Abstract
Graviditet er karakteriseret ved infiltrering af leukocytter i de reproduktive væv og ved maternel-føtal grænseflade (decidua basalis og decidua parietalis). Dette interface er den anatomiske kontaktstedet mellem maternal og føtale væv; derfor er det et immunologisk virkningssted under graviditet. Infiltrerende leukocytter på maternel-føtal grænseflade spiller en central rolle i implantation, graviditet vedligeholdelse, og timingen af levering. Derfor vil fænotypiske og funktionelle karakterisering af disse leukocytter give indsigt i de mekanismer, der fører til graviditet lidelser. Adskillige protokoller er blevet beskrevet for at isolere infiltrerende leukocytter fra decidua basalis og decidua parietalis; Men den manglende sammenhæng i de reagenser, enzymer og tidspunkter inkubation gør det vanskeligt at sammenligne disse resultater. Beskrevet heri er en ny tilgang, der kombinerer brugen af blide mekaniske og enzymatiske dissociation teknikker til at bevare levedygtigheden og integriteten af ekstracellulære og intracellulære markører i leukocytter isoleret fra humane væv ved maternel-føtal interface. Bortset fra immunfænotypebestemmelse, cellekultur, og celle sortering, de fremtidige anvendelser af denne protokol er mange og varierede. Efter denne protokol, kan de isolerede leukocytter anvendes til at bestemme DNA-methylering, ekspression af målgener, in vitro leukocyt-funktionalitet (dvs. fagocytose, cytotoksicitet, T-celleproliferation, og plasticitet, etc.), og produktionen af reaktive oxygenarter ved maternel-føtal interface. Derudover anvendelse af den beskrevne protokol, har dette laboratorium kunnet beskrive nye og sjældne leukocytter ved maternel-føtal interface.
Introduction
Graviditet er karakteriseret ved tre særskilte immunologiske faser: 1) implantation og tidlig placentation forbundet med en pro-inflammatorisk reaktion (dvs. implantation ligner en "åbent sår"); 2) det andet trimester og det meste af tredje trimester af graviditeten, hvor immun homøostase opnås gennem en overvejende anti-inflammatorisk staten på maternel-føtal interface; og 3) fødsel, en pro-inflammatorisk tilstand 1-7. Immunceller spiller en vigtig rolle i reguleringen af det inflammatoriske respons ved maternel-føtal grænseflade, hvor deres overflod og lokalisering forandring hele graviditeten 6-9.
Hos mennesker, den maternelle-føtale grænseflade udgør et område med direkte kontakt mellem moderens (decidua) og føtal (chorion eller trofoblasten) væv. Denne grænseflade omfatter: 1) decidua parietalis at linjer livmoderhulen ikke er omfattet af placenta og er i sammenstillingtil chorion laeve; og 2) decidua basalis, der ligger i rodklumpen af moderkagen, hvor det er invaderet af interstitielle trofoblaster 10 (figur 1). Intimitet af disse områder af kontakt skaber betingelser for føtal antigen eksponering moderens immunsystem 11-13. Ikke overraskende leukocytter omfatte op til 30-40% af de moderhindeceller 8,9,14,15 udover typiske stromale-type celler og kirtelceller 8,14,16. Rollen af leukocytter på maternel-føtal grænseflade omfatter flere processer, der omfatter begrænsning af trofoblast invasion 17, ombygning af spiral arterier 18,19, vedligeholdelse af maternel tolerance 12,20, og indledning af arbejdskraft 21-26. Leukocytter af både det adaptive og medfødte lemmer i immunsystemet, dvs. T-celler, makrofager, neutrofiler, B-celler, dendritiske celler og NK-celler, er blevet identificeret i de decidua væv, og deresproportioner og status aktivering har vist sig at variere rumligt og tidsligt hele drægtighedsperioden 6-10,12,14,24,27-30. Forstyrrelser i leukocyt befolkning og / eller funktion er forbundet med spontan abort 31, præeklampsi 32, intrauterin vækst begrænsning 32,33, og for tidlig fødsel 7,24. Derfor vil undersøgelsen af de fænotypiske egenskaber og funktionalitet af leukocytter på menneskelige maternel-føtal grænseflade lette opklaringen af de immunologiske veje dysreguleret i graviditet lidelser.
En af de mest kraftfulde værktøjer, der anvendes til at bestemme fænotype og funktionelle egenskaber af leukocytter er flowcytometri, teknologi, der tillader kvantitativ analyse af flere parametre samtidigt 34-36. At analysere leukocytter ved flowcytometri, er isolation af leukocytterne i en enkelt-cellesuspension påkrævet. Derfor, for at en metode adskille infiltrere leukocytes fra maternel-føtal interface er nødvendig for at studere deres fænotypiske og funktionelle egenskaber.
Adskillige metoder er blevet beskrevet at isolere leukocytter fra den humane maternel-føtal grænseflade 10,14,25,27,37-39. Mens nogle anvender mekanisk opdeling 10,25,27,38, andre bruger enzymatisk fordøjelse 37,40 for væv dissociation. Fordi mekanisk disaggregering frembringer et lavere udbytte og nedsat levedygtighed 41, og enzymatisk dissociation kan påvirke levedygtigheden og celleoverflademarkør fastholdelse 42, den heri beskrevne fremgangsmåde kombinerer forsigtig mekanisk dissociering med enzymatisk forbehandling for at forøge udbyttet af isolerede leukocytter uden at kompromittere cellelevedygtighed. En lignende kombination af metoder er blevet påvist at være effektive til isolering af leukocytter fra decidua væv på maternel-føtal grænseflade 39. Derfor protokollen beskrevet heri involverer mechanisk opdeling med en automatisk væv dissociator der øger konsistens og samtidig spare tid og arbejdskraft i forhold til traditionelle hakning med modsatrettede skalpeller, barberblade eller kirurgiske sakse 10,28. Enzymet er valgt til væv dissociation var Accutase. I modsætning til almindeligt anvendte collagenase 43, dispase 44, og trypsin 45, Accutase (en celle løsrivelse opløsning) kombinerer både generel proteolytiske og collagenolytiske aktiviteter, der bidrager til en effektiv endnu blid dissociation 46,47. Efter dissociation, er leukocytter beriget fra den samlede befolkning i de moderhindeceller ved densitetsgradientcentrifugering. Forskellige densitetsgradient medier er tidligere blevet udnyttet, det mest almindelige er Percoll (en suspension af kolloide silicapartikler) 48 og Ficoll (en polymer af saccharose med en høj syntetisk molekylvægt) 49. Den overlegne effektivitet isolering ved saccharose polymer har været previously vist 50, og protokollen beskrevne yderligere beviser, at denne densitetsgradient medier giver en tilstrækkelig høj renhed af mononukleære leukocytter.
Derfor protokollen beskrevet heri kombinerer den mekaniske væv disaggregering med en automatisk væv dissociator, enzymatisk behandling med en celle løsrivelse opløsning og leukocyt adskillelse med en densitetsgradient medier (1,077 + 0,001 g / ml) for at isolere leukocytter fra humane decidua væv. Denne protokol er blevet vist at bevare celleoverfladeantigener sammen med cellelevedygtighed. De isolerede leukocytter kan anvendes til flere applikationer, der omfatter immunofænotypebestemmelse med flowcytometri og funktionelle undersøgelser in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol er passende for leukocyt isolation fra decidua basalis og decidua parietalis i forberedelse til immunfænotypebestemmelse ved flowcytometri. Endvidere kan de isolerede celler anvendes til cellesortering, cellekultur, RNA-isolering, og cytologi. Før du arbejder med de i denne protokol prøver, skal human etisk godkendelse indhentes fra den lokale Research etiske komité og Institutional Review Boards. Den indsamling og udnyttelse af humane prøver til forskningsformål blev godkendt af Institutional Review Boards i Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), Department of Health og Human Services (DHHS , Bethesda, MD, USA) og Wayne State University (Detroit, MI, USA). Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle gravide kvinder før indsamlingen af vævsprøver.
BEMÆRK: Når du arbejder med dyreblod, celler, eller fareskellige midler som nævnt i denne protokol, er det vigtigt, at ordentlig biosikkerhed og laboratorie sikkerhedstiltag følges.
1. Dissektion af Human decidua væv
BEMÆRK: rodklumpen er base under og fastgjort til moderkagen og repræsenterer den maternelle overflade. De chorioamniotic membraner indbefatter amnion'en og chorion. Rodklumpen omfatter decidua basalis og chorion omfatter decidua parietalis (figur 1).
- Decidua Basalis
- Dissekere et stykke af rodklumpen fra en kimblad af moderkagen (figur 1A og 1B).
- Placere den på en steril skærebræt med placentale villi vender opad. Den side, der viser den placentale villi er normalt blodig rød med behårede væv i udseende. Rodklumpen er glat og bleg rød i farven.
- Bruge skarpe, fine-punkts saks og pincet til at fjerne villskellige væv og blodkar. Hold vævet dyppet i 1x PBS (Ca 2+ - og Mg2 + - fri) under processen (figur 1C). Saml 2 til 3 af disse stykker og skyl dem grundigt med 1x PBS for at fjerne blodet (figur 1D).
- Decidua Parietalis
- Dissekere et stykke af de chorioamniotic membraner (ca. 10 cm x 10 cm, Figur 1E). Placere den på brættet med chorion opad. Den chorion side indeholder blodige blodpropper og er normalt let gullig farve.
- Bruge fin-punkts pincet til at fjerne så mange af blodpropper som muligt (figur 1E). Skyl membranen i steril 1 x PBS at rense overskydende blod fra membranen, indtil 1x PBS er klart.
- Brug en engangs steril celleskraber til forsigtigt at skrabe decidua lag fra membranen. Anvend sterilt 1x PBS på membran, mens du gennemfører denne proces (figur 1F). Saml de decidua væv og placere dem i et 50 ml plastrør med sterilt 1x PBS (figur 1G).
2. Mekanisk Disaggregering og enzymatisk nedbrydning
- Vask væv dissekeret fra decidua basalis (fra trin 1.1.3) eller decidua parietalis (fra trin 1.2.3) med sterilt 1x PBS i et 50 ml plastrør. Indsamle væv pellets ved centrifugering ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Aspirer supernatanten placeret over vævet pellet forsigtigt uden at forstyrre pelleten.
BEMÆRK: På dette tidspunkt, pellets er meget løs, fordi de indeholder røde blodlegemer. Hvis rumfanget af pelleten er omkring eller mindre end 3 ml, resuspender pellet i 6 ml Cellefrigørelse opløsning præ-opvarmet til 37 ° C. Hvis pillen er større end 3 ml volumen, tilføje mere celle løsrivelse løsning (tilføje omkring 2 gange the volumen af vævsprøverne). - Overfør homogeniserede væv (decidua basalis + Cellefrigørelse løsning eller decidua parietalis + celle detachement opløsning) til en C rør.
- Placer C røret i den automatiske dissociator og køre det tilsvarende program.
BEMÆRK: Programmet for decidua basalis løber i 17 sek med 668 i alt runder pr løb. Programmet for de decidua parietalis løber i 37 sek med 235 i alt runder pr løb. Disse programmer er blevet tilpasset for at isolere leukocytter fra decidua basalis eller decidua parietalis med godt udbytte og levedygtighed celle. - Efter den mekaniske opdeling af væv, fordøje væv med en kommercielt tilgængelig celle løsrivelse løsning såsom Accutase; (En cocktail, der indeholder proteolytiske og collagenolytiske enzymer) i 45 minutter ved 37 ° C under forsigtig omrøring.
3. Isolering af leukocytter
- Efter inkubering tilsættes 10 ml 1x PBS til Digeforbrændingen blandingen og ledes gennem en 100 um cellefilter i et 50 ml plastrør. Afhængigt af klæbrigheden af fordøjelsen blandingen, kan man bruge flere celle sier for en blanding.
- Fyld røret med 1x PBS og centrifugeres ved 300 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Fjern 1x PBS ovenfor cellepellets omhyggeligt og genopslæmmes pellets med 5 ml iskold FACS buffer.
BEMÆRK: For at studere polymorfonukleære og mononukleære leukocytter sammen, gå til trin 6.1; at studere mononukleære leukocytter, fortsætte til trin 3.3. - Tilsæt 5 ml 20% densitetsgradient medier (1,077 + 0,001 g / ml) til et 15 ml plastrør og langsomt overlay cellesuspensionen oven på densitetsgradient medier. Mens lagdeling prøven, er det vigtigt ikke at blande densitetsgradient medier med cellesuspensionen.
- Centrifuge med en swing-out-rotor ved 500 xg i 30 minutter ved 4 C uden bremsen. Det er meget vigtigt at slukke bremsen for at undgå at blande cellerne og losing gradienten. Leukocytter vil blive fundet i grænsefladen mellem densitetsgradient medierne og FACS-buffer.
- Fjern det øvre lag, der indeholder det FACS buffer og cellerester meget forsigtigt med en pipette. Båndet ved grænsefladen indeholder decidua mononukleære celler og en del af de polymorfkernede leukocytter.
- Overfør cellerne ved grænsefladen helt til en ny 15 ml plastrør. Tilsæt mindst 3 gange mere volumen af FACS buffer.
- Centrifuger ved 300 x g i 5 min til pelletering af cellerne. Aspirere supernatanten og vask af cellerne med FACS-buffer. Pelletering af cellerne med en anden centrifugering ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: For at udføre cellekultur, se trin 4. For at udføre celle sortering, se trin 5. For at udføre immunfænotypebestemmelse, se trin 6.
4. Ansøgninger - Cell kultur
- Re-suspendere cellerne fra trin 3.7 i 1 ml RPMI dyrkningsmedium 1640. Tæl levedygtige celler using en automatisk celletæller eller et hæmocytometer og et trypanblåt opløsning 0,4%.
- Tilføj op mængden af RPMI dyrkningsmedium for at gøre en cellekoncentration på 1 x 10 6 celler / ml. Celler er nu klar til kulturen.
5. Ansøgninger - Isolering af makrofager til primær cellekultur
- For at isolere CD14 + celler, magnetisk mærke cellerne fra trin 3.7 med CD14 mikroperler (20 pi perler pr 10 7 celler), inkuberes i 15 minutter ved 4 ° C, og separat CD14 + celler fra andre typer af celler ved at påføre et magnetfelt. Efter 2 vaske med MACS puffer og fjernelse af det magnetiske felt, elueres magnetisk tilbageholdte CD14 + celler med MACS buffer.
- Efter centrifugering, resuspender cellepellets i RPMI dyrkningsmedium 1640. Cellerne er klar til udpladning (figur 2).
6. Ansøgninger - immunfænotypebestemmelse
- Hvis du vil bruge celler til immunophenotyping, re-suspendere cellerne fra trin 3.7 i 1 ml 1x PBS. Tæl levedygtige celler under anvendelse af en automatisk celletæller eller et hæmocytometer og et trypanblåt opløsning 0,4%.
- Mærk af cellerne med en fixable viabilitetsfarvestoffet (figur 3). Vask cellerne to gange med FACS buffer og re-suspendere cellerne i pletten buffer. Inkuberes med en FcR blokker i 15 minutter ved 4 ° C.
- Tilføj ekstracellulære antistoffer konjugeret til fluorochromer. For eksempel, i denne protokol, bruge anti-CD3, anti-CD19, anti-CD14, anti-CD15 og anti-CD56-antistoffer (tabel 1). Der inkuberes i 30 minutter ved 4 ° C i mørke.
- Efter 2 vaske med 1x PBS, vil cellerne blive analyseret i 500 pi pletten puffer under anvendelse af en flowcytometer. En repræsentation af gating-strategi anvendt til at analysere leukocyt subpopulationer fundet i decidua væv er vist i figur 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
. Dissektion af humane væv ved maternel-føtal grænseflade (decidua basalis og decidua parietalis) er vist i figur 1 Denne procedure omfatter dissektion af rodklumpen, som omfatter decidua basalis (figur 1A - D). Decidua basalis opnås ved fjernelse af placenta villi (føtal side) fra rodklumpen (figur 1C). Decidua parietalis opsamles ved forsigtigt at skrabe den chorion membran (figur 1E - F). Figur 2 viser morfologien af isolerede makrofager (CD14 +) indsamlet fra decidua parietalis i et begreb graviditet anvender magnetisk cellesortering. Isolerede makrofager opretholdt evnen til at frigive cytokiner efter 3 dages dyrkning (data ikke vist). Udbyttet af levedygtige celler isoleret fra decidua basalis og decidua parietalis er vist i figur 3, og det er større end 90% i begge.
Figur 1. Humant maternel-føtal interface:. Placenta og chorioamniotic membraner (A) Basal plade dissekeres fra placenta; (B) rodklumpen er adskilt fra placentale villi; (C) placental villi trimmes fra rodklumpen herunder decidua basalis; (D) decidua basa lis skylles i 1x PBS; (E) et fragment af chorion membran opnås og blodpropper forsigtigt fjernet; (F) decidua parietalis forsigtigt skrabet; og (G) decidua parietalis (stiplet linie) er adskilt fra chorion membran. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. decidua makrofager i kultur. Makrofager (CD14 + celler) blev isoleret fra decidua parietalis på sigt graviditet. Makrofager blev udpladet i plast chamber slides med RPMI1640 + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin + 50 ng / ml MCSF. Billeder blev taget på tidspunktet for plettering (A) og efter 3 dage i kultur (C).3 / 52863fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Samlet cellelevedygtighed. Levedygtighed af totale celler isoleret fra decidua basalis og decidua parietalis bestemtes følgende densitetsgradient under anvendelse af en fixable viabilitetsfarvestoffet (trin 6.2). Levedygtighed isolerede celler er> 95% ifølge levedygtigheden levende / døde cellefarvning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Gating strategi for decidua leukocyt delpopulationer. Leukocytter blev gated med FSC og SSC. Levende celler blev derefter gated ifølge levedygtighed gate (Live). Levedygtige celler blev separeret i neutrophils (CD15 +) og makrofager (CD14 +). CD14-CD15- befolkning blev derefter yderligere separeret i NK-celler (CD3-CD56 +), NKT celler (CD3 + CD56 +), T-celler (CD3 +) og B-celler (CD19 +). Klik her for at se en større version af dette figur.
. Figur 5. Leukocyt- subpopulationer i decidua væv Neutrofiler (CD15 +) og makrofager (CD14 +) blev gated inden levedygtighed porten; T-celler (CD3 +) og B-celler (CD19 +) blev gated i CD14-CD15- gate. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Sjælden leukocyt subpopulationer i decidduelle væv. NK-celler (CD56 +) og NKT-celler (CD56 + CD3 +) blev gated i CD14-CD15- gate. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Antistof liste | Firma | Butik No. |
| BD Pharmingen Anti-humant CD56-PE-Cy7 | BD Biosciences | 557.747 |
| BD Horizon Anti-humant CD15-BV605 | BD Biosciences | 562.980 |
| BD Horizon Anti-humant CD14-BUV395 | BD Biosciences | 563.561 |
| BD Horizon Anti-humant CD19-BUV737 | BD Biosciences | 564.303 |
| Brilliant Violet 650 Anti-humant CD3 antistof | Biolegend | 317.323 |
Tabel 1. Liste over antistoffer anvendes til leukocyt delmængde immunfænotypebestemmelse
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Karakterisering af de funktionelle og fænotypiske egenskaber af infiltrerende leukocytter ved den humane maternel-føtal grænseflade er afgørende for forståelsen af de immunmekanismer, der fører til graviditet lidelser. Adskillige teknikker er blevet beskrevet for at isolere leukocytter fra humant maternel-føtal grænseflade hele graviditeten 10,14,25,28,37,42,43. Men hver af disse teknikker er selvstændig, anvender forskellige enzymer eller enzym-kombinationer, kræver forskellige dissociation tidspunkter, specificerer ikke mængder væv, og, vigtigst af alt, ikke altid angiver levedygtigheden af de isolerede celler. Den her beskrevne protokol tillader isolering af infiltrerende leukocytter på den menneskelige maternel-føtal grænseflade (decidua basalis og decidua parietalis) resulterer i et højt udbytte af levedygtighed og indeholder detaljerede oplysninger om de kommercielle reagenser, forberedelse buffer, væv mængder, og inkubationstider validated i vores laboratorium.
Den første kritiske trin af leukocyt isolation processen er væv dissociation; dette skridt indebærer mekanisk kønsopdeling og / eller enzymatisk dissociation. Mekanisk desegregering er positivt resultat ved at skrabe chorion når isolere decidua parietalis (figur 1F), og ved at trimme den placentale villi fra rodklumpen når isolere decidua basalis (Figur 1C) 10,28. Derfor protokollen beskrevet heri omfatter både procedurer som indledende skridt. Men det er vigtigt at overveje, at den basale plade (maternelle væv) og placenta villi (fostervæv) intimt er fastgjort, som kan forårsage forurening af føtale leukocytter når isolere leukocytter fra decidua basalis. For at undgå føtal forurening, protokollen anbefaler heri vaske den trimmede basal plade to eller tre gange (figur 1D). Efter celle skrabende eller trimningfra decidua basalis eller decidua parietalis har et yderligere skridt for mekanisk væv opdeling blevet anbefalet 39. Anbefales dette skridt, fordi de infiltrerende leukocytter ved de maternelle-føtale grænseflade express celleadhæsionsmolekyler som fast vedhæfte dem til den ekstracellulære matrix 6,7. Derfor protokollen beskrevet heri involverer den mekaniske opdeling med en automatisk væv dissociator der øger konsistens og samtidig spare tid og arbejdskraft i forhold til traditionelle hakning med skalpeller, barberblade eller kirurgiske sakse 10,28.
Et andet afgørende skridt i vævet dissociation processen er enzymatisk dissociation. Enkelt enzymer og en kombination af forskellige enzymer er blevet anvendt til at isolere infiltrerende leukocytter fra decidua basalis og decidua parietalis 10,14,25,28,37,42,43. I mange tilfælde de enzymer fremstillet til en vis koncentration i hånden i laboratory kan være genstand for menneskelige fejl. Her, i stedet, en klar-til-brug renset collagenase / neutral protease cocktail, Accutase, er blevet gennemført i laboratoriet; som en kommerciel enzym, har det vist sig at give pålidelige resultater i cellekultur 51. Accutase (en celle løsrivelse opløsning) er kendt for effektivt at frigøre makrofager fra dyrkningsplader uden skrabning og, vigtigst af alt, uden at miste overfladeantigener 51. Denne tilberedt enzym er også blevet anvendt til at behandle fordøjelsen af humane og animalske nervesystem væv, hvilket resulterer i levedygtige isolerede celler, som er holdbare over en længere periode at over tid, gør det muligt for deres cellekultur 52. Desuden er denne løsning bevarer også CD24 antigenicitet i celler isoleret fra centralnervesystemet væv 52. Sammenlignet med Liberase-1, en anden cocktail af collagenase og neutral protease, hverken Accutase eller Liberase-1 generere frit DNA aggregater; imidlertid Accutase er gEntler end Liberase-1 under væv dissociation 52. På grund af dette, er Accutase ikke dissocierer celleaggregater efter fordøjelse 52. For at overvinde denne begrænsning, protokollen beskrevet heri indbefatter den automatiske væv disaggregering af decidua basalis og decidua parietalis før vævet dissociation med opløsningen. Accutase har også vist sin overlegenhed til trypsin i bevarelsen af CD44, en cancer stamceller overflade markør 53. Vores laboratoriets undersøgelser har konsekvent bemærket, at løsrivelse løsning bevarer overfladeantigenerne. Faktisk er der fundet forskelle mellem graviditet lidelser og normale graviditeter i ekspressionen af flere ekstracellulære og intracellulære markører i makrofager (CD14 + celler), neutrofiler (CD15 + celler), T-celler (CD3 + celler) og B-celler (CD19 + celler), herunder CD80, CD86, CD163, CD209, ICAM3, CD45RO, CD45RA, CXCR3, CCR7, CCR6, CD4, CD8, CD25, foxp3, CD24, CD38, CD27, CD38, CD43, CD23, IgM, IgD, CD5, T-bet, GATA-3, og RORγt, og cytokinfrigivelse. Derfor protokollen beskrevet heri er optimal for immunfænotype for infiltration leukocytter ved den humane maternel-føtal grænseflade som vist i de repræsentative resultater.
En vigtig fordel af protokollen beskrevet heri er, at det giver mulighed for isolering af leukocytter med et højt udbytte af levedygtige celler. Den repræsentative data viser, at> 90% af de isolerede celler er levedygtige. Dette er af stor betydning, da denne protokol har muliggjort studiet af de funktionelle egenskaber af celler isoleret fra humane væv ved maternel-føtal interface. For eksempel har kulturer af decidua makrofager og studiet af cytokinfrigivelse under stimulation blevet udført under anvendelse af denne protokol.
For at opnå gode resultater ved hjælp af den beskrevne protokol, er det vigtigt at overveje følgende faktorer: 1) væv Collectipå, skal udføres inden 1-2 timer efter levering, og disse væv skal anbringes i en beholder med 1x PBS ved 4 ° C for at bevare levedygtigheden af de isolerede celler; 2) mekanisk væv opdeling skal udføres ved hjælp af en automatisk homogenisator på validerede tidspunkter, som beskrevet i denne protokol; 3) varigheden af inkubationen med cellens udstationering løsning skal være mindre end 1 time siden sin aktivitet efter dette tidspunkt mindskes; 4) temperaturen af inkubation med Cellefrigørelse opløsning skal holdes på 37 ° C til opnåelse af optimal aktivitet af dette enzym; 5) cellepellet manipulation skal ske forsigtigt med mikropipetter fordi anvendelse af hvirvlen kan skade integriteten af cellerne (husk, at isolerede celler er differentieret og pludselige manipulation kan let reducere deres levedygtighed); 6) buffer og centrifuger temperaturer skal holdes på den samme temperatur som cellesuspensionen; 7) isolerede celler skal behandles for immunofænotypebestemmelse eller anvendes immedibart som deres levedygtighed reducerer hurtigt; og 8), når du udfører immunfænotypebestemmelse prøver skal erhverves ved hjælp af et flowcytometer straks for de bedste resultater.
En af begrænsningerne ved denne protokol er udgifterne til Accutase, som er dyrere end andre enzymer med lignende funktioner, f.eks, trypsin, dispase II og collagenase. Men de fordele, som Accutase skærme over disse enzymer er, overlegen. En anden begrænsning af protokollen er kravet om en automatisk væv dissociator, som ikke er en fælles laboratorium instrument, og derfor kan være dyrt. For at overvinde denne begrænsning, kan vævet desegregering også udføres ved hjælp af små kirurgiske sakse; dog kan dette trin ikke overstige 3-5 minutter da længere perioder er blevet demonstreret at reducere udbyttet af levedygtige celler. Alle dissociationer skal udføres af samme forsker for at minimere variabilitet.
Sammenfattende protocol heri tilbyder en ny tilgang, der kombinerer brugen af blide mekaniske og enzymatiske væv dissociation teknikker til at bevare integriteten af ekstracellulære og intracellulære markører i leukocytter isoleret fra humane væv ved maternel-føtal interface. Bortset fra immunfænotypebestemmelse, cellekultur, og celle sortering, de fremtidige anvendelser af denne protokol er mange og varierede. Vi er lykkedes ved hjælp af denne protokol til at isolere decidua leukocytter til in vitro studier af leukocyt-funktionalitet (dvs. cytotoksicitet, T-celleproliferation og plasticitet, etc.), og produktionen af reaktive oxygenspecies i leukocytterne isoleret fra decidua væv (data ikke vist). Faktisk, ved hjælp af den beskrevne protokol, har vores laboratorium været i stand til at beskrive nye og sjældne leukocytter ved maternel-føtal interface.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health og Human Development, NIH / DHHS. Dette arbejde blev også delvist, af Wayne State University Perinatal Initiative i Maternal, Perinatal og børns sundhed understøttes,. Vi takker Maureen McGerty (Wayne State University) for hendes kritiske læsninger af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection | |||
| Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers | Any vendor | 20012-027 | |
| 1X phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | (1X PBS) | |
| Large and small Petri dishes | Any vendor | ||
| Dissociation | |||
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | (cell detachment solution) |
| Sterile 2 ml safe-lock conical tubes | Any vendor | ||
| 50 ml conical centrifuge tubes | Any vendor | ||
| 100 µm cell strainers | FALCON/Corning | 352360 | |
| 5 ml round bottom polystyrene test tubes | Any vendor | ||
| Transfer pipettes | Any vendor | ||
| C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| Cell Culture | |||
| RPMI culture medium 1640 | Life Technologies | 22400-089 | (1X) (10% FBS and 1% P/S) |
| Plastic chamber slides | Thermo Scientific | 177437 | |
| Incubator | Thermo Scientific Corporation | HEPA Class 100 | |
| Water bath | Fisher Scientific | ISOTEMP 110 | |
| Cell counter | Nexelcom | Cellometer Auto2000 | |
| Microscope | Olympus | Olympus CKX41 | |
| Cell Separation | |||
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Cell separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| 30 μm pre-separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-40 | |
| Multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 15 ml safe-lock conical tubes | Any Vendor | ||
| MACS buffer | (0.5% bovine serum albumin, 2 mM EDTA and 1X PBS) | ||
| Reagents | |||
| FcR Blocking | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | (Fc Block) |
| Anti-human cell surface antigen antibodies | BD Biosciences | (Table 1) | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| LIVE/DEAD viability dye | BD Biosciences | 564406 | |
| Lyse/Fix buffer | BD Biosciences | 346202 | |
| FACS buffer | (0.1% BSA, 0.05% Sodium Azide, and 1X PBS, pH=7.4) | ||
| Staining buffer | BD Biosciences | 554656 | |
| Trypan Blue solution 0.4% | Life Technologies | 15250-011 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | 20% density gradient media (1.077 + 0.001 g/ml) |
| Additional Instruments | |||
| Incubator with shaker | Thermo Scientific | MAXQ 4450 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSR-Fortessa | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | SpinChron DLX | |
| Vacuum system | Any vendor | ||
| Automatic tissue dissociator | Miltenyi Biotec | gentleMACS Dissociator | |
References
- Kelly, R. W.
- Keelan, J. A., et al. Cytokines, prostaglandins and parturition--a review. Placenta. 24, Suppl A. S33-S46 (2003).
- Romero, R., et al. Inflammation in preterm and term labour and delivery. Semin Fetal Neonatal Med. 11 (5), 317-326 (2006).
- Norman, J. E., Bollapragada, S., Yuan, M., Nelson, S. M.
- Mor, G., Cardenas, I. The immune system in pregnancy: a unique complexity. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 425-433 (2010).
- Gomez-Lopez, N., Guilbert, L. J., Olson, D. M. Invasion of the leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy. J Leukoc Biol. 88 (4), 625-633 (2010).
- Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. A., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol. , (2014).
- Bulmer, J. N., Morrison, L., Longfellow, M., Ritson, A., Pace, D. Granulated lymphocytes in human endometrium: histochemical and immunohistochemical studies. Hum Reprod. 6 (6), 791-798 (1991).
- Bulmer, J. N., Williams, P. J., Lash, G. E.
- Sindram-Trujillo, A., Scherjon, S., Kanhai, H., Roelen, D., Claas, F. Increased T-cell activation in decidua parietalis compared to decidua basalis in uncomplicated human term pregnancy. Am J Reprod Immunol. 49 (5), 261-268 (2003).
- Red-Horse, K., et al. Trophoblast differentiation during embryo implantation and formation of the maternal-fetal interface. J Clin Invest. 114 (6), 744-754 (2004).
- Erlebacher, A.
- Christiansen, O. B.
- Vince, G. S., Starkey, P. M., Jackson, M. C., Sargent, I. L., Redman, C. W. Flow cytometric characterisation of cell populations in human pregnancy decidua and isolation of decidual macrophages. J Immunol Methods. 132 (2), 181-189 (1990).
- Trundley, A., Moffett, A. Human uterine leukocytes and pregnancy. Tissue Antigens. 63 (1), 1-12 (2004).
- Richards, R. G., Brar, A. K., Frank, G. R., Hartman, S. M., Jikihara, H. Fibroblast cells from term human decidua closely resemble endometrial stromal cells: induction of prolactin and insulin-like growth factor binding protein-1 expression. Biol Reprod. 52 (3), 609-615 (1995).
- Rango, U. Fetal tolerance in human pregnancy--a crucial balance between acceptance and limitation of trophoblast invasion. Immunol Lett. 115 (1), 21-32 (2008).
- Robson, A., et al. Uterine natural killer cells initiate spiral artery remodeling in human pregnancy. FASEB J. 26 (12), 4876-4885 (2012).
- Lima, P. D., Zhang, J., Dunk, C., Lye, S. J., Anne Croy,, B, Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy. Cell Mol Immunol. , (2014).
- Aluvihare, V. R., Kallikourdis, M., Betz, A. G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat Immunol. 5 (3), 266-271 (2004).
- Thomson, A. J., et al. Leukocytes infiltrate the myometrium during human parturition: further evidence that labour is an inflammatory process. Hum Reprod. 14 (1), 229-236 (1999).
- Young, A., et al. Immunolocalization of proinflammatory cytokines in myometrium, cervix, and fetal membranes during human parturition at term. Biol Reprod. 66 (2), 445-449 (2002).
- Osman, I., et al. Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term. Mol Hum Reprod. 9 (1), 41-45 (2003).
- Hamilton, S., et al. Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor. Biol Reprod. 86 (2), 39 (2012).
- Gomez-Lopez, N., et al. Evidence for a role for the adaptive immune response in human term parturition. Am J Reprod Immunol. 69 (3), 212-230 (2013).
- Hamilton, S. A., Tower, C. L., Jones, R. L. Identification of chemokines associated with the recruitment of decidual leukocytes in human labour: potential novel targets for preterm labour. PLoS One. 8 (2), e56946 (2013).
- Sindram-Trujillo, A. P., et al. Differential distribution of NK cells in decidua basalis compared with decidua parietalis after uncomplicated human term pregnancy. Hum Immunol. 64 (10), 921-929 (2003).
- Repnik, U., et al. Comparison of macrophage phenotype between decidua basalis and decidua parietalis by flow cytometry. Placenta. 29 (5), 405-412 (2008).
- Sanguansermsri, D., Pongcharoen, S. Pregnancy immunology: decidual immune cells. Asian Pac J Allergy Immunol. 26 (2-3), 171-181 (2008).
- Houser, B. L. Decidual macrophages and their roles at the maternal-fetal interface. Yale J Biol Med. 85 (1), 105-118 (2012).
- Tamiolakis, D., et al. Human decidual cells activity in women with spontaneous abortions of probable CMV aetiology during the first trimester of gestation. An immunohistochemical study with CMV-associated antigen. Acta Medica (Hradec Kralove). 47 (3), 195-199 (2004).
- Williams, P. J., Bulmer, J. N., Searle, R. F., Innes, B. A., Robson, S. C. Altered decidual leucocyte populations in the placental bed in pre-eclampsia and foetal growth restriction: a comparison with late normal pregnancy. Reproduction. 138 (1), 177-184 (2009).
- Eide, I. P., et al. Serious foetal growth restriction is associated with reduced proportions of natural killer cells in decidua basalis. Virchows Arch. 448 (3), 269-276 (2006).
- Brown, M., Wittwer, C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin Chem. 46 (8 Pt 2), 1221-1229 (2000).
- He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor flow cytometry analyses of cellular immune response in rhesus macaques. J Vis Exp. (38), (2010).
- Jaso, J. M., Wang, S. A., Jorgensen, J. L., Lin, P. Multi-color flow cytometric immunophenotyping for detection of minimal residual disease in AML: past, present and future. Bone Marrow Transplant. 49 (9), 1129-1138 (2014).
- Ritson, A., Bulmer, J. N. Isolation and functional studies of granulated lymphocytes in first trimester human decidua. Clin Exp Immunol. 77 (2), 263-268 (1989).
- Nagaeva, O., Bondestam, K., Olofsson, J., Damber, M. G., Mincheva-Nilsson, L. An optimized technique for separation of human decidual leukocytes for cellular and molecular analyses. Am J Reprod Immunol. 47 (4), 203-212 (2002).
- Male, V., Gardner, L., Moffett, A. Chapter 7. Isolation of cells from the feto-maternal interface. Curr Protoc Immunol. (UNIT 7.40), Wiley Online Library. 41-11 (2012).
- Soares, M. J., Hunt, J. S. Placenta and trophoblast: methods and protocols overview II. Methods Mol Med. 122, 3-7 (2006).
- Ritson, A., Bulmer, J. N. Extraction of leucocytes from human decidua. A comparison of dispersal techniques. J Immunol Methods. 104 (1-2), 231-236 (1987).
- White, H. D., et al. A method for the dispersal and characterization of leukocytes from the human female reproductive tract. Am J Reprod Immunol. 44 (2), 96-103 (2000).
- Maruyama, T., et al. Flow-cytometric analysis of immune cell populations in human decidua from various types of first-trimester pregnancy. Hum Immunol. 34 (3), 212-218 (1992).
- Zhang, J., et al. Isolation of lymphocytes and their innate immune characterizations from liver, intestine, lung and uterus. Cell Mol Immunol. 2 (4), 271-280 (2005).
- Carlino, C., et al. Recruitment of circulating NK cells through decidual tissues: a possible mechanism controlling NK cell accumulation in the uterus during early pregnancy. Blood. 111 (6), 3108-3115 (2008).
- Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Mol Reprod Dev. 75 (5), 818-827 (2008).
- Zhang, P., Wu, X., Hu, C., Wang, P., Li, X. Rho kinase inhibitor Y-27632 and Accutase dramatically increase mouse embryonic stem cell derivation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 48 (1), 30-36 (2012).
- Snegovskikh, V. V., et al. Intra-amniotic infection upregulates decidual cell vascular endothelial growth factor (VEGF) and neuropilin-1 and -2 expression: implications for infection-related preterm birth. Reprod Sci. 16 (8), 767-780 (2009).
- Oliver, C., Cowdrey, N., Abadia-Molina, A. C., Olivares, E. G. Antigen phenotype of cultured decidual stromal cells of human term decidua. J Reprod Immunol. 45 (1), 19-30 (1999).
- Chang, Y., Hsieh, P. H., Chao, C. C. The efficiency of Percoll and Ficoll density gradient media in the isolation of marrow derived human mesenchymal stem cells with osteogenic potential. Chang Gung Med J. 32 (3), 264-275 (2009).
- Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. , 670-672 (2014).
- Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
- Quan, Y., et al. Impact of cell dissociation on identification of breast cancer stem cells. Cancer Biomark. 12 (3), 125-133 (2012).
