD25، FOXP3، CD24، CD38، CD27، CD38، CD43، CD23، الغلوبولين المناعي، الجمعية الإسلامية، CD5، T-الرهان، GATA-3، وRORγt، والافراج عن خلوى. ولذلك، فإن بروتوكول الموصوفة هنا هو الأمثل لالمناعي من الكريات البيض التسلل في واجهة الأم والجنين البشري كما هو مبين في نتائج تمثيلية.
ومن المزايا المهمة لبروتوكول الموصوفة هنا هو أنه يتيح لعزل الكريات البيض مع ارتفاع العائد من خلايا قابلة للحياة. وتظهر البيانات أن التمثيلي> 90٪ من خلايا منعزلة قابلة للتطبيق. ولهذا الأمر أهمية كبيرة كما يسمح هذا البروتوكول دراسة الخصائص الوظيفية للخلايا معزولة عن الأنسجة البشرية في واجهة الأم والجنين. على سبيل المثال، تم إجراء ثقافات الضامة الساقطية ودراسة الافراج خلوى في إطار التحفيز باستخدام هذا البروتوكول.
لتحقيق نتائج ناجحة باستخدام بروتوكول وصفها، من المهم النظر في العوامل التالية: 1) collecti الأنسجةعلى يجب أن يؤديها في غضون 1-2 ساعة بعد الولادة، ويجب أن توضع هذه الأنسجة في وعاء مع برنامج تلفزيوني 1X في 4 ° C للحفاظ على سلامة الخلايا المعزولة. يجب 2) أن يؤديها تصنيف الأنسجة الميكانيكية باستخدام الخالط التلقائي في بعض الأحيان التحقق من صحتها، كما هو موضح في هذا البروتوكول. 3) يجب أن تكون مدة الحضانة مع الحل مفرزة الخلية أقل من 1 ساعة منذ نشاطها بعد يقلل هذا الوقت. 4) يجب المحافظة على درجة حرارة الحضانة مع الحل انفصال الخلايا عند 37 درجة مئوية للحصول على النشاط الأمثل لهذا الأنزيم. 5) يجب أن يتم التلاعب بيليه خلية بلطف مع بال micropipettes لاستخدام دوامة يمكن أن تلحق الضرر على سلامة الخلايا (تذكر أن الخلايا المعزولة يمكن التلاعب متباينة ومفاجئ بسهولة خفض قدرتها على الاستمرار)؛ 6) العازلة ويجب أن تبقى درجات الحرارة الطرد المركزي في نفس درجة حرارة تعليق الخلية؛ 7) يجب أن تتم معالجة الخلايا المعزولة لالمناعي أو استخدام immedi¢ الأمر كما يقلل من حيويتها بسرعة؛ و8) عند تنفيذ المناعي، ويجب الحصول العينات باستخدام تدفق عداد الكريات على الفور للحصول على أفضل النتائج.
واحدة من القيود من هذا البروتوكول هو تكلفة Accutase، التي هي أكثر تكلفة من الإنزيمات الأخرى مع وظائف مماثلة، على سبيل المثال، التربسين، dispase الثاني، وكولاجيناز. ومع ذلك، فإن المزايا التي Accutase يعرض اكثر بكثير من تلك الأنزيمات هي متفوقة. والقيد الثاني من البروتوكول هو شرط لdissociator الأنسجة التلقائي، وهي ليست صك مختبر مشترك، وبالتالي يمكن أن يكون مكلفا. للتغلب على هذا القيد، وإلغاء الفصل العنصري الأنسجة ويمكن أيضا أن يقوم باستخدام مقص جراحي الصغيرة؛ ومع ذلك، لا يمكن أن يتجاوز هذه الخطوة 3-5 دقائق منذ أثبتت فترات أطول للحد من العائد من خلايا قابلة للحياة. يجب أن يؤديها كل dissociations من قبل الباحث نفسه للحد من التقلبات.
وباختصار، فإن المواليةtocol تقدم هذه الوثيقة نهجا جديدا يجمع بين استخدام تقنيات تفارق الأنسجة لطيف الميكانيكية والأنزيمية للحفاظ على سلامة علامات خارج الخلية والخلايا في الكريات البيض معزولة عن الأنسجة البشرية في واجهة الأم والجنين. وبصرف النظر عن المناعي، زراعة الخلايا، والفرز الخلية، والتطبيقات المستقبلية من هذا البروتوكول عديدة ومتنوعة. لقد تم بنجاح باستخدام هذا البروتوكول لعزل الكريات البيض ساقطي لفي الدراسات المختبرية وظيفة الكريات البيض (أي سمية الخلايا وانتشار الخلايا T-واللدونة، وما إلى ذلك)، وإنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية في الكريات البيض معزولة عن الأنسجة الساقطية (البيانات لا معروضة). في الواقع، وذلك باستخدام بروتوكول وصفها، لقد كان مختبرنا قادرا على وصف الكريات البيض جديدة ونادرة في واجهة الأم والجنين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل معهد كينيدي شرايفر يونيس الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية، NIH / DHHS. وأيد هذا العمل أيضا، في جزء منه، من خلال مبادرة جامعة واين ستيت في فترة ما حول الولادة صحة الأم وفترة ما حول الولادة وصحة الطفل. نحن نعترف بامتنان مورين McGerty (جامعة ولاية واين) لها قراءات نقدية للمخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection | |||
| Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers | Any vendor | 20012-027 | |
| 1X phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | (1X PBS) | |
| Large and small Petri dishes | Any vendor | ||
| Dissociation | |||
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | (cell detachment solution) |
| Sterile 2 ml safe-lock conical tubes | Any vendor | ||
| 50 ml conical centrifuge tubes | Any vendor | ||
| 100 µm cell strainers | FALCON/Corning | 352360 | |
| 5 ml round bottom polystyrene test tubes | Any vendor | ||
| Transfer pipettes | Any vendor | ||
| C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| Cell Culture | |||
| RPMI culture medium 1640 | Life Technologies | 22400-089 | (1X) (10% FBS and 1% P/S) |
| Plastic chamber slides | Thermo Scientific | 177437 | |
| Incubator | Thermo Scientific Corporation | HEPA Class 100 | |
| Water bath | Fisher Scientific | ISOTEMP 110 | |
| Cell counter | Nexelcom | Cellometer Auto2000 | |
| Microscope | Olympus | Olympus CKX41 | |
| Cell Separation | |||
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Cell separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| 30 μm pre-separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-40 | |
| Multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 15 ml safe-lock conical tubes | Any Vendor | ||
| MACS buffer | (0.5% bovine serum albumin, 2 mM EDTA and 1X PBS) | ||
| Reagents | |||
| FcR Blocking | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | (Fc Block) |
| Anti-human cell surface antigen antibodies | BD Biosciences | (Table 1) | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| LIVE/DEAD viability dye | BD Biosciences | 564406 | |
| Lyse/Fix buffer | BD Biosciences | 346202 | |
| FACS buffer | (0.1% BSA, 0.05% Sodium Azide, and 1X PBS, pH=7.4) | ||
| Staining buffer | BD Biosciences | 554656 | |
| Trypan Blue solution 0.4% | Life Technologies | 15250-011 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | 20% density gradient media (1.077 + 0.001 g/ml) |
| Additional Instruments | |||
| Incubator with shaker | Thermo Scientific | MAXQ 4450 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSR-Fortessa | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | SpinChron DLX | |
| Vacuum system | Any vendor | ||
| Automatic tissue dissociator | Miltenyi Biotec | gentleMACS Dissociator | |
References
- Kelly, R. W.
- Keelan, J. A., et al. Cytokines, prostaglandins and parturition--a review. Placenta. 24, Suppl A. S33-S46 (2003).
- Romero, R., et al. Inflammation in preterm and term labour and delivery. Semin Fetal Neonatal Med. 11 (5), 317-326 (2006).
- Norman, J. E., Bollapragada, S., Yuan, M., Nelson, S. M.
- Mor, G., Cardenas, I. The immune system in pregnancy: a unique complexity. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 425-433 (2010).
- Gomez-Lopez, N., Guilbert, L. J., Olson, D. M. Invasion of the leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy. J Leukoc Biol. 88 (4), 625-633 (2010).
- Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. A., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol. , (2014).
- Bulmer, J. N., Morrison, L., Longfellow, M., Ritson, A., Pace, D. Granulated lymphocytes in human endometrium: histochemical and immunohistochemical studies. Hum Reprod. 6 (6), 791-798 (1991).
- Bulmer, J. N., Williams, P. J., Lash, G. E.
- Sindram-Trujillo, A., Scherjon, S., Kanhai, H., Roelen, D., Claas, F. Increased T-cell activation in decidua parietalis compared to decidua basalis in uncomplicated human term pregnancy. Am J Reprod Immunol. 49 (5), 261-268 (2003).
- Red-Horse, K., et al. Trophoblast differentiation during embryo implantation and formation of the maternal-fetal interface. J Clin Invest. 114 (6), 744-754 (2004).
- Erlebacher, A.
- Christiansen, O. B.
- Vince, G. S., Starkey, P. M., Jackson, M. C., Sargent, I. L., Redman, C. W. Flow cytometric characterisation of cell populations in human pregnancy decidua and isolation of decidual macrophages. J Immunol Methods. 132 (2), 181-189 (1990).
- Trundley, A., Moffett, A. Human uterine leukocytes and pregnancy. Tissue Antigens. 63 (1), 1-12 (2004).
- Richards, R. G., Brar, A. K., Frank, G. R., Hartman, S. M., Jikihara, H. Fibroblast cells from term human decidua closely resemble endometrial stromal cells: induction of prolactin and insulin-like growth factor binding protein-1 expression. Biol Reprod. 52 (3), 609-615 (1995).
- Rango, U. Fetal tolerance in human pregnancy--a crucial balance between acceptance and limitation of trophoblast invasion. Immunol Lett. 115 (1), 21-32 (2008).
- Robson, A., et al. Uterine natural killer cells initiate spiral artery remodeling in human pregnancy. FASEB J. 26 (12), 4876-4885 (2012).
- Lima, P. D., Zhang, J., Dunk, C., Lye, S. J., Anne Croy,, B, Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy. Cell Mol Immunol. , (2014).
- Aluvihare, V. R., Kallikourdis, M., Betz, A. G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat Immunol. 5 (3), 266-271 (2004).
- Thomson, A. J., et al. Leukocytes infiltrate the myometrium during human parturition: further evidence that labour is an inflammatory process. Hum Reprod. 14 (1), 229-236 (1999).
- Young, A., et al. Immunolocalization of proinflammatory cytokines in myometrium, cervix, and fetal membranes during human parturition at term. Biol Reprod. 66 (2), 445-449 (2002).
- Osman, I., et al. Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term. Mol Hum Reprod. 9 (1), 41-45 (2003).
- Hamilton, S., et al. Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor. Biol Reprod. 86 (2), 39 (2012).
- Gomez-Lopez, N., et al. Evidence for a role for the adaptive immune response in human term parturition. Am J Reprod Immunol. 69 (3), 212-230 (2013).
- Hamilton, S. A., Tower, C. L., Jones, R. L. Identification of chemokines associated with the recruitment of decidual leukocytes in human labour: potential novel targets for preterm labour. PLoS One. 8 (2), e56946 (2013).
- Sindram-Trujillo, A. P., et al. Differential distribution of NK cells in decidua basalis compared with decidua parietalis after uncomplicated human term pregnancy. Hum Immunol. 64 (10), 921-929 (2003).
- Repnik, U., et al. Comparison of macrophage phenotype between decidua basalis and decidua parietalis by flow cytometry. Placenta. 29 (5), 405-412 (2008).
- Sanguansermsri, D., Pongcharoen, S. Pregnancy immunology: decidual immune cells. Asian Pac J Allergy Immunol. 26 (2-3), 171-181 (2008).
- Houser, B. L. Decidual macrophages and their roles at the maternal-fetal interface. Yale J Biol Med. 85 (1), 105-118 (2012).
- Tamiolakis, D., et al. Human decidual cells activity in women with spontaneous abortions of probable CMV aetiology during the first trimester of gestation. An immunohistochemical study with CMV-associated antigen. Acta Medica (Hradec Kralove). 47 (3), 195-199 (2004).
- Williams, P. J., Bulmer, J. N., Searle, R. F., Innes, B. A., Robson, S. C. Altered decidual leucocyte populations in the placental bed in pre-eclampsia and foetal growth restriction: a comparison with late normal pregnancy. Reproduction. 138 (1), 177-184 (2009).
- Eide, I. P., et al. Serious foetal growth restriction is associated with reduced proportions of natural killer cells in decidua basalis. Virchows Arch. 448 (3), 269-276 (2006).
- Brown, M., Wittwer, C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin Chem. 46 (8 Pt 2), 1221-1229 (2000).
- He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor flow cytometry analyses of cellular immune response in rhesus macaques. J Vis Exp. (38), (2010).
- Jaso, J. M., Wang, S. A., Jorgensen, J. L., Lin, P. Multi-color flow cytometric immunophenotyping for detection of minimal residual disease in AML: past, present and future. Bone Marrow Transplant. 49 (9), 1129-1138 (2014).
- Ritson, A., Bulmer, J. N. Isolation and functional studies of granulated lymphocytes in first trimester human decidua. Clin Exp Immunol. 77 (2), 263-268 (1989).
- Nagaeva, O., Bondestam, K., Olofsson, J., Damber, M. G., Mincheva-Nilsson, L. An optimized technique for separation of human decidual leukocytes for cellular and molecular analyses. Am J Reprod Immunol. 47 (4), 203-212 (2002).
- Male, V., Gardner, L., Moffett, A. Chapter 7. Isolation of cells from the feto-maternal interface. Curr Protoc Immunol. (UNIT 7.40), Wiley Online Library. 41-11 (2012).
- Soares, M. J., Hunt, J. S. Placenta and trophoblast: methods and protocols overview II. Methods Mol Med. 122, 3-7 (2006).
- Ritson, A., Bulmer, J. N. Extraction of leucocytes from human decidua. A comparison of dispersal techniques. J Immunol Methods. 104 (1-2), 231-236 (1987).
- White, H. D., et al. A method for the dispersal and characterization of leukocytes from the human female reproductive tract. Am J Reprod Immunol. 44 (2), 96-103 (2000).
- Maruyama, T., et al. Flow-cytometric analysis of immune cell populations in human decidua from various types of first-trimester pregnancy. Hum Immunol. 34 (3), 212-218 (1992).
- Zhang, J., et al. Isolation of lymphocytes and their innate immune characterizations from liver, intestine, lung and uterus. Cell Mol Immunol. 2 (4), 271-280 (2005).
- Carlino, C., et al. Recruitment of circulating NK cells through decidual tissues: a possible mechanism controlling NK cell accumulation in the uterus during early pregnancy. Blood. 111 (6), 3108-3115 (2008).
- Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Mol Reprod Dev. 75 (5), 818-827 (2008).
- Zhang, P., Wu, X., Hu, C., Wang, P., Li, X. Rho kinase inhibitor Y-27632 and Accutase dramatically increase mouse embryonic stem cell derivation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 48 (1), 30-36 (2012).
- Snegovskikh, V. V., et al. Intra-amniotic infection upregulates decidual cell vascular endothelial growth factor (VEGF) and neuropilin-1 and -2 expression: implications for infection-related preterm birth. Reprod Sci. 16 (8), 767-780 (2009).
- Oliver, C., Cowdrey, N., Abadia-Molina, A. C., Olivares, E. G. Antigen phenotype of cultured decidual stromal cells of human term decidua. J Reprod Immunol. 45 (1), 19-30 (1999).
- Chang, Y., Hsieh, P. H., Chao, C. C. The efficiency of Percoll and Ficoll density gradient media in the isolation of marrow derived human mesenchymal stem cells with osteogenic potential. Chang Gung Med J. 32 (3), 264-275 (2009).
- Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. , 670-672 (2014).
- Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
- Quan, Y., et al. Impact of cell dissociation on identification of breast cancer stem cells. Cancer Biomark. 12 (3), 125-133 (2012).
