Abstract
임신은 생식 조직과 모성 - 태아 인터페이스에서 백혈구 (탈락의 basalis과 탈락의 parietalis)의 침윤을 특징으로한다. 이 인터페이스는 산모와 태아 조직 사이의 접촉의 해부학 적 위치이다; 따라서, 임신 동안 작업의 면역 사이트이다. 산모 - 태아 인터페이스에서의 침투 백혈구는 전달의 중심 주입 역할, 임신의 유지 보수 및 타이밍을한다. 따라서 이러한 백혈구의 표현형 및 기능 특성화 임신 장애로 이어질 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 것입니다. 몇몇 프로토콜들은 탈락의 basalis 및 탈락의 parietalis로부터 백혈구 침윤 분리하기 위해 설명되었다; 그러나, 배양 시약, 효소, 및 시간에서의 일관성 결여 어려운 이들 결과를 비교한다. 본원에 기재된 부드러운 기계적 및 효소 DISS의 사용을 겸비한 신규 한 접근법ociation 기술 모체 - 태아의 계면에서의 인간 조직에서 분리 된 백혈구 세포 및 세포 마커의 생존과 무결성을 보존한다. 제외하고 모두 면역, 세포 배양, 세포 분류에서,이 프로토콜의 미래 응용 프로그램은 많고 다양하다. 이 프로토콜에 따라, 절연 백혈구 DNA를 시험 관내 백혈구 기능 (즉, 식세포 작용, 세포 독성 T 세포 증식 및 가소성 등)에 메틸화, 표적 유전자의 발현 및 활성 산소 종의 생성을 결정하는데 사용될 수있다 산모 - 태아 인터페이스에서. 또한, 설명 된 프로토콜을 사용하여,이 연구소는 산모 - 태아 인터페이스에서 새로운 희귀 백혈구를 설명 할 수있다.
Introduction
임신은 세 가지 면역 학적 상 특징 : 1) 주입 및 프로 - 염증 반응과 관련된 초기 태반이 (즉, 주입은 '열린 상처'과 유사) 2) 두 번째 임신과 면역 항상성이 산모 - 태아 인터페이스에서 주로 항 염증 상태를 통해 달성 임신의 세 번째 임신의 대부분; 3) 분만, 염증성 상태 1-7. 면역 세포는 모체 - 태아의 계면에서 염증 반응을 조절하는데 중요한 역할을하는 곳들이 풍부 임신 6-9 걸쳐 파악 변화.
인간으로, 산모 - 태아 인터페이스는 모성 (탈락) 태아 (융모막 또는 영양막 세포) 조직 사이의 직접 접촉의 영역을 나타냅니다. 1) 탈락 선 자궁강이 태반에 포함하지 않는 것이 parietalis과 병렬 인 :이 인터페이스는 포함융모막의 laeve에; 2)이 침입 trophoblasts (10) (그림 1)에 의해 침략하는 태반의 기초 판에있는 탈락의 basalis. 접촉이 지역의 친밀감은 산모의 면역 체계 11-13에 태아 항원 노출에 대한 조건을 만듭니다. 당연히 백혈구 전형적인 기질 형 세포 및 세포 선의 8,14,16 이외에 탈락 세포 8,9,14,15 30-40 %까지 포함한다. 산모 - 태아 인터페이스에서 백혈구의 역할은 영양막 세포의 침윤 (17)의 제한, 나선형 동맥 (18, 19)의 리모델링, 어머니의 허용 오차 12, 20의 유지 보수 및 노동 21-26의 개시를 포함하는 여러 프로세스를 포함한다. 적응 및 즉, T 세포, 대 식세포, 호중구, B 세포, 수지상 세포 및 NK 세포, 탈락 막 조직에서 확인되었다 면역계의 타고난 사지, 그 양의 백혈구비율 및 활성화 상태는 임신 6-10,12,14,24,27-30 걸쳐 공간적 및 시간적으로 변화시키는 것으로 나타났다. 백혈구 인구 및 / 또는 기능의 교란은 자연 유산 (31), 자간전증 (32), 자궁 내 성장 제한 32, 33, 및 조산 7,24과 연결되어 있습니다. 따라서, 인간의 모체 - 태아의 계면에서의 표현형 특성과 백혈구의 기능에 대한 연구는 임신 장애의 조절 곤란 면역 학적 경로의 해명을 촉진 할 것이다.
여러 매개 변수를 동시에 34 ~ 36의 정량 분석을 할 수 있습니다 유동 세포 계측법 된 표현형과 백혈구의 기능적 특성을 결정하는 데 사용되는 가장 강력한 도구 중 하나, 기술. 유동 세포 계측법에 의한 백혈구를 분석하기 위해, 단일 세포 현탁액 내의 백혈구의 분리가 필요하다. 따라서, 방법은 레 침투 분리하는산모 - 태아 인터페이스에서 kocytes들은 표현형 및 기능적 특성을 연구하기 위해 필요합니다.
몇 가지 방법이 인간 모체 - 태아 인터페이스 10,14,25,27,37-39로부터 백혈구를 분리하는 기술되었다. 일부는 기계 세분화 10,25,27,38을 적용하는 동안, 다른 사람은 조직 분리에 대한 효소 소화 37,40를 사용합니다. 기계적인 세분화가 낮은 수율 및 감소 된 생존 41과 생존 세포 표면 마커 보유 42에 영향을 미칠 수있는 효소 적 분해를 생성하기 때문에, 본원에 기재된 방법은 세포 생존을 손상시키지 않고 절연 백혈구의 수율을 증가시키는 효소 전처리와 부드러운 기계적 해리를 결합한다. 방법의 유사한 조합이 모체 - 태아의 인터페이스 (39)에서 탈락 조직으로부터 백혈구 분리에 효과적인 것으로 입증되었다. 따라서, 본 명세서에 설명 된 프로토콜을 포함 메카반대 메스, 면도날, 또는 수술 가위 10,28 전통 닦지에 비해 시간과 노동을 절약하면서 일관성을 증가시키는 자동 조직 dissociator와 nical 세분화. 티슈 해리를 위해 선택된 효소 Accutase이었다. 일반적으로 사용되는 43 콜라게나 제와는 달리, 44 디스 파제, 트립신 45 Accutase (세포 분리 용액)을 일반적으로 단백질 가수 분해하고 효율적인 아직 부드러운 (46, 47)의 해리에 기여 collagenolytic 활동 모두를 결합한다. 분리 후, 백혈구는 밀도 구배 원심 분리에 의해 탈락 막 세포의 전체 인구에서 농축된다. 각종 밀도 구배 매체는 이전 퍼콜 (콜로 이달 실리카 입자의 현탁액) (48) 및 피콜 (합성 고 분자량의 중합체 자당) (49)이다 가장 일반적인 그중, 이용되어왔다. 크로스 폴리머에 의한 분리의 우수한 효율 previo있다usly 50를 도시하고, 본 명세서에서 더 설명 프로토콜이 밀도 구배 매체 단핵구의 충분히 높은 순도를 생산하고 있음을 증명한다.
따라서, 본원에 기재된 프로토콜은 인간 탈락 조직으로부터 백혈구를 분리하는 밀도 구배 매체 (1.077 + 0.001 g / mL)로 자동 티슈 dissociator, 세포 분리 용액과 소화 효소, 백혈구 분리하여 기계적 조직의 세분화를 결합한다. 이 프로토콜은 세포 생존과 함께 세포 표면 항원을 유지하는 입증되었다. 고립 된 백혈구는 유동 세포 계측법 및 체외에서 기능 연구와 면역 표현형을 포함 여러 애플리케이션에 사용할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
이 프로토콜은 유동 세포 계측법에 의해 모두 면역을위한 준비에 탈락의 basalis과 탈락의 parietalis에서 백혈구 분리에 적합합니다. 또한, 분리 된 세포는 세포 분류, 세포 배양, RNA 분리 및 세포학에 사용될 수있다. 이 프로토콜에 언급 된 샘플 작업을 시작하기 전에, 인간의 윤리적 승인은 지역 연구 윤리위원회 및 기관 검토 보드에서 얻을 수 있어야합니다. 수집 및 연구 목적으로 인간의 샘플의 활용은 아동 보건 인간 개발 (NICHD)의 유니스 케네디 슈라이버 국립 연구소의 임상 시험 심사 보드, 건강 (NIH)의 국립 연구소, 보건 복지부 (DHHS에 의해 승인되었다 베데스다, 메릴랜드, 미국)와 웨인 주립 대학 (디트로이트, 미시간, 미국). 서면 동의서 전에 조직 샘플의 컬렉션에 모든 임산부로부터 얻은 것입니다.
참고 : 동물의 혈액, 세포, 또는 위험 작업하는 동안이 프로토콜에서 언급 한 바와 같이 OU에 에이전트, 그것은 적절한 바이오 안전성 및 실험실 안전 조치가 따라야하는 것이 필수적이다.
인간의 탈락 조직 1. 해부
주 : 기부 플레이트 아래 및 기부 태반에 부착되고 모체의 표면을 나타낸다. chorioamniotic 막은 양막과 융모막을 포함한다. 기초 판은 탈락의 basalis을 포함하고 융모막은 탈락의 parietalis (그림 1)을 포함한다.
- 탈락 Basalis
- 태반 (도 1a 및 1b) 중 하나 자엽으로부터 기부 판의 부분을 해부.
- 위로 향 태반 융모와 멸균 커팅 보드에 배치합니다. 태반의 융모를 보여주는 측면은 일반적으로 모양 털이 조직과 피 묻은 빨간색입니다. 기초 판은 부드럽고 붉은 색 옅은입니다.
- VILL을 제거하기 위해 날카로운, 미세 포인트 가위와 집게를 사용하여OU를 조직과 혈관. 프로세스 (그림 1C) 동안 (무료 - - 2+ 및 마그네슘 칼슘) 1X PBS에 담가 조직을 유지합니다. 이 조각의 3에 2를 수집하고 혈액 (그림 1D)를 제거하는 1X PBS로 철저히 씻어.
- 탈락 Parietalis
- chorioamniotic 세포막의 조각을 해부 (약 10cm는 10cm, 그림 1E을 X). 융모막이 위로 향하게하여 보드에 놓습니다. 융모막 쪽은 피의 응고를 포함하고 일반적으로 색에 노란 빛입니다.
- 가능 (그림 1E)로 혈전의만큼을 제거하는 미세 포인트 집게를 사용합니다. 1X PBS 분명히 실행될 때까지 막에서 여분의 혈액을 청소하는 멸균 1X PBS에서 막을 씻어.
- 부드럽게 막에서 탈락 층을 긁어 일회용 멸균 세포 스크레이퍼를 사용합니다. MEM에 멸균 1X PBS 적용brane이 과정 (그림 1 층)을 완료한다. 탈락 조직을 수집하고 멸균 1X PBS (그림 1G)와 50 ㎖의 플라스틱 튜브에 배치합니다.
2. 기계 세분화 및 효소 소화
- 50 ㎖의 플라스틱 튜브에 멸균 1X PBS로 (단계 1.1.3에서) 탈락의 basalis 해부 조직 또는 (단계 1.2.3에서) 탈락의 parietalis을 씻으십시오. 실온에서 5 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 조직의 알약을 수집합니다.
- 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 조직 펠렛 위에있는 뜨는을 대기음.
참고 : 그들은 적혈구 포함되어 있기 때문에이 시점에서, 펠릿은 매우 느슨. 펠릿의 부피에 대해 또는 3 ㎖ 미만이면, 세포 분리 용액 6 ml를 37 ℃로 미리 가온에 펠렛을 재 - 보류. 펠릿을 3 ml의 용적보다 더 크다면, 더 많은 세포 분리 용액을 추가 (토륨의 약 2 배를 추가조직 샘플의 전자 볼륨). - C 튜브에 균질 조직 (탈락의 basalis + 세포 분리 솔루션 또는 탈락 parietalis + 세포 분리 솔루션)를 전송합니다.
- 자동 dissociator에서 C 튜브를 삽입하고 해당 프로그램을 실행합니다.
참고 : 탈락의 basalis의 프로그램이 실행 당 668 총 라운드 17 초 동안 실행됩니다. 탈락의 parietalis의 프로그램이 실행 당 235 총 라운드 37 초 동안 실행됩니다. 이 프로그램은 탈락의 basalis 또는 좋은 수율 및 세포 생존과 탈락의 parietalis에서 백혈구를 분리 정의하고있다. - 이러한 accutase로서 시판 세포 분리 용액으로 조직 다이제스트, 조직의 세분화를 따라 기계적; 부드러운 교반과 함께 37 ℃에서 45 분 동안 (단백질 분해 및 collagenolytic 효소를 포함하는 칵테일).
백혈구 3. 분리
- 인큐베이션 후, dige로 1X PBS 10 ㎖를 추가stion 혼합물과 50 ml의 플라스틱 튜브에 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 전달합니다. 소화 혼합물의 끈적 거림에 따라, 하나 하나의 혼합물에 대한 몇 가지 세포 여과기를 사용해야 할 수도 있습니다.
- 실온에서 5 분 동안 300 XG에 1X PBS로 튜브와 원심 분리기를 입력합니다. 신중 세포 펠렛 위에 1X PBS를 제거하고 얼음처럼 차가운 FACS 완충액 5 mL를 펠릿을 다시 일시.
참고 : 6.1 단계로 이동, 함께 다형과 단핵 백혈구을 연구; 단핵 백혈구을 연구하기 위해, 3.3 단계로 진행합니다. - 15 ml의 플라스틱 튜브에 20 %의 5 ml의 밀도 구배 매체 (1.077 + 0.001 g / ㎖)를 첨가하고, 서서히 밀도 구배 매체의 상부에 세포 현탁액을 오버레이. 샘플 적층 동안, 세포 현탁액 밀도 구배 매체를 혼합하지 않는 것이 중요하다.
- 브레이크없이 4 ℃에서 30 분 동안 500 XG에 스윙 아웃 로터와 원심 분리기. 그것은 세포와 L을 혼합 방지하기 위해 브레이크를 해제하는 것이 매우 중요합니다그라디언트입니다 osing. 백혈구 밀도 구배 매체 및 FACS 버퍼 사이의 계면에서 발견 될 것이다.
- 피펫을 사용하여 매우 신중 외과 버퍼와 세포 파편을 포함하는 상위 계층을 제거합니다. 계면에서의 밴드는 탈락 단핵 세포와 다형 핵 백혈구의 일부를 포함하고 있습니다.
- 새로운 15 ml의 플라스틱 튜브로 완전히 계면에 세포를 옮긴다. 외과 버퍼의 최소 3 배 이상의 볼륨을 추가합니다.
- 세포 펠릿을 5 분 동안 300 XG 원심 분리기. 뜨는을 기음과 외과 버퍼로 세포를 씻어. RT에서 5 분 동안 300 XG에 다른 원심 분리하여 세포를 펠릿 화.
참고 : 6 단계를 참조하십시오, 모두 면역을 수행하려면 5 단계를 참조 셀 정렬을 수행하려면 4 단계를 참조 세포 배양을 수행 할 수 있습니다.
4. 응용 프로그램 - 세포 배양
- USI 가능한 세포 개수를 RPMI 배지 1640 1 ㎖의 단계 3.7에서 세포를 다시 일시자동 세포 계수기 또는 혈구와 트리 판 블루 용액 0.4 %를 ng를.
- 1 × 106 세포 / ml의 세포 농도를 만들기 위해 RPMI 배지의 양을 추가한다. 셀은 문화에 대한 준비가되어 있습니다.
5. 응용 프로그램 - 기본 세포 배양을위한 대 식세포의 분리
- 자기 CD14 마이크로 비드 (107 세포 당 20 ㎕의 비드)와 단계 3.7에서 세포를 라벨, CD14 + 세포를 분리하기 위해, 15 4 ℃에서 min으로하고, 자장을인가하여 다른 유형의 세포에서 분리 된 CD14 + 세포를 배양한다. MACS 완충액 및 자계의 제거와 2 세척 후에, MACS 완충액 자기 유지 CD14 + 세포를 용출.
- 원심 분리 후, 다시 정지 세포 도금 (그림 2)에 대한 준비가 RPMI 배지 1640에서 세포 펠렛을.
6. 응용 프로그램 - 모두 면역
- immunophenot의 세포를 사용하려면yping, 1X PBS 1 ㎖의 단계 3.7에서 세포를 다시 일시. 자동 세포 계수기 또는 혈구와 트리 판 블루 용액 0.4 %를 사용하여 가능한 세포를 계산합니다.
- 고칠 생존 염료 (그림 3)과 세포를 레이블. 외과 버퍼로 두 번 세포를 씻고 얼룩 버퍼에있는 세포를 다시 일시 중지합니다. 4 ° C에서 15 분 동안의 FcR 차단에 품어.
- 형광 색소에 접합 세포 항체를 추가합니다. 예를 들어,이 프로토콜에서, 항 CD3을 사용, 항 CD19, 항 CD14, 항 CD15 그리고 항 CD56 항체 (표 1). 어둠 속에서 4 ℃에서 30 분 동안 품어.
- 1X PBS 2 세척 후, 세포를 유동 세포 계측기를 사용하여 염색 완충액 500 μL를 분석한다. 탈락 조직에서 발견 백혈구 하위 집단을 분석하는 데 사용 게이팅 전략의 표현은도 4에 도시되어있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
. 산모 - 태아 인터페이스에서 인체 조직 (탈락의 basalis과 탈락의 parietalis)의 해부는 그림 1에 나타낸다이 절차는 탈락의 basalis (- D 그림 1A)를 포함하는 기초 판의 절개를 포함한다. 탈락 된 basalis는 기부 플레이트 (도 1C)에서 태반 융모 (태아 측)을 제거함으로써 얻어진다. 탈락의 parietalis 부드럽게 융모 막 (그림 1E - F)를 긁어에 의해 수집된다. (2) 자기 세포 정렬을 사용하여 용어 임신에서 탈락의 parietalis에서 수집 고립 된 대 식세포 (CD14의 +)의 형태를 보여줍니다. 격리 식세포는 배양 3 일 후에 사이토 카인을 방출 할 수있는 기능을 유지 (데이터는 보이지 않음). 탈락 된 basalis 및 탈락의 parietalis로부터 분리 가능한 세포의 수율은도 3에 도시되고, 그것은 모두 90 % 이상이다.
그림 1. 인간의 산모 - 태아 인터페이스 :. 태반과 chorioamniotic 막 (A) 기저 판은 태반에서 해부; (B) 기저 플레이트 태반 융모로부터 분리된다; (C) 태반의 융모가 탈락의 basalis를 포함하여 기초 판에서 트리밍; (D) 탈락의 BASA LIS가 1X PBS로 세정; (E) 융모막 멤브레인의 단편을 수득하고, 혈전 부드럽게 제거한다; (F)의 탈락 parietalis 가볍게 긁어; 및 (G) 탈락의 parietalis (점선)이 융모막 막에서 분리된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 문화 2. 탈락 식세포. 대 식세포 (CD14 + 세포) 용어 임신에서 탈락의 parietalis에서 분리 하였다. 대 식세포는 RPMI1640 + 10 % FBS + 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 50 + NG / ㎖의 MCSF 플라스틱 챔버 슬라이드에 배양 하였다. 사진 도금 (A)의 시간에서 촬상 된 3 일 후에 배양 (C)에 있었다.3 / 52863fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
탈락의 basalis에서 격리 총 세포의 그림 3. 총 세포 생존 능력. 생존과 탈락의 parietalis는 고칠 가능성 염료 (단계 6.2)를 사용하여 다음과 같은 밀도 구배를 측정 하였다. 분리 된 세포의 생존 라이브 / 죽은 세포 생존 염색에 따라> 95 %입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
탈락 백혈구 하위 집단에 대한 그림 4. 게이팅 전략은. 백혈구는 FSC와 SSC와 함께 문이되었다. 살아있는 세포는 생존 게이트 (생균)에 따른 게이트 하였다. 생존 세포는 N으로 분리시켰다eutrophils (CD15 +)와 대식 세포 (CD14의 +). CD14-CD15- 인구는 더 자연 살해 세포 (CD3-CD56 +), NKT 세포 (CD3 + CD56 +), T 세포 (CD3 +)와 B 세포 (CD19 +)로 분리되었다. 이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 그림.
. 그림 탈락 조직 5. 백혈구 하위 집단 호중구 (CD15 +)와 대식 세포 (CD14 +)는 생존 게이트 내에서 문이되었다; T 세포 (CD3 +)와 B 세포 (CD19 +)가 CD14-CD15- 게이트 내에서 문이되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
decid 그림 6. 희귀 백혈구 하위 집단연간 조직. 자연 살해 세포 (CD56 +)와 NKT 세포 (CD56 + CD3 +)는 CD14-CD15- 게이트 내에서 문이되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 항체 목록 | 회사 | 카탈로그 번호 |
| BD 파밍 방지 인간 CD56-PE-Cy7 | BD 바이오 사이언스 | 557747 |
| BD 호라이즌 반대로 인간 CD15-BV605 | BD 바이오 사이언스 | 562980 |
| BD 호라이즌 반대로 인간 CD14-BUV395 | BD 바이오 사이언스 | 563561 |
| BD 호라이즌 반대로 인간 CD19-BUV737 | BD 바이오 사이언스 | 564303 |
| 화려한 바이올렛 650 항 인간 CD3 항체 | Biolegend | 317323 |
항체의 표 1. 목록은 백혈구의 부분 집합 모두 면역에 활용
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
인간의 산모 - 태아 인터페이스에서 백혈구 침투의 기능 및 표현형 특성의 특성은 임신 장애로 이어질 면역 메커니즘의 이해에 필수적이다. 몇 가지 기술은 임신 10,14,25,28,37,42,43에 걸쳐 인간의 모체 - 태아 인터페이스로부터 백혈구를 분리하기 위해 설명되었다. 그러나, 이들 기술들의 각각은 별개 항상 분리 된 세포의 생존 능력을 지정하지 않고, 가장 중요한 것은, 효소 또는 효소 결합 다른 사용이 필요 상이한 해리 시간을, 조직의 수량을 지정하지 않고. 여기에 설명 된 프로토콜은 생존의 높은 수율의 결과로 인간의 모체 - 태아 인터페이스에서 백혈구 (탈락의 basalis과 탈락의 parietalis)을 침투의 분리를 허용하고 상세한 상업 시약에 대한 정보, 버퍼 준비, 조직 수량 및 배양 시간 valida을 제공합니다우리의 실험실에서 테드.
백혈구 분리 공정의 제 중요한 단계 조직 해리이고; 이 단계는 기계적인 인종 차별 폐지 및 / 또는 효소 분해를 포함한다. 기계 인종 차별 폐지 성공적으로 탈락의 parietalis (그림 1 층)을 분리 할 때 융모막을 긁어에 의해 탈락의 basalis (그림 1C) 10,28을 분리 할 때 기초 판에서 태반의 융모를 트리밍에 의해 수행된다. 따라서, 본 명세서에 기술 된 프로토콜은 초기 단계로 두 절차가 포함되어 있습니다. 그러나, 탈락의 basalis에서 백혈구를 분리 할 때 태아의 백혈구의 오염을 일으킬 수있는 기초 판 (모체 조직)와 태반 융모 (태아 조직)이 밀접하게 연결되어 있음을 고려하는 것이 중요합니다. 태아의 오염을 방지하기 위해, 프로토콜은 여기에 트리밍 된 기초 판 두 개 또는 세 번 (그림 1D)를 세척하는 것이 좋습니다. 세포 스크래핑에 따라 또는 트리밍탈락의 basalis 또는 탈락의 parietalis에서, 기계적 조직 세분화를위한 추가 단계 39를 권장하고있다. 이 단계는 권장 때문에 단단히 세포 외 기질 6,7에 첨부 산모 - 태아 인터페이스 표현 세포 접착 분자의 침투 백혈구. 따라서, 본 명세서에 기술 된 프로토콜은 메스, 면도날, 또는 수술 가위 10,28 전통적인 닦지에 비해 시간과 노동을 절약하면서 일관성을 증가시키는 자동 조직 dissociator와 기계 세분화을 포함한다.
티슈 해리 과정에서 두 번째 중요한 단계 분해 효소이다. 단일 효소와 다른 효소의 조합이 탈락 된 basalis로부터 백혈구 침윤을 격리하는 데 사용 탈락은 10,14,25,28,37,42,43을 parietalis되었다. 많은 경우에, 이들 효소는 LABORA 손으로 일정한 농도로 제조토리는 사람의 실수의 적용을받을 수 있습니다. 여기서, 대신, 바로 사용 가능한 정제 된 콜라게나 제 / 중성 프로테아제 칵테일, Accutase, 실험실에서 구현되었다; 상업적인 효소로서, 이는 세포 배양 51 신뢰할 수있는 결과를 제공하는 것으로 나타났다. 표면을 잃고 51 항원없이 Accutase (전지 분리 솔루션)을 효과적으로 가장 중요한 긁어 및없이 문화 판에서 대 식세포를 분리하는 것으로 알려져있다. 이렇게 제조 된 효소는 또한 시간이 지남에 따라 이들 세포 배양 물 (52)을 허용한다는 장기간 지속 유지 가능한 분리 된 세포의 결과, 인간과 동물의 신경계 조직의 분해 처리에 사용되어왔다. 또한,이 솔루션은 또한 중추 신경계 조직 (52)에서 분리 된 세포에서 CD24의 항원 성을 유지합니다. Liberase-1, 콜라게나 중성 프로테아제의 또 다른 칵테일도 Accutase도 Liberase-1 무료 DNA 집계를 생성 비교했을 때, 그러나, Accutase는 G이다조직 해리 (52) 중 Liberase-1보다 entler. 이 때문에, Accutase는 소화 52 후 세포 집합체를 해리하지 않습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 본 명세서에 설명 된 프로토콜과 탈락의 basalis 탈락 parietalis 종래 용액 티슈 해리의 자동 조직의 세분화를 포함한다. Accutase 또한 CD44, 암 줄기 세포 표면 마커 (53)의 보존에 트립신에 그 우수성을 입증했다. 우리 실험실의 연구는 지속적으로 분리 솔루션은 표면 항원을 보존 주목했다. 실제로, 임신 질환 및 정상 임신 사이의 차이 대 식세포 (CD14 + 세포), 호중구 (CD15 + 세포), T 세포 (CD3 + 세포), 및 B 세포에서 여러 가지 세포 외 및 세포 마커의 발현에서 발견되었다 (CD19 + 세포)를 포함 CD80, CD86, CD163, CD209, ICAM3, CD45RO, CD45RA, CXCR3, CCR7, CCR6, CD4, CD8, CD25, Foxp3를, CD24, CD38, CD27, CD38, CD43, CD23, IgM의, IgD의, CD5, T-내기, GATA-3, RORγt 및 사이토 카인 릴리스. 대표적인 결과에 도시 된 바와 같이, 따라서, 본 명세서에 기술 된 프로토콜은 인간의 모체 - 태아의 계면에서 침윤 백혈구의 면역 표현형에 최적이다.
본원에 기술 된 프로토콜의 중요한 장점은 생세포의 고 수율로 백혈구의 분리를 허용한다는 것이다. 대표 데이터는 분리 된 세포의> 90 %가 가능한 것을 나타낸다. 이 프로토콜은 산모 - 태아 인터페이스에서 인간의 조직에서 분리 한 세포의 기능적 특성의 연구를 허용 한 이것은 매우 중요하다. 예를 들어, 탈락 식세포 자극 하에서 사이토킨 방출 연구의 배양이 프로토콜을 이용하여 수행되었다.
1) 조직 collecti : 기재된 프로토콜을 사용하여 성공적인 결과를 달성하기 위해, 다음의 요소를 고려하는 것이 중요는에 도착 후 1-2 시간 내에서 수행되어야하며, 이러한 조직은 분리 된 세포의 생존을 유지하기 위해 4 ℃에서 1X PBS와 함께 용기에 배치해야; 이 프로토콜에 기재된 바와 같이 2) 기계적 조직 세분화는, 검증 시간에 자동 호 모지 나이저를 사용하여 수행되어야한다; 3) 세포 분리 용액과 함께 항온 배양 기간은 그 활성이 시간이 감소 보낸 후 1 시간 미만이어야; 4) 세포 분리 용액과 함께 인큐베이션 온도가이 효소의 최적 활성을 얻기 위하여 37 ℃로 유지되어야한다; 소용돌이의 사용은 세포의 무결성을 손상시킬 수 있기 때문에 5) 세포 펠렛 조작 ()가 분리 된 세포는 차별화 된 갑작스러운 조작이 쉽게 자신의 가능성을 감소시킬 수 있음을 기억 Micropipette과 함께 조심스럽게 수행해야합니다; 6) 버퍼와 원심 온도는 세포 현탁액과 동일한 온도로 유지되어야한다; 7) 분리 된 세포는 모두 면역을 위해 처리 또는 immedi 사용해야합니다ately 그들의 생존 능력이 빠르게 감소로; 모두 면역을 수행 할 때, 8), 샘플은 최상의 결과를 사이토 즉시 흐름을 사용하여 취득해야합니다.
이 프로토콜의 제한 중 하나는 유사한 기능, 예를 들어, 트립신, 디스 파제 II, 및 콜라게나 제와 다른 효소보다 더 비싸다 Accutase의 비용이다. 그러나 이상과 그 효소 위에 표시 Accutase 장점은 우수하다. 프로토콜의 두번째 제한은 따라서, 비용이 많이들 수 있고, 일반적인 실험 기기 아니며 자동 조직 dissociator의 요구 사항이다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 조직은 인종 차별 폐지 작은 수술 용 가위를 이용하여 수행 될 수있다; 긴 기간은 생세포의 수율을 감소하는 것으로 입증 되었기 때문에 그러나,이 단계는 3-5 분을 초과 할 수 없다. 모든 dissociations은 변동성을 최소화하기 위해 동일한 연구가 수행되어야한다.
요약하면, 프로로토콜 본원 모체 - 태아의 계면에서 인체 조직으로부터 분리 된 백혈구 세포 및 세포 내에서 마커의 무결성을 유지하기 위해 온화한 기계적 및 효소 조직 분리 기술의 사용을 결합한 새로운 접근법을 제공한다. 제외하고 모두 면역, 세포 배양, 세포 분류에서,이 프로토콜의 미래 응용 프로그램은 많고 다양하다. 우리는 성공적 탈락 백혈구 기능 (즉, 세포 독성 T 세포 증식과 가소성 등) 및 탈락 조직에서 분리 된 백혈구 활성 산소 종 생산의 생체 외 연구 백혈구 (데이터가없는 격리이 프로토콜을 사용하고 그림 참조). 실제로, 설명 프로토콜을 사용하여, 우리 연구소는 산모 - 태아 인터페이스에서 새로운 희귀 백혈구를 설명 할 수있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
이 작품은 아동 건강 및 인간 발달의 유니스 케네디 슈라이버 국립 연구소, NIH / DHHS에 의해 지원되었다. 이 작품은 또한 모자, 주 산기 모자 건강에 웨인 주립 대학 주 산기 이니셔티브에 의해 부분적으로 지원되었다. 우리는 기꺼이 원고의 그녀의 중요한 측정 값에 대한 모린 McGerty (웨인 주립 대학)을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection | |||
| Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers | Any vendor | 20012-027 | |
| 1X phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | (1X PBS) | |
| Large and small Petri dishes | Any vendor | ||
| Dissociation | |||
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | (cell detachment solution) |
| Sterile 2 ml safe-lock conical tubes | Any vendor | ||
| 50 ml conical centrifuge tubes | Any vendor | ||
| 100 µm cell strainers | FALCON/Corning | 352360 | |
| 5 ml round bottom polystyrene test tubes | Any vendor | ||
| Transfer pipettes | Any vendor | ||
| C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| Cell Culture | |||
| RPMI culture medium 1640 | Life Technologies | 22400-089 | (1X) (10% FBS and 1% P/S) |
| Plastic chamber slides | Thermo Scientific | 177437 | |
| Incubator | Thermo Scientific Corporation | HEPA Class 100 | |
| Water bath | Fisher Scientific | ISOTEMP 110 | |
| Cell counter | Nexelcom | Cellometer Auto2000 | |
| Microscope | Olympus | Olympus CKX41 | |
| Cell Separation | |||
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Cell separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| 30 μm pre-separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-40 | |
| Multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 15 ml safe-lock conical tubes | Any Vendor | ||
| MACS buffer | (0.5% bovine serum albumin, 2 mM EDTA and 1X PBS) | ||
| Reagents | |||
| FcR Blocking | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | (Fc Block) |
| Anti-human cell surface antigen antibodies | BD Biosciences | (Table 1) | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| LIVE/DEAD viability dye | BD Biosciences | 564406 | |
| Lyse/Fix buffer | BD Biosciences | 346202 | |
| FACS buffer | (0.1% BSA, 0.05% Sodium Azide, and 1X PBS, pH=7.4) | ||
| Staining buffer | BD Biosciences | 554656 | |
| Trypan Blue solution 0.4% | Life Technologies | 15250-011 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | 20% density gradient media (1.077 + 0.001 g/ml) |
| Additional Instruments | |||
| Incubator with shaker | Thermo Scientific | MAXQ 4450 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSR-Fortessa | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | SpinChron DLX | |
| Vacuum system | Any vendor | ||
| Automatic tissue dissociator | Miltenyi Biotec | gentleMACS Dissociator | |
References
- Kelly, R. W.
- Keelan, J. A., et al. Cytokines, prostaglandins and parturition--a review. Placenta. 24, Suppl A. S33-S46 (2003).
- Romero, R., et al. Inflammation in preterm and term labour and delivery. Semin Fetal Neonatal Med. 11 (5), 317-326 (2006).
- Norman, J. E., Bollapragada, S., Yuan, M., Nelson, S. M.
- Mor, G., Cardenas, I. The immune system in pregnancy: a unique complexity. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 425-433 (2010).
- Gomez-Lopez, N., Guilbert, L. J., Olson, D. M. Invasion of the leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy. J Leukoc Biol. 88 (4), 625-633 (2010).
- Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. A., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol. , (2014).
- Bulmer, J. N., Morrison, L., Longfellow, M., Ritson, A., Pace, D. Granulated lymphocytes in human endometrium: histochemical and immunohistochemical studies. Hum Reprod. 6 (6), 791-798 (1991).
- Bulmer, J. N., Williams, P. J., Lash, G. E.
- Sindram-Trujillo, A., Scherjon, S., Kanhai, H., Roelen, D., Claas, F. Increased T-cell activation in decidua parietalis compared to decidua basalis in uncomplicated human term pregnancy. Am J Reprod Immunol. 49 (5), 261-268 (2003).
- Red-Horse, K., et al. Trophoblast differentiation during embryo implantation and formation of the maternal-fetal interface. J Clin Invest. 114 (6), 744-754 (2004).
- Erlebacher, A.
- Christiansen, O. B.
- Vince, G. S., Starkey, P. M., Jackson, M. C., Sargent, I. L., Redman, C. W. Flow cytometric characterisation of cell populations in human pregnancy decidua and isolation of decidual macrophages. J Immunol Methods. 132 (2), 181-189 (1990).
- Trundley, A., Moffett, A. Human uterine leukocytes and pregnancy. Tissue Antigens. 63 (1), 1-12 (2004).
- Richards, R. G., Brar, A. K., Frank, G. R., Hartman, S. M., Jikihara, H. Fibroblast cells from term human decidua closely resemble endometrial stromal cells: induction of prolactin and insulin-like growth factor binding protein-1 expression. Biol Reprod. 52 (3), 609-615 (1995).
- Rango, U. Fetal tolerance in human pregnancy--a crucial balance between acceptance and limitation of trophoblast invasion. Immunol Lett. 115 (1), 21-32 (2008).
- Robson, A., et al. Uterine natural killer cells initiate spiral artery remodeling in human pregnancy. FASEB J. 26 (12), 4876-4885 (2012).
- Lima, P. D., Zhang, J., Dunk, C., Lye, S. J., Anne Croy,, B, Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy. Cell Mol Immunol. , (2014).
- Aluvihare, V. R., Kallikourdis, M., Betz, A. G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat Immunol. 5 (3), 266-271 (2004).
- Thomson, A. J., et al. Leukocytes infiltrate the myometrium during human parturition: further evidence that labour is an inflammatory process. Hum Reprod. 14 (1), 229-236 (1999).
- Young, A., et al. Immunolocalization of proinflammatory cytokines in myometrium, cervix, and fetal membranes during human parturition at term. Biol Reprod. 66 (2), 445-449 (2002).
- Osman, I., et al. Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term. Mol Hum Reprod. 9 (1), 41-45 (2003).
- Hamilton, S., et al. Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor. Biol Reprod. 86 (2), 39 (2012).
- Gomez-Lopez, N., et al. Evidence for a role for the adaptive immune response in human term parturition. Am J Reprod Immunol. 69 (3), 212-230 (2013).
- Hamilton, S. A., Tower, C. L., Jones, R. L. Identification of chemokines associated with the recruitment of decidual leukocytes in human labour: potential novel targets for preterm labour. PLoS One. 8 (2), e56946 (2013).
- Sindram-Trujillo, A. P., et al. Differential distribution of NK cells in decidua basalis compared with decidua parietalis after uncomplicated human term pregnancy. Hum Immunol. 64 (10), 921-929 (2003).
- Repnik, U., et al. Comparison of macrophage phenotype between decidua basalis and decidua parietalis by flow cytometry. Placenta. 29 (5), 405-412 (2008).
- Sanguansermsri, D., Pongcharoen, S. Pregnancy immunology: decidual immune cells. Asian Pac J Allergy Immunol. 26 (2-3), 171-181 (2008).
- Houser, B. L. Decidual macrophages and their roles at the maternal-fetal interface. Yale J Biol Med. 85 (1), 105-118 (2012).
- Tamiolakis, D., et al. Human decidual cells activity in women with spontaneous abortions of probable CMV aetiology during the first trimester of gestation. An immunohistochemical study with CMV-associated antigen. Acta Medica (Hradec Kralove). 47 (3), 195-199 (2004).
- Williams, P. J., Bulmer, J. N., Searle, R. F., Innes, B. A., Robson, S. C. Altered decidual leucocyte populations in the placental bed in pre-eclampsia and foetal growth restriction: a comparison with late normal pregnancy. Reproduction. 138 (1), 177-184 (2009).
- Eide, I. P., et al. Serious foetal growth restriction is associated with reduced proportions of natural killer cells in decidua basalis. Virchows Arch. 448 (3), 269-276 (2006).
- Brown, M., Wittwer, C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin Chem. 46 (8 Pt 2), 1221-1229 (2000).
- He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor flow cytometry analyses of cellular immune response in rhesus macaques. J Vis Exp. (38), (2010).
- Jaso, J. M., Wang, S. A., Jorgensen, J. L., Lin, P. Multi-color flow cytometric immunophenotyping for detection of minimal residual disease in AML: past, present and future. Bone Marrow Transplant. 49 (9), 1129-1138 (2014).
- Ritson, A., Bulmer, J. N. Isolation and functional studies of granulated lymphocytes in first trimester human decidua. Clin Exp Immunol. 77 (2), 263-268 (1989).
- Nagaeva, O., Bondestam, K., Olofsson, J., Damber, M. G., Mincheva-Nilsson, L. An optimized technique for separation of human decidual leukocytes for cellular and molecular analyses. Am J Reprod Immunol. 47 (4), 203-212 (2002).
- Male, V., Gardner, L., Moffett, A. Chapter 7. Isolation of cells from the feto-maternal interface. Curr Protoc Immunol. (UNIT 7.40), Wiley Online Library. 41-11 (2012).
- Soares, M. J., Hunt, J. S. Placenta and trophoblast: methods and protocols overview II. Methods Mol Med. 122, 3-7 (2006).
- Ritson, A., Bulmer, J. N. Extraction of leucocytes from human decidua. A comparison of dispersal techniques. J Immunol Methods. 104 (1-2), 231-236 (1987).
- White, H. D., et al. A method for the dispersal and characterization of leukocytes from the human female reproductive tract. Am J Reprod Immunol. 44 (2), 96-103 (2000).
- Maruyama, T., et al. Flow-cytometric analysis of immune cell populations in human decidua from various types of first-trimester pregnancy. Hum Immunol. 34 (3), 212-218 (1992).
- Zhang, J., et al. Isolation of lymphocytes and their innate immune characterizations from liver, intestine, lung and uterus. Cell Mol Immunol. 2 (4), 271-280 (2005).
- Carlino, C., et al. Recruitment of circulating NK cells through decidual tissues: a possible mechanism controlling NK cell accumulation in the uterus during early pregnancy. Blood. 111 (6), 3108-3115 (2008).
- Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Mol Reprod Dev. 75 (5), 818-827 (2008).
- Zhang, P., Wu, X., Hu, C., Wang, P., Li, X. Rho kinase inhibitor Y-27632 and Accutase dramatically increase mouse embryonic stem cell derivation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 48 (1), 30-36 (2012).
- Snegovskikh, V. V., et al. Intra-amniotic infection upregulates decidual cell vascular endothelial growth factor (VEGF) and neuropilin-1 and -2 expression: implications for infection-related preterm birth. Reprod Sci. 16 (8), 767-780 (2009).
- Oliver, C., Cowdrey, N., Abadia-Molina, A. C., Olivares, E. G. Antigen phenotype of cultured decidual stromal cells of human term decidua. J Reprod Immunol. 45 (1), 19-30 (1999).
- Chang, Y., Hsieh, P. H., Chao, C. C. The efficiency of Percoll and Ficoll density gradient media in the isolation of marrow derived human mesenchymal stem cells with osteogenic potential. Chang Gung Med J. 32 (3), 264-275 (2009).
- Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. , 670-672 (2014).
- Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
- Quan, Y., et al. Impact of cell dissociation on identification of breast cancer stem cells. Cancer Biomark. 12 (3), 125-133 (2012).
