Abstract
Graviditet kännetecknas av infiltration av leukocyter i reproduktiva vävnader och på moder och foster gränssnitt (decidua basalis och decidua parietalis). Detta gränssnitt är den anatomiska platsen för kontakt mellan moderns och fostervävnader; därför är det en immunologisk ningsställe under graviditet. Infiltrerande leukocyter på moder och foster gränssnitt spelar en central roll vid transplantationer, graviditet underhåll och tidpunkten för leverans. Därför kommer fenotypiska och funktionella karakterisering av dessa leukocyter ge insikt i de mekanismer som leder till graviditet störningar. Flera protokoll har beskrivits för att isolera infiltrera leukocyter från decidua basalis och decidua parietalis; Men bristen på konsekvens i reagens, enzymer och inkubationstider gör det svårt att jämföra dessa resultat. Häri beskrivs är en ny metod som kombinerar användning av milda mekaniska och enzymatiska dissociation tekniker för att bevara livskraften och integritet extracellulära och intracellulära markörer i leukocyter isolerade från mänskliga vävnader på moder och foster gränssnitt. Bortsett från immunfenotypning, cellodling och cellsortering, de framtida tillämpningar av detta protokoll är många och varierande. Efter detta protokoll, kan de isolerade leukocyter användas för att bestämma DNA-metylering, uttryck av målgener, leukocyter vitro funktionalitet (dvs, fagocytos, cytotoxicitet, T-celltillväxt, och plasticitet, etc.) i, och produktionen av reaktiva syreradikaler på moder och foster gränssnitt. Dessutom, med hjälp av den beskrivna protokollet, har detta laboratorium kunnat beskriva nya och ovanliga leukocyter på moder och foster gränssnitt.
Introduction
Graviditet kännetecknas av tre distinkta immunologiska faser: 1) implantation och tidig placentation samband med en pro-inflammatorisk respons (dvs liknar implantation ett "öppet sår"); 2) den andra trimestern och det mesta av den tredje trimestern av graviditeten när immun homeostas uppnås genom en övervägande anti-inflammatoriskt tillstånd på moder och foster gränssnitt; och 3) förlossning, en pro-inflammatoriskt tillstånd 1-7. Immunceller spelar en viktig roll i regleringen av det inflammatoriska svaret på moder och foster gränssnitt där deras förekomst och lokalisering förändring under hela graviditeten 6-9.
Hos människa representerar moder till foster gränssnitt ett område för direktkontakt mellan moderns (decidua) och foster (chorion eller trofoblasten) vävnader. Detta gränssnitt innefattar: 1) decidua parietalis som linjer livmodern som inte omfattas av moderkakan och är i sammanställningtill chorion laeve; och 2) decidua basalis, som ligger i basalplattan av moderkakan där det invaderas av mellanrums trofoblaster 10 (Figur 1). Intimiteten av dessa kontaktytor skapar förutsättningar för foster antigen exponering för moderns immunförsvar 11-13. Inte överraskande, leukocyter utgöra upp till 30-40% av de decidual cellerna 8,9,14,15 utöver typiska stromal-typ celler och körtelceller 8,14,16. Rollen av leukocyter på moder och foster gränssnitt omfattar flera processer som inkluderar begränsning av trofoblaster invasion 17, ombyggnad av spiral artärer 18,19, underhåll av moderns tolerans 12,20, och initiering av arbetskraften 21-26. Leukocyter för både adaptiva och medfödda lemmar i immunsystemet, det vill säga, T-celler, makrofager, neutrofiler, B-celler, dendritiska celler och NK-celler, har identifierats i decidual vävnader, och derasproportioner och aktiveringsstatus har visat sig variera spatialt och tidsmässigt hela dräktigheten 6-10,12,14,24,27-30. Störningar i leukocytpopulationen och / eller funktion är associerade med spontan abort 31, preeklampsi 32, intrauterin tillväxthämning 32,33, och för tidigt värkarbete 7,24. Därför kommer studiet av de fenotypiska egenskaper och funktioner av leukocyter på mänskliga moder och foster gränssnitt underlätta klarlägga de immunologiska vägar dysreglerad i graviditetsstörningar.
En av de mest kraftfulla verktyg som används för att bestämma fenotypen och funktionella egenskaper hos leukocyter är flödescytometri, teknik som gör den kvantitativa analysen av flera parametrar samtidigt 34-36. För att analysera leukocyter från flödescytometri, krävs isolering av leukocyter i en enkelcellsuspension. Därför ett sätt skilja infiltrerande leukocytes från moder till foster gränssnitt behövs för att studera deras fenotypiska och funktionella egenskaper.
Flera metoder har beskrivits för att isolera leukocyter från den humana moder och foster gränssnitt 10,14,25,27,37-39. Medan vissa tillämpa mekanisk uppdelning 10,25,27,38, andra använder enzymatisk digestion 37,40 för vävnadsdissociering. Eftersom mekanisk uppdelning ger ett lägre utbyte och minskad livsduglighet 41, och enzymatisk dissociation kan påverka viabiliteten och cellytmarkör retentionen 42, den metod som beskrivs häri kombinerar försiktig mekanisk dissociation med enzymatisk förbehandling för att öka utbytet av isolerade leukocyter utan att äventyra cellviabilitet. En liknande kombination av metoder har visat sig vara effektiv vid isolering av leukocyter från de decidual vävnad vid moder och foster gränssnitt 39. Därför protokollet beskrivet häri innebär mechaniska uppdelning med en automatisk vävnads dissociator som ökar konsekvens samtidigt som du sparar tid och arbete i jämförelse med traditionella mals med motsatta skalpeller, rakblad eller kirurgiska saxar 10,28. Enzymet väljs för vävnadsdissociering var Accutase. Till skillnad från vanligt förekommande kollagenas 43, dispas 44, och trypsin 45, Accutase (en cell lossnar lösning) kombinerar både allmän proteolytisk och kollagenolytiska aktiviteter som bidrar till en effektiv och skonsam dissociation 46,47. Efter dissociation, är leukocyter anrikade från den totala befolkningen i de decidual cellerna genom densitetsgradientcentrifugering. Olika densitetsgradient medier har tidigare utnyttjats, den vanligaste av dessa är Percoll (en suspension av kolloidala kiseldioxidpartiklar) 48 och Ficoll (en polymer av sackaros med en hög syntetisk molekylvikt) 49. Den överlägsna effektivitet av isolering av den sackaros polymeren har varit previously visas 50, och det protokoll som beskrivs häri ytterligare bevisar att detta densitetsgradient media ger en tillräckligt hög renhet av mononukleära leukocyter.
Följaktligen, det protokoll som beskrivs häri kombinerar den mekaniska vävnaden disaggregation med en automatisk vävnads dissociator, enzymatisk digerering med en cell avskildhet lösning och leukocyt separation med en densitetsgradient media (1,077 + 0,001 g / ml) för att isolera leukocyter från humana decidual vävnader. Detta protokoll har visat sig bevara cellyteantigener tillsammans med cellviabilitet. De isolerade leukocyter kan användas för flera tillämpningar som inkluderar immunfenotypning med flödescytometri och funktionella studier in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll är lämpligt för leukocyt isolering från decidua basalis och decidua parietalis som förberedelse för immunfenotypning genom flödescytometri. Vidare kan de isolerade cellerna kan användas för cellsortering, cellodling, RNA-isolering, och cytologi. Innan du arbetar med de prover som nämns i detta protokoll, måste mänsklig etiskt godkännande inhämtas från den lokala forskningsetiska kommittén och institutionella prövningsnämnder. Insamling och utnyttjande av mänskliga prover för forskningsändamål har godkänts av Institutional Review Boards av Eunice Kennedy Shriver det nationella institutet av barnhälsa och mänsklig utveckling (NICHD), National Institutes of Health (NIH), Institutionen för hälsa och mänskliga service (DHHS , Bethesda, MD, USA) och Wayne State University (Detroit, MI, USA). Skriftligt informerat medgivande erhölls från alla gravida kvinnor före samlingen av vävnadsprover.
OBS: När du arbetar med djurblod, celler, eller faraka medel som nämns i detta protokoll, är det viktigt att rätt biosäkerhet och laboratorie säkerhetsåtgärder följas.
1. Dissekering av mänskliga decidual vävnader
OBS: Den basala plattan är basen under och fäst vid moderkakan och representerar moderns yta. De chorioamniotic membran innefattar amnion och korion. Basalplattan innefattar decidua basalis och chorion innefattar decidua parietalis (Figur 1).
- Decidua Basalis
- Dissekera en bit av basalplattan från en kotyledon av moderkakan (figurerna 1A och 1B).
- Placera den på en steril skärbräda med moderkakan villi vända uppåt. Sidan visar placenta villi är vanligtvis blodigt röda med håriga vävnad i utseende. Basalplattan är slät och svagt röd färg.
- Använd skarpa, fina punkt sax och pincett för att ta bort Villgare vävnad och blodkärl. Håll vävnaden doppat i 1x PBS (Ca2 + - och Mg2 + - gratis) under processen (Figur 1C). Samla 2 till 3 av dessa bitar och skölj dem noggrant med 1x PBS för att avlägsna blod (Figur 1D).
- Decidua Parietalis
- Dissekera en bit av chorioamniotic membran (ca 10 cm x 10 cm, Figur 1E). Placera den på bordet med chorion uppåt. Den chorionic sidan innehåller blodiga proppar och är oftast lätt gulaktig färg.
- Använd fin-punkt pincett för att ta bort så många av de blodproppar som möjligt (Figur 1E). Skölj membranet i sterila 1x PBS för att rengöra överflödigt blod från membranet tills 1x PBS är klart.
- Använd en engångs steril cellskrapa för att försiktigt skrapa den decidual skiktet från membranet. Applicera sterilt 1x PBS på memBrane när du fyller denna process (Figur 1F). Samla decidual vävnader och placera dem i en 50 ml plaströr med sterilt 1x PBS (Figur 1G).
2. Mekanisk Uppdelnings och enzymatisk spjälkning
- Tvätta vävnaden dissekerades från decidua basalis (från steg 1.1.3) eller decidua parietalis (från steg 1.2.3) med steril 1 x PBS i en 50 ml plaströr. Ta vävnadspellets genom centrifugering vid 300 xg under 5 min vid RT.
- Aspirera supernatanten ovanför vävnaden pelleten försiktigt utan att störa pelleten.
OBS: Vid denna punkt, pelletsen är mycket lösa, eftersom de innehåller röda blodkroppar. Om volymen av pelleten är omkring eller mindre än 3 ml, återsuspendera pelleten i 6 ml celllösgör lösning förvärmas till 37 ° C. Om pellets är större än 3 ml volym, tillsätt mer cell lossnar lösning (tillsätt ca 2 gånger the volymen av vävnadsprover). - Överför homogeniserade vävnader (decidua basalis + celllösgör lösning eller decidua parietalis + cell lossnar lösning) till en C rör.
- Placera C röret i den automatiska dissociator och köra motsvarande program.
OBS: Programmet för decidua basalis löper på 17 sekunder med 668 totalt varv per körning. Programmet för decidua parietalis löper på 37 sekunder med 235 totalt varv per körning. Dessa program har anpassats för att isolera leukocyter från decidua basalis eller decidua parietalis med god avkastning och cellviabilitet. - Efter den mekaniska uppdelning av vävnader, smälta vävnaderna med en kommersiellt tillgänglig cell lossnar lösning såsom Accutase; (En cocktail, som innehåller proteolytiska och kollagenolytiska enzymer) under 45 min vid 37 ° C under försiktig omrörning.
3. Isolering av leukocyter
- Efter inkubation, tillsätt 10 ml 1x PBS till Digestion blandningen och för det genom en 100 | im cellfilter in i ett 50 ml plaströr. Beroende på klibbigheten hos uppslutningsblandningen, kan man behöva använda flera cell silar för en blandning.
- Fyll röret med 1 x PBS och centrifugera vid 300 xg under 5 min vid RT. Ta bort 1x PBS över cellpellet noggrant och återsuspendera pellets med 5 ml iskall FACS buffert.
OBS: För att studera polymorfonukleära och mononukleära leukocyter tillsammans, gå till steg 6,1; att studera mononukleära leukocyter, fortsätter till steg 3,3. - Lägg 5 ml 20% densitetsgradient media (1,077 + 0,001 g / ml) till en 15 ml plaströr och långsamt överlagra cellsuspensionen på toppen av densitetsgradienten media. Medan skiktning provet, är det viktigt att inte blanda densitetsgradienten media med cellsuspensionen.
- Centrifugera med en swing-out-rotor vid 500 xg under 30 min vid 4 C utan bromsen. Det är mycket viktigt att stänga av bromsen för att undvika att blanda celler och lOsing gradienten. Leukocyter kommer att finnas i gränssnittet mellan densitetsgradienten media och FACS buffert.
- Ta bort det övre skiktet som innehåller FACS buffert och cellrester mycket försiktigt med en pipett. Bandet vid gränsytan innehåller de decidual mononukleära celler och en del av polymorfonukleära leukocyter.
- Överföra celler vid gränsytan helt i ett annat 15 ml plaströr. Lägg minst 3 gånger mer volym FACS buffert.
- Centrifugera vid 300 xg under 5 min för att pelletisera cellerna. Aspirera supernatanten och tvätta cellerna med FACS-buffert. Pelletisera cellerna med en annan centrifugering vid 300 xg under 5 min vid RT.
OBS: För att utföra cellkulturen, se steg 4. För att utföra cellsortering, se steg 5. För att utföra immunfenotypning, se steg 6.
4. Ansökningar - Cellodling
- Återuppslamma cellerna från steg 3,7 i 1 ml RPMI odlingsmedium 1640. Räkna levande celler using en automatisk cellräknare eller en hemocytometer och trypanblått lösning 0,4%.
- Summera mängden RPMI odlingsmedium för att göra en cellkoncentration av 1 x 10 6 celler / ml. Cellerna är nu redo för kultur.
5. Ansökningar - Isolering av makrofager för primär Cell Culture
- För att isolera CD14 + celler, magnetiskt märka cellerna från steg 3,7 med CD14 mikropärlor (20 | j, l pärlor per 10 7 celler), inkubera i 15 min vid 4 C och separat CD 14+ celler från andra typer av celler genom att anbringa ett magnetiskt fält. Efter 2 tvättar med Mac buffert och avlägsnande av magnetfältet, eluera magnetiskt behållit CD14 + celler med Mac buffert.
- Efter centrifugering, återsuspendera cellpelletar i RPMI odlingsmedium 1640. Cellerna är redo för plätering (Figur 2).
6. Program - immunfenotypning
- För att använda celler för immunophenotyping, återsuspendera cellerna från steg 3,7 i 1 ml 1 x PBS. Räkna livskraftiga celler med användning av en automatisk cellräknare eller en hemocytometer och en lösning av trypanblått 0,4%.
- Märka cellerna med en fixerbar viabilitet färgämne (Figur 3). Tvätta cellerna två gånger med FACS buffert och återsuspendera cellerna i fläcken buffert. Inkubera med en FcR blockerare för 15 min vid 4 ° C.
- Lägg extracellulära antikroppar konjugerade till fluorokromer. Till exempel, i detta protokoll, använda anti-CD3, anti-CD19, anti-CD14, anti-CD15 och anti-CD56-antikroppar (Tabell 1). Inkubera under 30 minuter vid 4 ° C i mörker.
- Efter två tvättningar med 1 x PBS, kommer cellerna att analyseras i 500 | il fläck buffert med användning av en flödescytometer. En representation av grindningsstrategin som används för att analysera leukocyt delpopulationer som finns i decidual vävnader visas i figur 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
. Dissektion av mänskliga vävnader på moder och foster gränssnitt (decidua basalis och decidua parietalis) visas i fig 1 Detta förfarande inbegriper dissektion av basalplattan, vilket inkluderar decidua basalis (Figur 1A - D). Decidua basalis erhålles genom avlägsnande av placenta-villi (fetalt sidan) från basalplattan (Figur 1C). Decidua parietalis uppsamlas genom att försiktigt skrapa den chorionic membran (figur 1E - F). Fig 2 visar morfologin av isolerade makrofager (CD14 +) uppsamlade från decidua parietalis i en gången graviditet med användning magnetisk cellsortering. Isolerade makrofager upprätthålls förmågan att frisätta cytokiner efter 3 dagars odling (data ej visade). Utbytet av livsdugliga celler isolerade från decidua basalis och decidua parietalis visas i figur 3, och den är större än 90% i båda.
Figur 1. Human moder till foster gränssnitt. Placenta och chorioamniotic membran (A) Basal platta dissekeras från moderkakan; (B) basalplattan separeras från placenta villi; (C) placenta villi trimmas från basalplattan inklusive decidua basalis; (D) decidua basa lis sköljs i 1x PBS; (E) ett fragment av den chorionic membranet erhålles och blodproppar är försiktigt avlägsnats; (F) decidua parietalis försiktigt skrapas; och (G) decidua parietalis (streckad linje) är separerad från den chorionic membranet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. decidual makrofager i odling. Makrofager (CD14 + celler) isolerades från decidua parietalis vid graviditet. Makrofager ströks i plastkammarobjektglasen med RPMI1640 + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin + 50 ng / ml MCSF. Bilder togs vid tidpunkten för plätering (A) och efter 3 dagar i kultur (C).3 / 52863fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Totalt cellviabilitet. Livskraft totala celler som isolerats från decidua basalis och decidua parietalis bestämdes följande densitetsgradient med hjälp av en fastställbara livskraft färgämne (steg 6,2). Livskraft av isolerade celler> 95% enligt den levande / döda cellviabiliteten färgning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. gating strategi för decidual leukocyt subpopulationer. Leukocyter gated med FSC och SSC. Levande celler sedan gated enligt lönsamheten grind (Live). Viabla celler separerades i neutrophils (CD15 +) och makrofager (CD14 +). Den CD14-CD15- befolkningen sedan ytterligare separeras i NK-celler (CD3-CD56 +), NKT-celler (CD3 + CD56 +), T-celler (CD3 +) och B-celler (CD19 +). Klicka här för att se en större version av denna figur.
. Figur 5. Leukocyte subpopulationer i decidual vävnader Neutrofiler (CD15 +) och makrofager (CD14 +) var gated inom lönsamheten gate; T-celler (CD3 +) och B-celler (CD19 +) var gated inom CD14-CD15- grind. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Sällsynta leukocyter subpopulationer i decidella vävnader. NK-celler (CD56 +) och NKT-celler (CD56 + CD3 +) var gated inom CD14-CD15- grind. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Antikropp lista | Företaget | Katalognummer |
| BD Pharmingen Anti-human CD56-PE-Cy7 | BD Biosciences | 557.747 |
| BD Horizon Anti-humant CD15-BV605 | BD Biosciences | 562.980 |
| BD Horizon Anti-humant CD14-BUV395 | BD Biosciences | 563.561 |
| BD Horizon Anti-humant CD19-BUV737 | BD Biosciences | 564.303 |
| Brilliant Violet 650 Anti-human CD3 antikropp | Biolegend | 317.323 |
Tabell 1. Förteckning över antikroppar som används för leukocyter delmängd immunfenotypning
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Karakterisering av de funktionella och fenotypiska egenskaper hos infiltrerande leukocyter vid humana moder och foster gränssnitt är väsentlig för förståelsen av de immunmekanismer som leder till graviditetsstörningar. Flera tekniker har beskrivits för att isolera leukocyter från humant moder och foster gränssnitt under hela graviditeten 10,14,25,28,37,42,43. Men var och en av dessa tekniker är distinkt, använder olika enzymer eller enzymkombinationer, kräver olika dissociation gånger, inte ange vilka kvantiteter av vävnad, och, viktigast av allt, inte alltid anger livskraft de isolerade cellerna. Protokollet som beskrivs här tillåter isolering av infiltrerande leukocyter på mänskliga moder och foster gränssnitt (decidua basalis och decidua parietalis) vilket resulterar i ett högt utbyte av livskraft och ger detaljerad information om de kommersiella reagens, buffert förberedelse, vävnads kvantiteter, och inkubationstider validaTed i vårt laboratorium.
Den första kritiska steget i leukocyt isoleringsprocessen är vävnadsdissociering; detta steg innefattar mekanisk desegregering och / eller enzymatisk dissociation. Mekanisk segregeringen är godkänt resultat genom att skrapa chorion när isolera decidua parietalis (Figur 1F) och genom att trimma placenta villi från basalplattan när isolera decidua basalis (Figur 1C) 10,28. Därför protokollet beskrivet häri inkluderar både förfaranden som första steg. Det är dock viktigt att tänka på att basalplattan (moderns vävnader) och placenta villi (fostervävnad) är intimt kopplade, vilket kan leda till kontaminering av fetala leukocyter när isolera leukocyter från decidua basalis. För att undvika foster kontamination, rekommenderar protokollet häri tvätta trimmade basalplattan två eller tre gånger (Figur 1D). Efter cellskrapande eller trimningfrån decidua basalis eller decidua parietalis har ett ytterligare steg för mekanisk vävnad uppdelning rekommenderats 39. Detta steg rekommenderas eftersom de infiltrerande leukocyter vid moderns foster gränssnitt express celladhesionsmolekyler som är fast fästa dem till den extracellulära matrisen 6,7. Därför det protokoll som beskrivs häri involverar mekanisk uppdelning med en automatisk vävnads dissociator som ökar konsekvens samtidigt som du sparar tid och arbete i jämförelse med traditionella mals med skalpeller, rakblad eller kirurgiska saxar 10,28.
Ett andra kritiskt steg i vävnadsdissociering processen är enzymatisk dissociation. Singel enzymer och en kombination av olika enzymer har använts för att isolera infiltrerande leukocyter från decidua basalis och decidua parietalis 10,14,25,28,37,42,43. I många fall, de enzymer beredda att en viss koncentration för hand i laborarium kan bli föremål för mänskliga fel. Här, i stället, en färdig att använda renat kollagenas / neutralt proteas cocktail, Accutase, har genomförts i laboratoriet; som en kommersiell enzym, har det visat sig ge tillförlitliga resultat i cellodling 51. Accutase (en celllösgörlösning) är känt för att effektivt lösgöra makrofager från odlingsplattor utan skrapning och, viktigast av allt, utan att förlora ytantigener 51. Detta beredda enzym har också använts för att bearbeta rötning av människor och djur nervsystemet vävnader, vilket resulterar i livskraftiga isolerade celler som förblir hållbara under en längre period som med tiden möjliggör deras cellodling 52. Dessutom har denna lösning bevarar även CD24 antigenicitet i celler isolerade från centrala nervsystemet vävnader 52. Jämfört med Liberase-1, en annan blandning av kollagenas och neutralt proteas, varken Accutase eller Liberase-1 genererar fria DNA-aggregat; emellertid är Accutase gEntler än Liberase-1 under vävnadsdissociering 52. På grund av detta, inte Accutase inte dissociera cellaggregat efter uppslutningen 52. För att övervinna denna begränsning, det protokoll som beskrivs häri inkluderar automatisk vävnad uppdelning av decidua basalis och decidua parietalis före vävnadsdissociering med lösningen. Accutase har också visat sin överlägsenhet till trypsin i bevarandet av CD44, en cancerstamcells ytmarkör 53. Vår laboratorium studier har genomgående noteras att lösgör lösningen bevarar ytantigenerna. I själva verket har skillnader mellan graviditetsstörningar och normala graviditeter finns i uttrycket av flera extracellulära och intracellulära markörer i makrofager (CD14 + celler), neutrofiler (CD15 + celler), T-celler (CD3 + -celler), och B-celler (CD19 + celler), inklusive CD80, CD86, CD163, CD209, ICAM3, CD45RO, CD45RA, CXCR3, CCR7, CCR6, CD4, CD8, CD25, FOXP3, CD24, CD38, CD27, CD38, CD43, CD23, IgM, IgD, CD5, T-bet, GATA-3 och RORγt, och cytokinfrisättning. Därför är det protokoll som beskrivs häri optimalt för immunfenotypning av infiltrations leukocyter vid humana moder och foster gränssnittet, som visas i de representativa resultat.
En viktig fördel med det protokoll som beskrivs häri är att den medger för isolering av leukocyter med ett högt utbyte av viabla celler. Det representativa data visar att> 90% av de isolerade cellerna är livsdugliga. Detta är av stor betydelse, eftersom detta protokoll har tillåtit studien av de funktionella egenskaperna hos de celler som isolerats från humana vävnader vid moder och foster gränssnitt. Till exempel, har kulturer av decidual makrofager och studiet av cytokinfrisättning enligt stimulering utförts med hjälp av detta protokoll.
För att uppnå goda resultat med hjälp av den beskrivna protokollet, är det viktigt att beakta följande faktorer: 1) vävnads collectipå måste utföras inom 1-2 timmar efter förlossningen, och dessa vävnader måste placeras i en behållare med 1x PBS vid 4 ° C för att bevara livskraften hos de isolerade cellerna; 2) mekanisk vävnad uppdelning ska utföras med hjälp av en automatisk homogenisator vid godkända tider, som beskrivs i detta protokoll; 3) hur länge inkubation med cell lossnar lösningen måste vara mindre än 1 timme sedan dess aktivitet efter denna tid minskar; 4) temperaturen för inkubering med celllösgör lösningen måste hållas vid 37 ° C för att erhålla den optimala aktiviteten hos detta enzym; 5) cellpelleten manipulation måste göras försiktigt med mikropipetter, eftersom användning av virveln kan skada integriteten av cellerna (kom ihåg att isolerade celler är differentierade och abrupt manipulation kan lätt minska deras livskraft); 6) buffert och centrifug temperaturer måste hållas vid samma temperatur som cellsuspensionen; 7) isolerade celler skall behandlas för immunfenotypning eller användas omedelbart som deras livskraft minskar snabbt; och 8) när de utför immunfenotypning prover måste tas med en flödescytometer omedelbart för bästa resultat.
En av begränsningarna i detta protokoll är kostnaden för Accutase, vilket är dyrare än andra enzymer med liknande funktioner, t.ex., trypsin, dispas II och kollagenas. Men de fördelar som Accutase visar utöver dessa enzymer är överlägsna. En andra begränsning av protokollet är kravet på en automatisk vävnads dissociator, som inte är en vanlig laboratorieinstrument och därför kan bli kostsamt. För att övervinna denna begränsning, kan också utföras vävnaden segregeringen använder små kirurgisk sax; emellertid kan detta steg inte överstiga 3-5 minuter eftersom längre perioder har visat sig minska utbytet av viabla celler. Alla dissociations måste utföras av samma forskare att minimera variabiliteten.
I sammanfattning, den proprotokoll erbjuder häri en ny strategi som kombinerar användandet av milda mekaniska och enzymatiska vävnadsdissociering tekniker för att bevara integriteten av extracellulära och intracellulära markörer i leukocyter isolerade från mänskliga vävnader på moder och foster gränssnitt. Bortsett från immunfenotypning, cellodling och cellsortering, de framtida tillämpningar av detta protokoll är många och varierande. Vi har framgångsrikt använder detta protokoll för att isolera decidual leukocyter för in vitro-studier av leukocyt funktionalitet (dvs, cytotoxicitet, T-celltillväxt och plasticitet, etc.), och produktionen av reaktiva syreradikaler i leukocyter isolerade från decidual vävnader (data visade). I själva verket, med hjälp av den beskrivna protokollet, har vårt laboratorium kunnat beskriva nya och ovanliga leukocyter på moder och foster gränssnitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Eunice Kennedy Shriver det nationella institutet av barnhälsa och mänsklig utveckling, NIH / DHHS. Detta arbete stöddes också delvis av Wayne State University Perinatal initiativet i Maternal, perinatal och barns hälsa. Vi tackar Maureen McGerty (Wayne State University) för hennes kritiska läsningar av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection | |||
| Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers | Any vendor | 20012-027 | |
| 1X phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | (1X PBS) | |
| Large and small Petri dishes | Any vendor | ||
| Dissociation | |||
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | (cell detachment solution) |
| Sterile 2 ml safe-lock conical tubes | Any vendor | ||
| 50 ml conical centrifuge tubes | Any vendor | ||
| 100 µm cell strainers | FALCON/Corning | 352360 | |
| 5 ml round bottom polystyrene test tubes | Any vendor | ||
| Transfer pipettes | Any vendor | ||
| C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| Cell Culture | |||
| RPMI culture medium 1640 | Life Technologies | 22400-089 | (1X) (10% FBS and 1% P/S) |
| Plastic chamber slides | Thermo Scientific | 177437 | |
| Incubator | Thermo Scientific Corporation | HEPA Class 100 | |
| Water bath | Fisher Scientific | ISOTEMP 110 | |
| Cell counter | Nexelcom | Cellometer Auto2000 | |
| Microscope | Olympus | Olympus CKX41 | |
| Cell Separation | |||
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Cell separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| 30 μm pre-separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-40 | |
| Multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 15 ml safe-lock conical tubes | Any Vendor | ||
| MACS buffer | (0.5% bovine serum albumin, 2 mM EDTA and 1X PBS) | ||
| Reagents | |||
| FcR Blocking | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | (Fc Block) |
| Anti-human cell surface antigen antibodies | BD Biosciences | (Table 1) | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| LIVE/DEAD viability dye | BD Biosciences | 564406 | |
| Lyse/Fix buffer | BD Biosciences | 346202 | |
| FACS buffer | (0.1% BSA, 0.05% Sodium Azide, and 1X PBS, pH=7.4) | ||
| Staining buffer | BD Biosciences | 554656 | |
| Trypan Blue solution 0.4% | Life Technologies | 15250-011 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | 20% density gradient media (1.077 + 0.001 g/ml) |
| Additional Instruments | |||
| Incubator with shaker | Thermo Scientific | MAXQ 4450 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSR-Fortessa | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | SpinChron DLX | |
| Vacuum system | Any vendor | ||
| Automatic tissue dissociator | Miltenyi Biotec | gentleMACS Dissociator | |
References
- Kelly, R. W. Inflammatory mediators and parturition. Rev Reprod. 1 (2), 89-96 (1996).
- Keelan, J. A., et al. Cytokines, prostaglandins and parturition--a review. Placenta. 24, Suppl A. S33-S46 (2003).
- Romero, R., et al. Inflammation in preterm and term labour and delivery. Semin Fetal Neonatal Med. 11 (5), 317-326 (2006).
- Norman, J. E., Bollapragada, S., Yuan, M., Nelson, S. M. Inflammatory pathways in the mechanism of parturition. BMC Pregnancy Childbirth. 7, Suppl 1. S7 (2007).
- Mor, G., Cardenas, I. The immune system in pregnancy: a unique complexity. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 425-433 (2010).
- Gomez-Lopez, N., Guilbert, L. J., Olson, D. M. Invasion of the leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy. J Leukoc Biol. 88 (4), 625-633 (2010).
- Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. A., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol. , (2014).
- Bulmer, J. N., Morrison, L., Longfellow, M., Ritson, A., Pace, D. Granulated lymphocytes in human endometrium: histochemical and immunohistochemical studies. Hum Reprod. 6 (6), 791-798 (1991).
- Bulmer, J. N., Williams, P. J., Lash, G. E. Immune cells in the placental bed. Int J Dev Biol. 54 (2-3), 281-294 (2010).
- Sindram-Trujillo, A., Scherjon, S., Kanhai, H., Roelen, D., Claas, F. Increased T-cell activation in decidua parietalis compared to decidua basalis in uncomplicated human term pregnancy. Am J Reprod Immunol. 49 (5), 261-268 (2003).
- Red-Horse, K., et al. Trophoblast differentiation during embryo implantation and formation of the maternal-fetal interface. J Clin Invest. 114 (6), 744-754 (2004).
- Erlebacher, A. Immunology of the maternal-fetal interface. Annu Rev Immunol. 31, 387-411 (2013).
- Christiansen, O. B. Reproductive immunology. Mol Immunol. 55 (1), 8-15 (2013).
- Vince, G. S., Starkey, P. M., Jackson, M. C., Sargent, I. L., Redman, C. W. Flow cytometric characterisation of cell populations in human pregnancy decidua and isolation of decidual macrophages. J Immunol Methods. 132 (2), 181-189 (1990).
- Trundley, A., Moffett, A. Human uterine leukocytes and pregnancy. Tissue Antigens. 63 (1), 1-12 (2004).
- Richards, R. G., Brar, A. K., Frank, G. R., Hartman, S. M., Jikihara, H. Fibroblast cells from term human decidua closely resemble endometrial stromal cells: induction of prolactin and insulin-like growth factor binding protein-1 expression. Biol Reprod. 52 (3), 609-615 (1995).
- Rango, U. Fetal tolerance in human pregnancy--a crucial balance between acceptance and limitation of trophoblast invasion. Immunol Lett. 115 (1), 21-32 (2008).
- Robson, A., et al. Uterine natural killer cells initiate spiral artery remodeling in human pregnancy. FASEB J. 26 (12), 4876-4885 (2012).
- Lima, P. D., Zhang, J., Dunk, C., Lye, S. J., Anne Croy,, B, Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy. Cell Mol Immunol. , (2014).
- Aluvihare, V. R., Kallikourdis, M., Betz, A. G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat Immunol. 5 (3), 266-271 (2004).
- Thomson, A. J., et al. Leukocytes infiltrate the myometrium during human parturition: further evidence that labour is an inflammatory process. Hum Reprod. 14 (1), 229-236 (1999).
- Young, A., et al. Immunolocalization of proinflammatory cytokines in myometrium, cervix, and fetal membranes during human parturition at term. Biol Reprod. 66 (2), 445-449 (2002).
- Osman, I., et al. Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term. Mol Hum Reprod. 9 (1), 41-45 (2003).
- Hamilton, S., et al. Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor. Biol Reprod. 86 (2), 39 (2012).
- Gomez-Lopez, N., et al. Evidence for a role for the adaptive immune response in human term parturition. Am J Reprod Immunol. 69 (3), 212-230 (2013).
- Hamilton, S. A., Tower, C. L., Jones, R. L. Identification of chemokines associated with the recruitment of decidual leukocytes in human labour: potential novel targets for preterm labour. PLoS One. 8 (2), e56946 (2013).
- Sindram-Trujillo, A. P., et al. Differential distribution of NK cells in decidua basalis compared with decidua parietalis after uncomplicated human term pregnancy. Hum Immunol. 64 (10), 921-929 (2003).
- Repnik, U., et al. Comparison of macrophage phenotype between decidua basalis and decidua parietalis by flow cytometry. Placenta. 29 (5), 405-412 (2008).
- Sanguansermsri, D., Pongcharoen, S. Pregnancy immunology: decidual immune cells. Asian Pac J Allergy Immunol. 26 (2-3), 171-181 (2008).
- Houser, B. L. Decidual macrophages and their roles at the maternal-fetal interface. Yale J Biol Med. 85 (1), 105-118 (2012).
- Tamiolakis, D., et al. Human decidual cells activity in women with spontaneous abortions of probable CMV aetiology during the first trimester of gestation. An immunohistochemical study with CMV-associated antigen. Acta Medica (Hradec Kralove). 47 (3), 195-199 (2004).
- Williams, P. J., Bulmer, J. N., Searle, R. F., Innes, B. A., Robson, S. C. Altered decidual leucocyte populations in the placental bed in pre-eclampsia and foetal growth restriction: a comparison with late normal pregnancy. Reproduction. 138 (1), 177-184 (2009).
- Eide, I. P., et al. Serious foetal growth restriction is associated with reduced proportions of natural killer cells in decidua basalis. Virchows Arch. 448 (3), 269-276 (2006).
- Brown, M., Wittwer, C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin Chem. 46 (8 Pt 2), 1221-1229 (2000).
- He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor flow cytometry analyses of cellular immune response in rhesus macaques. J Vis Exp. (38), (2010).
- Jaso, J. M., Wang, S. A., Jorgensen, J. L., Lin, P. Multi-color flow cytometric immunophenotyping for detection of minimal residual disease in AML: past, present and future. Bone Marrow Transplant. 49 (9), 1129-1138 (2014).
- Ritson, A., Bulmer, J. N. Isolation and functional studies of granulated lymphocytes in first trimester human decidua. Clin Exp Immunol. 77 (2), 263-268 (1989).
- Nagaeva, O., Bondestam, K., Olofsson, J., Damber, M. G., Mincheva-Nilsson, L. An optimized technique for separation of human decidual leukocytes for cellular and molecular analyses. Am J Reprod Immunol. 47 (4), 203-212 (2002).
- Male, V., Gardner, L., Moffett, A. Chapter 7. Isolation of cells from the feto-maternal interface. Curr Protoc Immunol. (UNIT 7.40), Wiley Online Library. 41-11 (2012).
- Soares, M. J., Hunt, J. S. Placenta and trophoblast: methods and protocols overview II. Methods Mol Med. 122, 3-7 (2006).
- Ritson, A., Bulmer, J. N. Extraction of leucocytes from human decidua. A comparison of dispersal techniques. J Immunol Methods. 104 (1-2), 231-236 (1987).
- White, H. D., et al. A method for the dispersal and characterization of leukocytes from the human female reproductive tract. Am J Reprod Immunol. 44 (2), 96-103 (2000).
- Maruyama, T., et al. Flow-cytometric analysis of immune cell populations in human decidua from various types of first-trimester pregnancy. Hum Immunol. 34 (3), 212-218 (1992).
- Zhang, J., et al. Isolation of lymphocytes and their innate immune characterizations from liver, intestine, lung and uterus. Cell Mol Immunol. 2 (4), 271-280 (2005).
- Carlino, C., et al. Recruitment of circulating NK cells through decidual tissues: a possible mechanism controlling NK cell accumulation in the uterus during early pregnancy. Blood. 111 (6), 3108-3115 (2008).
- Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Mol Reprod Dev. 75 (5), 818-827 (2008).
- Zhang, P., Wu, X., Hu, C., Wang, P., Li, X. Rho kinase inhibitor Y-27632 and Accutase dramatically increase mouse embryonic stem cell derivation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 48 (1), 30-36 (2012).
- Snegovskikh, V. V., et al. Intra-amniotic infection upregulates decidual cell vascular endothelial growth factor (VEGF) and neuropilin-1 and -2 expression: implications for infection-related preterm birth. Reprod Sci. 16 (8), 767-780 (2009).
- Oliver, C., Cowdrey, N., Abadia-Molina, A. C., Olivares, E. G. Antigen phenotype of cultured decidual stromal cells of human term decidua. J Reprod Immunol. 45 (1), 19-30 (1999).
- Chang, Y., Hsieh, P. H., Chao, C. C. The efficiency of Percoll and Ficoll density gradient media in the isolation of marrow derived human mesenchymal stem cells with osteogenic potential. Chang Gung Med J. 32 (3), 264-275 (2009).
- Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. , 670-672 (2014).
- Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
- Quan, Y., et al. Impact of cell dissociation on identification of breast cancer stem cells. Cancer Biomark. 12 (3), 125-133 (2012).
