Abstract
Беременность характеризуется инфильтрацией лейкоцитов в репродуктивных тканях и на границе материнской плода (децидуальной базального и децидуальной parietalis). Этот интерфейс анатомическая контакта между материнской и эмбриональных тканей; Таким образом, это иммунологическое местом действия во время беременности. Лейкоциты проникают в интерфейсе материнской плода играют центральную роль в имплантации, обслуживание беременности, и сроки доставки. Таким образом, фенотипические и функциональные характеризации этих лейкоцитов обеспечит понимание механизмов, приводящих к нарушению беременности. Несколько протоколы были описаны для того, чтобы изолировать от проникновения лейкоцитов децидуальной базального и децидуальной parietalis; Однако, отсутствие согласованности в реагентов, энзимов, и времени инкубации затрудняет сравнение этих результатов. Описанный в настоящем документе, новый подход, который сочетает в себе использование нежных механических и ферментативных диссметоды ociation сохранить жизнеспособность и целостность внеклеточного и внутриклеточного маркеров в лейкоцитах, выделенных из тканей человека на границе материнской плода. Помимо иммунофенотипирования, культуры клеток, и сортировки клеток, будущие применения этого протокола многочисленны и разнообразны. После этого протокола, выделенные лейкоциты могут быть использованы для определения метилирование ДНК, экспрессию генов-мишеней, в пробирке функциональности лейкоцитов (т.е. фагоцитоза, цитотоксичность, пролиферацию Т-клеток, и пластичности и т.д.), а также производство активных форм кислорода на границе материнской плода. Кроме того, с помощью описанного протокола, эта лаборатория была в состоянии описать новые и редкие лейкоциты на границе материнской плода.
Introduction
Беременность характеризуется тремя различными иммунологическими фаз: 1) имплантация и в начале плаценты связаны с про-воспалительной реакции (т.е., имплантация напоминает "открытая рана"); 2) во втором триместре, и большинство из третьего триместра беременности, когда иммунного гомеостаза достигается через преимущественно противовоспалительным государства на границе материнской плода; и 3) роды, про-воспалительных состояние 1-7. Иммунные клетки играют важную роль в регуляции воспалительной реакции на границе материнской плода, где их численность и изменение локализации во время беременности 6-9.
У человека, интерфейс материнской плода представляет собой область непосредственного контакта между материнской (децидуальной) и плода (хориона или трофобласта) тканей. Этот интерфейс включает в себя: 1) децидуальной parietalis, что линии полости матки не распространяется на плаценту и в сопоставлениив хориона laeve; и 2) децидуальной базального, расположенные в базальной пластинки плаценты где она вторглась интерстициальными трофобластов 10 (рисунок 1). Интимность этих областях контакта создает условия для антигенной плода воздействия материнской иммунной системы 11-13. Не удивительно, лейкоциты содержат до 30-40% клеток плаценты 8,9,14,15 в дополнение к типичным стромальных клеток типа и железистых клеток 8,14,16. Роль лейкоцитов на границе материнской плода включает несколько процессов, которые включают ограничение трофобласта вторжения 17, реконструкцию спиральных артерий 18,19, обслуживание материнской толерантности 12,20, и посвящение труда 21-26. Лейкоциты как адаптивных и врожденных конечностей иммунной системы, то есть, Т-клетки, макрофаги, нейтрофилы, лимфоциты, дендритные клетки, и клетки NK, были определены в децидуальных тканей, и ихпропорции и статус активации, как было показано в пространственном и временном меняться в течение беременности 6-10,12,14,24,27-30. Возмущения в популяции лейкоцитов и / или функции, связанные с самопроизвольным абортом, 31 преэклампсии 32, внутриутробной задержки роста 32,33 и преждевременных родов 7,24. Таким образом, изучение фенотипических характеристик и функциональности лейкоцитов на границе материнской плода человека будет способствовать выяснению иммунологических путей Нарушение регуляции при нарушениях беременности.
Один из самых мощных инструментов, используемых для определения фенотипа и функциональных свойств лейкоцитов проточной цитометрии, технология, которая позволяет проводить количественный анализ нескольких параметров одновременно 34-36. Для анализа лейкоцитов методом проточной цитометрии, изоляция лейкоцитов в одной клеточной суспензии требуется. Таким образом, способ отделить проникновения Leukocytes из интерфейса материнской плода необходимо изучить их фенотипические и функциональные свойства.
Некоторые методы были описаны, чтобы изолировать лейкоциты от человеческого материнской плода интерфейс 10,14,25,27,37-39. В то время как некоторые применяются механические разукрупнение 10,25,27,38, другие используют ферментативного расщепления 37,40 для тканевой диссоциации. Из-за механической дезагрегации дает меньший выход и снижает жизнеспособность 41 и ферментативной диссоциации может повлиять на жизнеспособность клеточной поверхности и удержание маркера 42, описанный здесь способ сочетает нежную механическую диссоциацию с ферментативной предварительной обработки, чтобы увеличить выход изолированных лейкоцитах без ущерба жизнеспособности клеток. Аналогичное сочетание методов была продемонстрирована эффективность в изоляции лейкоцитов из децидуальной ткани на материнской плода интерфейс 39. Таким образом, протокол, описанный здесь, включает мехаское разбивка с автоматической диссоциации ткани, что увеличивает согласованность, экономя время и труд по сравнению с традиционными измельчения с противоположными скальпелей, бритвенные лезвия, или хирургическими ножницами 10,28. Фермент выбрали для ткани диссоциации был Accutase. В отличие от обычно используемого коллагеназы 43, диспазу 44, и трипсин 45, Accutase (раствор клеток отряд) сочетает в себе как общие протеолитической и коллагенолитических мероприятий, способствующих эффективному пока нежным диссоциации 46,47. После диссоциации, лейкоциты обогащены от общей численности населения децидуальных клеток центрифугированием в градиенте плотности. Различные градиент плотности носителя были ранее использованы, наиболее распространенным из которых являются перколлом (суспензии коллоидных частиц кремнезема) и 48 (Ficoll полимер сахарозы с высокой молекулярной массой синтетической) 49. Более высокая эффективность изоляции от сахарозы полимера была Previously показано 50, и протокол, описанный в данном документе дополнительно доказывает, что этот градиент плотности носителя производит достаточно высокую чистоту мононуклеарных лейкоцитов.
Следовательно, протокол описано здесь сочетает в себе механическую ткани дезагрегации с автоматической диссоциации ткани, ферментативным расщеплением с раствором открепления клеток, лейкоцитов и разделения с градиентом плотности сред (1,077 + 0,001 г / мл), чтобы изолировать лейкоцитов из плаценты человека ткани. Этот протокол был доказан, чтобы сохранить антигены на поверхности клеток, а также жизнеспособности клеток. Выделенные лейкоциты могут быть использованы для различных приложений, которые включают иммунофенотипирование с проточной цитометрии и функциональных исследований в пробирке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол подходит для изоляции лейкоцитов из децидуальной базального и децидуальной parietalis в подготовке к иммунофенотипирования с помощью проточной цитометрии. Кроме того, отдельные клетки могут быть использованы для сортировки клеток, культуры клеток, выделения РНК, и цитологии. Перед началом работы с образцами, указанных в этом протоколе, этические утверждения человеческого должно быть получено от Комитета по этике местного научно-исследовательского и организационного обзора советов. Сбор и утилизация образцов человека для исследовательских целей были одобрены этическими советами Юнис Кеннеди Шрайвер Национального института детского здоровья и развития человека (NICHD), Национальный институт здоровья (NIH), Департамент здравоохранения и социальных служб (DHHS , Bethesda, MD, USA) и Wayne State University (Детройт, Мичиган, США). Письменное информированное согласие было получено от всех беременных женщин до сбора образцов тканей.
ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с крови животных, клетки, или опасностиленные агенты, как указано в этом протоколе, важно, что надлежащее биобезопасности и действий по обеспечению безопасности лабораторных следовать.
1. Вскрытие децидуальной тканей человека
Примечание: базальная пластинка является базовым ниже и прикреплен к плаценте и представляет собой материнскую поверхность. В chorioamniotic мембраны включают амнион и хорион. Базальная пластинка включает в себя децидуальной базального и хориона включает децидуальной parietalis (рисунок 1).
- Децидуальной базального
- Рассеките кусок донца от одного семядолей плаценты (фиг.1А и 1В).
- Поместите его на стерильную разделочной доске с плацентарных ворсинок вверх. Сбоку через плацентарный ворсинки, как правило, кровавый красный с волосатой ткани по внешнему виду. Базальная пластинка гладкая и светло-красного цвета.
- Используйте острые, прекрасно точкой ножницы и пинцет, чтобы удалить Villленные ткань и кровеносные сосуды. Держите ткани, смоченной в 1x PBS (Ca 2+ - и Mg 2+ - бесплатно) в процессе (рис 1в). Соберите 2 до 3 из этих частей и тщательно промойте их 1x PBS, чтобы удалить кровь (рис 1D).
- Децидуальной Parietalis
- Проанализируйте кусок chorioamniotic мембран (примерно 10 см х 10 см, рис 1E). Поместите его на доске с хориона вверх. Хорионический сторона содержит кровавые сгустки и обычно светло-желтоватого цвета.
- Используйте тонкой точкой щипцов, чтобы удалить как многие из сгустков крови, а возможно (рис 1E). Промойте мембрану в стерильной PBS 1x для очистки избыток крови из мембраны до 1x PBS, не станет чистой.
- Использование одноразовых стерильных скребок клеток осторожно очистить слой децидуальной из мембраны. Применить стерильную 1x PBS на MEMбран, а завершить этот процесс (рис 1F). Сбор децидуальной ткани и поместите их в 50 мл пластиковую трубку со стерильным 1x PBS (рис 1G).
2. Механическая Разбивка и ферментативного расщепления
- Промыть ткань расчлененный от децидуальной базального (со стадии 1.1.3) или децидуальной parietalis (со стадии 1.2.3) с стерильной PBS 1x в 50 мл пластиковую пробирку. Сбор тканей гранул путем центрифугирования при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Аспирируйте супернатант, расположенную над ткани гранул тщательно, не нарушая гранул.
Примечание: В этот момент, гранулы очень свободно, поскольку они содержат эритроциты. Если объем гранул составляет около или менее 3 мл, повторно приостанавливать осадок в 6 мл раствора открепления клеток предварительно нагретой до 37 ° С. Если осадок больше, чем 3 мл объема, добавить больше клеток отряд решение (добавить го примерно в 2 разае объем образцов ткани). - Передача гомогенизированных тканей (децидуальной базального + клеток отряд решение или децидуальной parietalis + раствор клеток отряд) в C трубки.
- Поместите трубку C в автоматическом диссоциации и запустить соответствующую программу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Программа для децидуальной базального работает на 17 сек с 668 общих выстрелов в перспективе. Программа для децидуальной parietalis работает 37 сек с 235 общих выстрелов в перспективе. Эти программы были настроены, чтобы изолировать лейкоциты от децидуальной базального или децидуальной parietalis с хорошим выходом и жизнеспособности клеток. - После механической дезагрегации тканей, переварить ткани с коммерчески доступных клеток отряд решения, таких как Accutase; (Коктейль, содержащий протеолитической и коллагенолитические ферменты) в течение 45 мин при 37 ° С при легком помешивании.
3. Выделение лейкоцитов
- После инкубации, добавить 10 мл 1x PBS в DigeStion смесь и передать его через сито 100 мкм клеток в 50 мл пластиковую трубку. В зависимости от липкости обрабатываемой смеси, можно нужно использовать несколько клеток фильтры для одной смеси.
- Заполните трубку с 1x PBS и центрифуге при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре. Извлеките 1X PBS выше осадков клеток тщательно и повторно приостанавливать гранул с 5 мл охлажденного льдом буфера FACS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для изучения полиморфноядерных лейкоцитов и мононуклеарных вместе, перейдите к шагу 6.1; изучить одноядерные лейкоциты, перейдите к шагу 3.3. - Добавляют 5 мл 20% градиенте плотности носителей (1,077 + 0,001 г / мл) до 15 мл пластиковую пробирку и медленно наложения клеточной суспензии в верхней части градиента плотности сред. В то время как наслоение образца, важно, чтобы не перепутать градиент плотности среды с клеточной суспензии.
- Центрифуга с поворотно-откидной ротор на 500 мкг в течение 30 мин при 4 ° С без тормоза. Это очень важно, чтобы выключить тормоз, чтобы избежать смешивания клеток и лosing градиент. Лейкоциты можно найти в интерфейсе между градиентом плотности сред и буфера FACS.
- Снимите верхний слой, содержащий буфера и клеток мусора FACS очень тщательно с помощью пипетки. Полоса интерфейса содержит децидуальной мононуклеарных клеток и часть из полиморфно-ядерных лейкоцитов.
- Передача клеток на поверхности раздела полностью новой 15 мл пластиковую пробирку. Добавить по крайней мере, в 3 раза больше объема FACS буфера.
- Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин, чтобы гранулировать клетки. Аспирируйте супернатант и промыть клетки с буфером FACS. Гранулировать клетки с другим центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения клеточной культуры см Шаг 4. Для выполнения сортировки клеток, см Шаг 5. Для выполнения иммунофенотипирование см Шаг 6.
4. Приложения - Клеточные культуры
- Повторное приостановить клетки с шага 3.7 в 1 мл RPMI питательной среды 1640. Количество жизнеспособных клеток USIнг автоматического счетчика клеток или гемоцитометра и -ным раствором трипанового синего 0,4%.
- Добавить до количества культуральной среды RPMI, чтобы концентрацию клеток 1 × 10 6 клеток / мл. Клетки готовы к культуре.
5. Приложения - Выделение макрофагов для первичной культуре клеток
- Чтобы изолировать CD14 + клеток, магнитно маркировать клетки, полученный на стадии 3.7 с CD14 микросфер (20 мкл шариков на 10 7 клеток), инкубируют в течение 15 мин при 4 ° С, и отдельный CD14 + клеток от других типов клеток путем приложения магнитного поля. Через 2 промывками буфером MACS и удаления магнитного поля, вымывания магнитно сохраненные CD14 + клеток с MACS буфера.
- После центрифугирования, повторно приостанавливать клеток гранул в культуральной среде RPMI 1640. клетки готовы для покрытия (рисунок 2).
6. Приложения - иммунофенотипирование
- Чтобы использовать клетки для immunophenotyping, повторно приостанавливать клетки с шага 3.7 в 1 мл 1x PBS. Количество жизнеспособных клеток с использованием автоматического счетчика клеток или гемоцитометра и -ным раствором трипанового синего 0,4%.
- Этикетка клетки с фиксируемой жизнеспособность красителя (рис 3). Промыть клетки дважды FACS буфере и вновь приостановить клеток в буфере пятен. Инкубируйте с блокатором FcR в течение 15 мин при 4 ° С.
- Добавить внеклеточные антитела, конъюгированные с флуорохромами. Например, в данном протоколе, использовать анти-CD3, анти-CD19, анти-CD14, анти-CD15 и анти-CD56 антитела (таблица 1). Инкубируют в течение 30 мин при 4 ° С в темноте.
- Через 2 промывками 1x PBS, клетки будут проанализированы в 500 мкл буфера окрашивания с использованием проточного цитометра. Представление стратегии стробирования, используемой для анализа лейкоцитов субпопуляции, найденные в тканях плаценты показано на рисунке 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
. Рассечение тканей человека на границе материнской плода (децидуальной базального и децидуальной parietalis) показано на рисунке 1 Эта процедура включает в себя вскрытие донца, которое включает децидуальной базального (рис 1А - D). Децидуальной базального получается удалением плацентарный ворсинки (со стороны плода) от базальной пластинки (рис 1С). Децидуальной parietalis собирают путем осторожного соскоба хорионический мембраны (рис 1E - F). Рисунок 2 показывает морфологию изолированных макрофагах (CD14 +), собранных из децидуальной parietalis в перспективе беременности с использованием магнитного сортировки клеток. Изолированных макрофагах поддерживается способностью высвобождать цитокины после 3 дней культивирования (данные не показаны). Выход жизнеспособных клеток, выделенных из децидуальной базального и децидуальной parietalis показано на рисунке 3, и она больше, чем 90% в обоих.
Рисунок 1. Человеческий материнской плода интерфейс:. Плацента и chorioamniotic мембраны () базальной пластины расчлененные из плаценты; (Б) базальная пластинка отделяется от плаценты ворсинок; (С) ворсин плаценты отделан из базальной пластинки, включая децидуальной базального; (D), децидуальной баса Лис промывают в PBS 1x; (Е) фрагмент хорионического мембраны получены и сгустки крови аккуратно удаляются; (F), децидуальной parietalis осторожно соскабливают; и (G), децидуальной parietalis (пунктирная линия) отделяется от хориона мембраны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. децидуальной макрофаги в культуре. Макрофаги (CD14 + клетки) были выделены из децидуальной parietalis на срок беременности. Макрофаги засевали в пластиковые камеры слайдов с RPMI1640 + 10% FBS + 1% пенициллин-стрептомицин + 50 нг / мл MCSF. Фотографии были сделаны в момент покрытия (А) и через 3 дня в культуре (C).3 / 52863fig3large.jpg "цель =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Общий жизнеспособность клеток. Жизнеспособность общего числа клеток, выделенных из децидуальной базального и децидуальной parietalis была определена следующим градиентом плотности с использованием фиксируемой жизнеспособность красителя (этап 6.2). Жизнеспособность изолированных клеток> 95% в соответствии с окрашиванием жизнеспособности живой / мертвый клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Память стратегия децидуальный лейкоцитов групп населения. Лейкоциты воротами с FSC и SSC. Живые клетки затем закрытого по жизнеспособности ворот (Live). Жизнеспособные клетки были разделены на пeutrophils (CD15 +) и макрофагами (CD14 +). Население CD14-CD15- затем дополнительно разделены на NK-клеток (CD3-CD56 +), НКТ-клеток (CD3 + CD56 +), Т-клетки (CD3 +) и В клеток (CD19 +). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этого фигура.
. Рисунок 5. лейкоцитов субпопуляции в децидуальных тканей Нейтрофилы (CD15 +) и макрофаги (CD14 +) были закрытого в жизнеспособности ворот; Т-клетки (CD3 +) и В-клетки (CD19 +) были закрытого в CD14-CD15- ворот. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6. Редкие лейкоцитов субпопуляции в decidUAL тканей. NK-клетки (CD56 +) и НКТ-клеток (CD56 + CD3 +) были закрытого в CD14-CD15- ворот. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Список антител | Компания | Каталог Нет. |
| BD Pharmingen Анти-CD56-человек ПЭ-Cy7 | BD Biosciences | 557747 |
| BD Горизонт Анти-CD15-человек BV605 | BD Biosciences | 562980 |
| BD Горизонт Анти-CD14-человек BUV395 | BD Biosciences | 563561 |
| BD Горизонт Анти-CD19-человек BUV737 | BD Biosciences | 564303 |
| Блестящий Фиолетовый 650 Анти-CD3 антител человек | BioLegend | 317323 |
Таблица 1. Список антител используется для лейкоцитов подмножества иммунофенотипирования
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Характеристика функциональных и фенотипических свойств проникновения лейкоцитов в интерфейсе материнской плода человека имеет важное значение для понимания иммунных механизмов, приводящих к нарушению беременности. Некоторые методы были описаны для того, чтобы изолировать лейкоциты из интерфейса материнской плода человека на протяжении всей беременности 10,14,25,28,37,42,43. Тем не менее, каждый из этих методов отличается, использует разные ферменты или комбинации ферментов, требуется разное время диссоциации, не уточняется количество ткани, и, самое главное, не всегда указывать на жизнеспособность изолированных клеток. Протокол описано позволяет изоляции Лейкоциты проникают на интерфейс материнской плода человека (децидуальной базального и децидуальной parietalis), в результате высокой доходности жизнеспособности и предоставляет подробную информацию о коммерческих реагентов, подготовка буфера, ткани и количества времени инкубации ВалидаТед в нашей лаборатории.
Первый важный шаг в процессе изоляции лейкоцитов ткани диссоциации; этот шаг включает в себя механическую десегрегацию и / или ферментативной диссоциации. Механическая десегрегация успешно выполняется выскабливание хориона, когда выделение децидуальной parietalis (рис 1F) и обрезки плацентарный ворсинки от донца, когда выделения децидуальной базального (рис 1в) 10,28. Таким образом, протокол, описанный здесь, включает в себя как процедуры, как начальные шаги. Тем не менее, важно учитывать, что базальная пластинка (материнские ткани) и плаценты (ворсинок эмбриональные ткани) тесно связаны, которые могут привести к загрязнению плода лейкоцитов при вычленении лейкоциты из децидуальной базального. Чтобы избежать загрязнения плода, протокол в данном рекомендует мыть обрезанную базальной пластинки два или три раза (рис 1D). После клеток выскабливание или обрезкиот децидуальной базального или децидуальной parietalis, дополнительный шаг для механической ткани разукрупнения был рекомендован 39. Этот шаг рекомендуется, потому что проникают лейкоциты в материнской плода интерфейса экспресс молекул клеточной адгезии, что прочно прикрепить их к внеклеточной матрицы 6,7. Таким образом, протокол, описанный здесь, включает механическую разбивку с автоматической диссоциации ткани, что увеличивает согласованность, экономя время и труд по сравнению с традиционными измельчения с скальпелей, бритвенные лезвия, или хирургическими ножницами 10,28.
Второй важный шаг в процессе диссоциации ткани ферментативного диссоциации. Одиночные ферменты и сочетание различных ферментов были использованы для выделения Лейкоциты проникают в децидуальной базального и децидуальной parietalis 10,14,25,28,37,42,43. Во многих случаях эти ферменты готов определенной концентрации вручную в LABORAТори может быть предметом человеческой ошибки. Здесь, вместо этого, готовые к использованию очищенной коллагеназы / нейтральное коктейль протеазы, Accutase, был реализован в лаборатории; в качестве коммерческого фермента, было показано, чтобы обеспечить надежные результаты в клеточной культуре 51. Accutase (раствор клеток отряд), как известно, эффективно отделить макрофаги из пластин культуры, не поцарапав и, самое главное, без потери поверхностных антигенов 51. Этот приготовленный фермент был также использован для обработки переваривание тканей системы нервной человека и животных, в результате чего жизнеспособных изолированных клеток, которые остаются устойчивыми в течение длительного периода, что, в течение долгого времени, позволяет их клеточной культуре 52. Кроме того, это решение также сохраняет CD24 антигенностью в клетках, выделенных из центральной системы нервных тканей 52. По сравнению с Liberase-1, другой коктейль коллагеназы и нейтральной протеазы, ни Accutase ни Liberase-1 генерировать свободные агрегаты ДНК; Однако, это Accutase гentler чем Liberase-1 во время ткани диссоциации 52. Из-за этого, Accutase не диссоциирует клеточных агрегатов после пищеварения 52. Чтобы преодолеть это ограничение, протокол, описанный здесь, включает автоматическую разбивку тканей децидуальной базального и децидуальной parietalis до ткани диссоциации с раствором. Accutase также продемонстрировал свое превосходство в трипсин в сохранении CD44, клеточной поверхности маркера раковых стволовых 53. Исследования нашей лаборатории постоянно отметил, что отряд решение сохраняет поверхностные антигены. Действительно, разница между расстройствами беременности и нормальной беременности были найдены в экспрессии некоторых внеклеточных и внутриклеточных маркеров в макрофагах (CD14 + клетки), нейтрофилы (CD15 + клетки), Т-клеток (CD3 + клетки) и В-клеток (CD19 + клетки), в том числе CD80, CD86,, CD163, CD209, ICAM3, CD45RO, CD45RA, CXCR3, CCR7, CCR6, CD4, CD8, CD25,, FOXP3, CD24, CD38, CD27, CD38,, CD43, CD23, IgM, IgD, CD5, Т-бет, GATA-3 и RORγt, а в высвобождения цитокинов. Таким образом, протокол, описанный здесь, является оптимальным для иммунофенотипирования инфильтрации лейкоцитов на границе материнской плода человека, как показано в приведенных результатов.
Важным преимуществом описанного здесь протокола является то, что она позволяет для выделения лейкоцитов с высоким выходом жизнеспособных клеток. Представитель данные показывают, что> 90% из выделенных клеток являются жизнеспособными. Это имеет большое значение, так как этот протокол позволило изучение функциональных свойств клеток, выделенных из тканей человека на поверхности материнской плода. Например, культуры децидуальной макрофагов и изучения высвобождение цитокинов при стимуляции были выполнены с использованием этого протокола.
Для достижения успешных результатов, используя описанную протокол, важно учитывать следующие факторы: 1) ткань Collectiна должна быть выполнена в течение 1-2 ч после родов, и эти ткани должны быть помещены в контейнер с 1x PBS при 4 ° С, чтобы сохранить жизнеспособность изолированных клеток; 2) механическое ткани разбивка должна быть выполнена с использованием автоматического гомогенизатора в проверенных раз, как описано в данном протоколе; 3) продолжительность инкубации с открепления клеток раствора должна быть не менее 1 часа с момента его активности после этого времени уменьшается; 4) температура инкубации с открепления клеток раствора должна поддерживаться на уровне 37 ° С, чтобы получить оптимальную активность этого фермента; 5) Осадок клеток манипуляции должно быть сделано осторожно микропипетки, поскольку использование вихря может привести к повреждению целостности клеток (помните, что изолированные клетки дифференцированы и резкое манипуляция может легко уменьшить их жизнеспособность); 6) буфер и температура центрифуги должны храниться при той же температуре в клеточной суспензии; 7) изолированные клетки должны быть обработаны для иммунофенотипирования или использовать immediленно, как их жизнеспособность быстро уменьшается; и 8) при выполнении иммунофенотипирование, образцы должны быть получены с использованием проточного цитометра немедленно для получения наилучших результатов.
Одним из ограничений этого протокола является стоимость Accutase, который является более дорогим, чем других ферментов с аналогичными функциями, например, трипсина, диспазу II, и коллагеназы. Тем не менее, преимущества, которые Accutase дисплеи сверх тех ферментов превосходят. Второе ограничение протокола является требование автоматического диссоциации ткани, которая не является общей лабораторный прибор и, следовательно, может быть дорогостоящим. Чтобы преодолеть это ограничение, ткань десегрегация также может быть выполнена с использованием небольших хирургических ножниц; Однако этот шаг не может превышать 3-5 минут, так как более длительные периоды были продемонстрированы, чтобы уменьшить выход жизнеспособных клеток. Все диссоциации должны быть выполнены одним и тем же исследователем, чтобы свести к минимуму изменчивость.
Таким образом, пров данном токол предлагает новый подход, который сочетает в себе использование нежных механических и ферментативных методов тканевой диссоциации, чтобы сохранить целостность внеклеточного и внутриклеточного маркеров в лейкоцитах, выделенных из тканей человека на границе материнской плода. Помимо иммунофенотипирования, культуры клеток, и сортировки клеток, будущие применения этого протокола многочисленны и разнообразны. Мы успешно использовать этот протокол, чтобы изолировать децидуальной лейкоциты для исследований в пробирке функциональности лейкоцитов (т.е. цитотоксичности, пролиферации Т-клеток и пластичности и т.д.), и производство активных форм кислорода в лейкоцитов, выделенных из тканей плаценты (данные не показан). В самом деле, с помощью описанного протокола, наша лаборатория была в состоянии описать новые и редкие лейкоциты на границе материнской плода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Юнис Кеннеди Шрайвер Национального института детского здоровья и человеческого развития, NIH / DHHS. Эта работа также была поддержана, в частности, в университет перинатального инициативы Wayne State в материнской, перинатальной и детского здоровья. Мы выражаем глубокую признательность Морин McGerty (Wayne State University) за критических показаний рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection | |||
| Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers | Any vendor | 20012-027 | |
| 1X phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | (1X PBS) | |
| Large and small Petri dishes | Any vendor | ||
| Dissociation | |||
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | (cell detachment solution) |
| Sterile 2 ml safe-lock conical tubes | Any vendor | ||
| 50 ml conical centrifuge tubes | Any vendor | ||
| 100 µm cell strainers | FALCON/Corning | 352360 | |
| 5 ml round bottom polystyrene test tubes | Any vendor | ||
| Transfer pipettes | Any vendor | ||
| C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| Cell Culture | |||
| RPMI culture medium 1640 | Life Technologies | 22400-089 | (1X) (10% FBS and 1% P/S) |
| Plastic chamber slides | Thermo Scientific | 177437 | |
| Incubator | Thermo Scientific Corporation | HEPA Class 100 | |
| Water bath | Fisher Scientific | ISOTEMP 110 | |
| Cell counter | Nexelcom | Cellometer Auto2000 | |
| Microscope | Olympus | Olympus CKX41 | |
| Cell Separation | |||
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Cell separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| 30 μm pre-separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-40 | |
| Multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 15 ml safe-lock conical tubes | Any Vendor | ||
| MACS buffer | (0.5% bovine serum albumin, 2 mM EDTA and 1X PBS) | ||
| Reagents | |||
| FcR Blocking | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | (Fc Block) |
| Anti-human cell surface antigen antibodies | BD Biosciences | (Table 1) | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| LIVE/DEAD viability dye | BD Biosciences | 564406 | |
| Lyse/Fix buffer | BD Biosciences | 346202 | |
| FACS buffer | (0.1% BSA, 0.05% Sodium Azide, and 1X PBS, pH=7.4) | ||
| Staining buffer | BD Biosciences | 554656 | |
| Trypan Blue solution 0.4% | Life Technologies | 15250-011 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | 20% density gradient media (1.077 + 0.001 g/ml) |
| Additional Instruments | |||
| Incubator with shaker | Thermo Scientific | MAXQ 4450 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSR-Fortessa | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | SpinChron DLX | |
| Vacuum system | Any vendor | ||
| Automatic tissue dissociator | Miltenyi Biotec | gentleMACS Dissociator | |
References
- Kelly, R. W.
- Keelan, J. A., et al. Cytokines, prostaglandins and parturition--a review. Placenta. 24, Suppl A. S33-S46 (2003).
- Romero, R., et al. Inflammation in preterm and term labour and delivery. Semin Fetal Neonatal Med. 11 (5), 317-326 (2006).
- Norman, J. E., Bollapragada, S., Yuan, M., Nelson, S. M.
- Mor, G., Cardenas, I. The immune system in pregnancy: a unique complexity. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 425-433 (2010).
- Gomez-Lopez, N., Guilbert, L. J., Olson, D. M. Invasion of the leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy. J Leukoc Biol. 88 (4), 625-633 (2010).
- Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. A., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol. , (2014).
- Bulmer, J. N., Morrison, L., Longfellow, M., Ritson, A., Pace, D. Granulated lymphocytes in human endometrium: histochemical and immunohistochemical studies. Hum Reprod. 6 (6), 791-798 (1991).
- Bulmer, J. N., Williams, P. J., Lash, G. E.
- Sindram-Trujillo, A., Scherjon, S., Kanhai, H., Roelen, D., Claas, F. Increased T-cell activation in decidua parietalis compared to decidua basalis in uncomplicated human term pregnancy. Am J Reprod Immunol. 49 (5), 261-268 (2003).
- Red-Horse, K., et al. Trophoblast differentiation during embryo implantation and formation of the maternal-fetal interface. J Clin Invest. 114 (6), 744-754 (2004).
- Erlebacher, A.
- Christiansen, O. B.
- Vince, G. S., Starkey, P. M., Jackson, M. C., Sargent, I. L., Redman, C. W. Flow cytometric characterisation of cell populations in human pregnancy decidua and isolation of decidual macrophages. J Immunol Methods. 132 (2), 181-189 (1990).
- Trundley, A., Moffett, A. Human uterine leukocytes and pregnancy. Tissue Antigens. 63 (1), 1-12 (2004).
- Richards, R. G., Brar, A. K., Frank, G. R., Hartman, S. M., Jikihara, H. Fibroblast cells from term human decidua closely resemble endometrial stromal cells: induction of prolactin and insulin-like growth factor binding protein-1 expression. Biol Reprod. 52 (3), 609-615 (1995).
- Rango, U. Fetal tolerance in human pregnancy--a crucial balance between acceptance and limitation of trophoblast invasion. Immunol Lett. 115 (1), 21-32 (2008).
- Robson, A., et al. Uterine natural killer cells initiate spiral artery remodeling in human pregnancy. FASEB J. 26 (12), 4876-4885 (2012).
- Lima, P. D., Zhang, J., Dunk, C., Lye, S. J., Anne Croy,, B, Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy. Cell Mol Immunol. , (2014).
- Aluvihare, V. R., Kallikourdis, M., Betz, A. G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat Immunol. 5 (3), 266-271 (2004).
- Thomson, A. J., et al. Leukocytes infiltrate the myometrium during human parturition: further evidence that labour is an inflammatory process. Hum Reprod. 14 (1), 229-236 (1999).
- Young, A., et al. Immunolocalization of proinflammatory cytokines in myometrium, cervix, and fetal membranes during human parturition at term. Biol Reprod. 66 (2), 445-449 (2002).
- Osman, I., et al. Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term. Mol Hum Reprod. 9 (1), 41-45 (2003).
- Hamilton, S., et al. Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor. Biol Reprod. 86 (2), 39 (2012).
- Gomez-Lopez, N., et al. Evidence for a role for the adaptive immune response in human term parturition. Am J Reprod Immunol. 69 (3), 212-230 (2013).
- Hamilton, S. A., Tower, C. L., Jones, R. L. Identification of chemokines associated with the recruitment of decidual leukocytes in human labour: potential novel targets for preterm labour. PLoS One. 8 (2), e56946 (2013).
- Sindram-Trujillo, A. P., et al. Differential distribution of NK cells in decidua basalis compared with decidua parietalis after uncomplicated human term pregnancy. Hum Immunol. 64 (10), 921-929 (2003).
- Repnik, U., et al. Comparison of macrophage phenotype between decidua basalis and decidua parietalis by flow cytometry. Placenta. 29 (5), 405-412 (2008).
- Sanguansermsri, D., Pongcharoen, S. Pregnancy immunology: decidual immune cells. Asian Pac J Allergy Immunol. 26 (2-3), 171-181 (2008).
- Houser, B. L. Decidual macrophages and their roles at the maternal-fetal interface. Yale J Biol Med. 85 (1), 105-118 (2012).
- Tamiolakis, D., et al. Human decidual cells activity in women with spontaneous abortions of probable CMV aetiology during the first trimester of gestation. An immunohistochemical study with CMV-associated antigen. Acta Medica (Hradec Kralove). 47 (3), 195-199 (2004).
- Williams, P. J., Bulmer, J. N., Searle, R. F., Innes, B. A., Robson, S. C. Altered decidual leucocyte populations in the placental bed in pre-eclampsia and foetal growth restriction: a comparison with late normal pregnancy. Reproduction. 138 (1), 177-184 (2009).
- Eide, I. P., et al. Serious foetal growth restriction is associated with reduced proportions of natural killer cells in decidua basalis. Virchows Arch. 448 (3), 269-276 (2006).
- Brown, M., Wittwer, C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin Chem. 46 (8 Pt 2), 1221-1229 (2000).
- He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor flow cytometry analyses of cellular immune response in rhesus macaques. J Vis Exp. (38), (2010).
- Jaso, J. M., Wang, S. A., Jorgensen, J. L., Lin, P. Multi-color flow cytometric immunophenotyping for detection of minimal residual disease in AML: past, present and future. Bone Marrow Transplant. 49 (9), 1129-1138 (2014).
- Ritson, A., Bulmer, J. N. Isolation and functional studies of granulated lymphocytes in first trimester human decidua. Clin Exp Immunol. 77 (2), 263-268 (1989).
- Nagaeva, O., Bondestam, K., Olofsson, J., Damber, M. G., Mincheva-Nilsson, L. An optimized technique for separation of human decidual leukocytes for cellular and molecular analyses. Am J Reprod Immunol. 47 (4), 203-212 (2002).
- Male, V., Gardner, L., Moffett, A. Chapter 7. Isolation of cells from the feto-maternal interface. Curr Protoc Immunol. (UNIT 7.40), Wiley Online Library. 41-11 (2012).
- Soares, M. J., Hunt, J. S. Placenta and trophoblast: methods and protocols overview II. Methods Mol Med. 122, 3-7 (2006).
- Ritson, A., Bulmer, J. N. Extraction of leucocytes from human decidua. A comparison of dispersal techniques. J Immunol Methods. 104 (1-2), 231-236 (1987).
- White, H. D., et al. A method for the dispersal and characterization of leukocytes from the human female reproductive tract. Am J Reprod Immunol. 44 (2), 96-103 (2000).
- Maruyama, T., et al. Flow-cytometric analysis of immune cell populations in human decidua from various types of first-trimester pregnancy. Hum Immunol. 34 (3), 212-218 (1992).
- Zhang, J., et al. Isolation of lymphocytes and their innate immune characterizations from liver, intestine, lung and uterus. Cell Mol Immunol. 2 (4), 271-280 (2005).
- Carlino, C., et al. Recruitment of circulating NK cells through decidual tissues: a possible mechanism controlling NK cell accumulation in the uterus during early pregnancy. Blood. 111 (6), 3108-3115 (2008).
- Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Mol Reprod Dev. 75 (5), 818-827 (2008).
- Zhang, P., Wu, X., Hu, C., Wang, P., Li, X. Rho kinase inhibitor Y-27632 and Accutase dramatically increase mouse embryonic stem cell derivation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 48 (1), 30-36 (2012).
- Snegovskikh, V. V., et al. Intra-amniotic infection upregulates decidual cell vascular endothelial growth factor (VEGF) and neuropilin-1 and -2 expression: implications for infection-related preterm birth. Reprod Sci. 16 (8), 767-780 (2009).
- Oliver, C., Cowdrey, N., Abadia-Molina, A. C., Olivares, E. G. Antigen phenotype of cultured decidual stromal cells of human term decidua. J Reprod Immunol. 45 (1), 19-30 (1999).
- Chang, Y., Hsieh, P. H., Chao, C. C. The efficiency of Percoll and Ficoll density gradient media in the isolation of marrow derived human mesenchymal stem cells with osteogenic potential. Chang Gung Med J. 32 (3), 264-275 (2009).
- Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. , 670-672 (2014).
- Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
- Quan, Y., et al. Impact of cell dissociation on identification of breast cancer stem cells. Cancer Biomark. 12 (3), 125-133 (2012).
