Abstract
Graviditet er preget av infiltrasjon av leukocytter i reproduktive vev og ved maternal-føtal grensesnitt (decidua basalis og decidua parietalis). Dette grensesnittet er anatomisk kontaktstedet mellom fostervev mors og; Derfor er det et immunologisk virknings under graviditet. Infiltrere leukocytter ved maternal-føtal grensesnitt spille en sentral rolle i implantasjon, graviditet vedlikehold, og tidspunkt for levering. Derfor vil fenotypiske og funksjonelle karakterisering av disse leukocytter gi innsikt i de mekanismene som fører til graviditet lidelser. Flere protokoller har blitt beskrevet for å isolere infiltrere leukocytter fra decidua basalis og decidua parietalis; Men mangelen på konsistens i reagenser, enzymer og tider inkubering gjør det vanskelig å sammenligne disse resultatene. Beskrevet her er en ny tilnærming som kombinerer bruk av milde mekaniske og enzymatiske dissociation teknikker for å bevare levedyktigheten og integriteten til ekstracellulære og intracellulære markører i leukocytter isolert fra menneskelig vev ved maternal-føtal grensesnitt. Bortsett fra immunfenotyping, cellekultur, og celle sortering, de fremtidige anvendelser av denne protokollen er mange og varierte. Etter denne protokollen, kan de isolerte leukocytter benyttes for å bestemme DNA-metylering, ekspresjon av målgener, in vitro leukocytt-funksjonalitet (dvs. fagocytose, cytotoksisitet, T-celle-proliferasjon, og plastisitet, etc.), og produksjon av reaktive oksygenarter ved maternal-føtal grensesnitt. I tillegg bruker den beskrevne protokollen, har dette laboratoriet kunnet beskrive nye og sjeldne leukocytter ved maternal-føtal grensesnitt.
Introduction
Graviditet er preget av tre forskjellige immunologiske faser: 1) implantasjon og tidlig placentation assosiert med en pro-inflammatorisk respons (dvs. ligner implantasjon et 'åpent sår'); 2) andre trimester og det meste av tredje trimester av svangerskapet når immun homeostase er oppnådd gjennom en overveiende anti-inflammatorisk staten ved maternal-føtal grensesnitt; og 3) fødsel, en pro-inflammatorisk tilstand 1-7. Immunceller spiller en viktig rolle i reguleringen av den inflammatoriske respons ved maternal-føtal grensesnitt hvor deres overflod og lokalisering endring gjennom hele svangerskapet 6-9.
Hos mennesker, representerer maternal-føtal grensesnittet et område på direkte kontakt mellom mors (decidua) og fosterets (chorion eller trophoblast) vev. Dette grensesnittet inkluderer: 1) decidua parietalis som linjer livmorhulen som ikke er dekket av morkaken og er i sidestillingtil chorion laeve; og 2) decidua basalis, som ligger i basalplaten av placenta, hvor det er invadert av interstitielle trofoblaster 10 (figur 1). Intimiteten i disse områdene av kontakt skaper forutsetninger for foster antigen eksponering for mors immunsystemet 11-13. Ikke overraskende leukocytter omfatte opp til 30-40% av uterusslimhinneceller 8,9,14,15 i tillegg til typiske stromal-type celler og kjertelceller 8,14,16. Rollen av leukocytter ved maternal-føtal grensesnitt omfatter flere prosesser som omfatter begrensning av trophoblast invasjonen 17, ombygging av spiralarteriene 18,19, vedlikehold av mors toleranse 12,20, og initiering av arbeidskraft 21-26. Leukocytter fra både den adaptive og medfødte lemmer av immunsystemet, det vil si T-celler, makrofager, neutrofiler, B-celler og dendrittiske celler, NK-celler, er blitt identifisert i Deciduale vev, og deresproporsjoner og aktiveringsstatusen har vist seg å variere romlig og tidsmessig gjennom hele svangerskapet 6-10,12,14,24,27-30. Forstyrrelser i leukocytt befolkningen og / eller funksjon er assosiert med spontan abort 31, preeklampsi 32, intrauterin vekst begrensning 32,33, og for tidlig fødsel 7,24. Derfor vil studie av fenotypiske egenskaper og funksjonalitet av leukocytter på menneske maternal-føtal grensesnitt lette klarlegging av de immunologiske trasé dysregulerte i svangerskapet lidelser.
En av de mest kraftfulle verktøy som brukes til å bestemme fenotypen og funksjonelle egenskaper til leukocytter er flowcytometri, teknologi som tillater kvantitativ analyse av flere parametere samtidig 34-36. For å analysere leukocytter ved flowcytometri, er isolasjon av leukocytter i en enkeltcellesuspensjon nødvendig. Derfor, for å separere en fremgangsmåte infiltrerende leukocytes fra mor til foster grensesnittet er nødvendig for å studere deres fenotypiske og funksjonelle egenskaper.
Flere metoder har blitt beskrevet å isolere leukocytter fra menneske maternal-føtal grensesnitt 10,14,25,27,37-39. Mens noen gjelder mekanisk disaggregation 10,25,27,38, andre bruker enzymatisk fordøyelse 37,40 for vev dissosiasjon. Fordi mekanisk dekomponering gir en lavere utbytte og redusert levedyktighet 41, og enzymatisk dissosiasjon kan påvirke levedyktigheten og celleoverflatemarkør retensjon 42, den her beskrevne metode kombineres skånsom mekanisk dissosiasjon med enzymatisk forbehandling for å øke utbyttet av isolerte leukocytter uten å svekke cellelevedyktighet. En tilsvarende kombinasjon av metoder har vist seg å være effektive i isolering av leukocytter fra Deciduale vevet på fra mor til foster grensesnitt 39. Derfor protokollen beskrevet heri involverer mekaisk disaggregation med en automatisk vev dissociator som øker konsistens samtidig som du sparer tid og arbeid i forhold til tradisjonelle hakking med motstridskalpeller, barberblad, eller kirurgisk saks 10,28. Enzymet valgt for tissue dissosiasjon var Accutase. I motsetning til vanlig brukt kollagenase 43, dispase 44, og trypsin 45, Accutase (en celle avløsning løsning) kombinerer både generell proteolytisk og kollagenolytisk aktiviteter som bidrar til effektiv men skånsom dissosiasjon 46,47. Etter dissosiasjon blir leukocytter beriket fra den totale befolkningen i de uterusslimhinneceller etter densitetsgradientsentrifugering. Forskjellige densitetsgradient media har tidligere blitt benyttet, den mest vanlige av disse er Percoll® (en suspensjon av kolloidale silikapartikler) 48 og Ficoll (en polymer av sukrose med et syntetisk høy molekylvekt) 49. Den overlegne effektivitet av isolasjon av sukrose polymeren er blitt previously vist 50, og protokollen beskrevet heri ytterligere beviser at denne tettshetsgradient papir gir en tilstrekkelig høy renhet av mononukleære leukocytter.
Derfor er den protokoll som er beskrevet her kombinerer mekanisk vevet disaggregering med en automatisk dissociator vev, enzymatisk nedbrytning med en celle løsgjøring løsning, og leukocytt-separasjon med en densitetsgradient media (1,077 + 0,001 g / ml) for å isolere leukocytter fra menneske Deciduale vev. Denne protokollen har vist seg å bevare celleoverflateantigener sammen med cellenes levedyktighet. De isolerte leukocytter kan brukes for flere anvendelser som omfatter immunfenotyping med flowcytometri og funksjonelle studier in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen er egnet for leukocytt-isolering fra decidua basalis og decidua parietalis i forberedelse for immunfenotyping ved strømningscytometri. Videre kan de isolerte celler anvendes for cellesortering, cellekultur, RNA isolering, og cytologi. Før arbeider med prøvene nevnt i denne protokollen, må human etisk godkjenning fås fra den lokale forskningsetiske komité og Institutional Review Boards. Innsamling og utnyttelse av humane prøver for forskningsformål ble godkjent av Institutional Review Styrene i Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), Department of Health and Human Services (DHHS , Bethesda, MD, USA) og Wayne State University (Detroit, MI, USA). Skriftlig informert samtykke ble oppnådd fra alle gravide kvinner før innsamling av vevsprøver.
MERK: Mens han jobbet med dyreblod, celler, eller farelige midler som er nevnt i denne protokollen, er det viktig at riktig biosikkerhet og laboratorie sikkerhetstiltak følges.
1. Dissection of Human Deciduale Vev
MERK: basalplaten er basen under og festet til placenta, og representerer den maternal overflaten. De chorioamniotic membraner inkluderer amnion og chorion. Basal plate inneholder decidua basalis og chorion inkluderer decidua parietalis (figur 1).
- Decidua Basalis
- Dissekere en del av basalplaten fra den ene cotyledon av placenta (figur 1A og 1B).
- Plasser den på et sterilt skjærebrett med placenta villi vendt oppover. Den siden som viser placenta villi er vanligvis blodig rød med hårete vev i utseende. Basalplaten er glatt og svakt rødfarget.
- Bruk skarpe, fine-punkts saks og pinsett for å fjerne villlige vev og blodårer. Hold vev dynket i 1x PBS (Ca 2+ - og Mg 2+ - gratis) under prosessen (figur 1C). Samle 2 til 3 av disse brikkene og skyll dem grundig med 1x PBS for å fjerne blodet (figur 1D).
- Decidua Parietalis
- Dissekere et stykke av chorioamniotic membraner (ca. 10 cm x 10 cm, figur 1E). Plasser den på bordet med chorion vendt oppover. Chorion side inneholder blodige propper og er vanligvis lys gulaktig i fargen.
- Bruk fin-punkts tang for å fjerne så mange av blodpropp som mulig (figur 1E). Skyll membranen på sterile 1 x PBS for å vaske overskytende blod fra membranen til 1 x PBS går klart.
- Bruk en engangs sterilt celle skrape til å forsiktig skrape decidual lag fra membranen. Påfør sterile 1x PBS på memBrane når du skal fylle denne prosessen (figur 1F). Samle Deciduale vev og plassere dem i en 50 ml plastrør med sterilt 1x PBS (figur 1G).
2. Mekanisk Disaggregering og Enzymatisk Fordøyelse
- Vask vev dissekert fra decidua basalis (fra trinn 1.1.3) eller decidua parietalis (fra trinn 1.2.3) med steril 1 x PBS i et 50 ml plastrør. Samle vev pellets ved sentrifugering ved 300 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
- Aspirer supernatanten plassert over vevet pelleten forsiktig uten å forstyrre pelleten.
MERK: På dette punktet, pellets er meget løs, fordi de inneholder røde blodlegemer. Hvis volumet av pelleten er omtrent eller mindre enn 3 ml, re-suspendere pelleten i 6 ml celle løsgjøring oppløsning forvarmet til 37 ° C. Hvis pellet er større enn 3 ml volum, legge til mer celle løsrivelse løsning (legg ca 2 ganger the volum av vevsprøver). - Overfør homogenis vev (decidua basalis + celle avløsning løsning eller decidua parietalis + celle avløsning oppløsning) til en C-rør.
- Plasser C rør i den automatiske dissociator og kjøre tilsvarende program.
MERK: Programmet for decidua basalis går for 17 sek med 668 totalt runder per løp. Programmet for decidua parietalis går for 37 sek med 235 totalt runder per løp. Disse programmene har blitt tilpasset for å isolere leukocytter fra decidua basalis eller decidua parietalis med god avkastning og celle levedyktighet. - Etter den mekaniske disaggregering av vev, fordøye vevet med et kommersielt tilgjengelig celle løsgjøring løsning som accutase; (En cocktail som inneholder proteolytiske enzymer og kollagenolytisk) i 45 minutter ved 37 ° C med forsiktig omrøring.
3. Isolering av Leukocytter
- Etter inkubasjon, tilsett 10 ml 1x PBS til Digebrenningsblandingen og passere det gjennom en 100 um celle sil inn i et 50 ml plastrør. Avhengig av klebrighet av fordøyelsen blandingen, kan man må bruke flere celle siler for en blanding.
- Fyll røret med 1 x PBS og sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter ved romtemperatur. Fjern 1 x PBS over cellepelletene nøye og re-suspen pellets med 5 ml iskald FACS-buffer.
MERK: For å studere polymorfnukleære og mononukleære leukocytter sammen, gå til trinn 6.1; å studere mononukleære leukocytter, fortsett til trinn 3.3. - Tilsett 5 ml av 20% tettshetsgradient media (1,077 + 0,001 g / ml) i et 15 ml plastrør og langsomt overlappe cellesuspensjonen på toppen av densitetsgradienten media. Mens lagdeling prøven, er det viktig ikke å blande densitetsgradient media med cellesuspensjonen.
- Sentrifuger med en swing-out rotor ved 500 xg i 30 min ved 4 C uten brems. Det er veldig viktig å slå av bremsen for å unngå å blande cellene og losing graderingen. Leukocytter vil bli funnet i grenseflaten mellom densitetsgradient media og FACS-buffer.
- Fjern det øvre lag som inneholder FACS-buffer og celleavfall meget nøye ved hjelp av en pipette. Båndet ved grenseflaten inneholder Deciduale mononukleære celler og en del av polymorfonukleære leukocytter.
- Overfør cellene ved grenseflaten helt til et nytt 15 ml plastrør. Tilsett minst tre ganger større volum av FACS-buffer.
- Sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter for å pelletisere cellene. Aspirer supernatanten og vask av cellene med FACS-buffer. Pelletisere cellene med en annen sentrifugering ved 300 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
MERK: Hvis du vil utføre cellekultur, se trinn 4. For å utføre celle sortering, se trinn 5. Hvis du vil utføre immunfenotyping, se trinn 6.
4. Programmer - Cell kultur
- Re-suspendere cellene fra trinn 3.7 i 1 ml RPMI dyrkingsmedium 1640. Tell levedyktige celler USIng en automatisk celleteller, eller et hemocytometer og en trypanblått-oppløsning 0,4%.
- Legg opp mengden av RPMI kulturmedium for å lage en cellekonsentrasjon på 1 x 10 6 celler / ml. Cellene er nå klar for kulturen.
5. Programmer - Isolering av Makrofager for Primary Cell Culture
- For å isolere CD14 + celler, magnetisk merke cellene fra trinn 3,7 til CD14-mikroperler (20 ul perler per 10 7 celler), inkuber i 15 min ved 4 ° C, og separat CD14 + celler fra andre typer av celler ved å påføre et magnetisk felt. Etter 2 vaskinger med MACS-buffer og fjerning av det magnetiske feltet, eluere magnetisk tilbakeholdt CD14 + celler med MACS-buffer.
- Etter sentrifugering, re-suspencellepelletene i RPMI-dyrkningsmedium 1640. Cellene er klare for plettering (figur 2).
6. Programmer - immunfenotyping
- Å bruke celler for immunophenotyping, re-suspendere cellene fra trinn 3.7 i 1 ml 1x PBS. Antall levedyktige celler ved hjelp av en automatisk celleteller, eller et hemocytometer og en trypanblått-oppløsning 0,4%.
- Merke celler med et fikses levedyktighet fargestoff (figur 3). Vask cellene to ganger med FACS-buffer og re-suspendere cellene i flekken buffer. Inkuber med en FcR-blokkering i 15 minutter ved 4 ° C.
- Legg ekstracellulære antistoffer konjugert til fluorokromer. For eksempel, i denne protokollen, å bruke anti-CD3, anti-CD19, anti-CD14, anti-CD15 og anti-CD56-antistoffer (tabell 1). Inkuber i 30 minutter ved 4 ° C i mørke.
- Etter 2 vaskinger med 1 x PBS, vil cellene bli analysert i 500 ul buffer flekken ved hjelp av et flowcytometer. En representasjon av portstyringsstrategien anvendt for å analysere de leukocytt sub-populasjoner er funnet i Deciduale vev er vist i figur 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
. Disseksjon av menneskelig vev ved maternal-føtal grensesnitt (decidua basalis og decidua parietalis) er vist i figur 1 Denne prosedyren omfatter disseksjon av basal plate, som inkluderer decidua basalis (Figur 1A - D). Decidua basalis blir oppnådd ved fjerning av morkake villi (føtalt side) fra basalplaten (figur 1C). Decidua parietalis oppsamles ved forsiktig skraping chorionic membranen (figur 1E - F). Figur 2 viser morfologi av isolerte makrofager (CD14 +) samlet fra decidua parietalis i et Uttrykket graviditet ved hjelp av magnetisk cellesortering. Isolerte makrofager opprettholdt evnen til å frigi cytokiner etter 3 dagers dyrking (data ikke vist). Utbyttet av levedyktige celler isolert fra decidua basalis og decidua parietalis er vist i figur 3, og det er større enn 90% i begge.
Figur 1. Menneskelig maternal-føtal grensesnitt. Placenta og chorioamniotic membraner (A) Basal plate er dissekert fra morkaken; (B) basalplaten er adskilt fra morkake villi; (C) placenta villi er trimmet fra basal plate inkludert decidua basalis; (D) decidua basa lis skylles i 1x PBS; (E) et fragment av chorionic membranen oppnås og blodpropper er forsiktig fjernet; (F) decidua parietalis forsiktig skrapt; og (G) decidua parietalis (stiplet linje) er skilt fra chorionic membran. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Deciduale makrofager i kultur. Makrofager (CD14 + celler) ble isolert fra decidua parietalis på sikt graviditet. Makrofager ble belagt i plast kammer lysbilder med RPMI1640 + 10% FBS + 1% Penicillin-Streptomycin + 50 ng / ml MCSF. Bilder ble tatt på tidspunktet for plating (A) og etter 3 dager i kultur (C).3 / 52863fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Totalt celle levedyktighet. Levedyktighet av totale celler isolert fra decidua basalis og decidua parietalis ble bestemt følgende tettshetsgradient bruker en fikses levedyktighet fargestoff (trinn 6.2). Levedyktighet isolerte celler er> 95% i henhold til levende / død celle levedyktighet farging. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. gating strategi for decidual leukocyttpopulasjoner delpopulasjoner. Leukocytter ble inngjerdet med FSC og SSC. Levende celler ble deretter gated henhold til levedyktighet porten (Live). Levedyktige celler ble separert i neutrophils (CD15 +) og makrofager (CD14 +). Den CD14-CD15- befolkningen ble deretter videre delt opp i NK-celler (CD3-CD56 +), NKT celler (CD3 + CD56 +), T-celler (CD3 +) og B-celler (CD19 +). Klikk her for å se en større versjon av denne figur.
. Figur 5. Leukocytt sub-populasjoner i Deciduale vev Nøytrofiler (CD15 +) og makrofager (CD14 +) ble gated innenfor levedyktighet gate; T-celler (CD3 +) og B-celler (CD19 +) ble gated innenfor CD14-CD15- gate. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Rare leukocyttpopulasjoner sub-populasjoner i decidUAL vev. NK-celler (CD56 +) og NKT-celler (CD56 + CD3 +) ble gated innenfor CD14-CD15- gate. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Antistoff liste | Selskap | Catalog No. |
| BD Pharmingen Anti-human CD56-PE-Cy7 | BD Biosciences | 557747 |
| BD Horizon Anti-human CD15-BV605 | BD Biosciences | 562980 |
| BD Horizon Anti-human CD14-BUV395 | BD Biosciences | 563561 |
| BD Horizon Anti-human CD19-BUV737 | BD Biosciences | 564303 |
| Brilliant Violet 650 Anti-human CD3 antistoff | Biolegend | 317323 |
Tabell 1. Liste over antistoffer benyttes for leukocytter undergruppe immunfenotyping
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Karakterisering av de funksjonelle og fenotypiske egenskaper til å infiltrere leukocytter på menneske maternal-føtal grensesnittet er avgjørende for forståelsen av immunmekanismer som fører til graviditet lidelser. Flere teknikker har blitt beskrevet for å isolere leukocytter fra den menneskelige maternal-føtal grensesnitt gjennom hele svangerskapet 10,14,25,28,37,42,43. Men hver av disse teknikkene er forskjellig, bruker ulike enzymer eller enzym kombinasjoner, krever forskjellige dissosiasjon ganger, spesifiserer ikke mengder av vev, og viktigst av alt, ikke alltid angi levedyktighet av isolerte celler. Protokollen er beskrevet her kan isolering av infiltrerende leukocytter på menneske maternal-føtal grensesnitt (decidua basalis og decidua parietalis) resulterer i et høyt utbytte av levedyktighet og gir detaljert informasjon om de kommersielle reagenser, buffer forberedelse, vev mengder, og inkuberingstider validated i vårt laboratorium.
Den første kritiske trinn i isoleringsprosessen er leukocytt vev dissosiasjon; Dette trinnet innebærer mekanisk desegregation og / eller enzymatisk dissosiasjon. Mekanisk desegregation er vellykket utført ved skraping chorion når isolere decidua parietalis (figur 1F) og ved å trimme placenta villi fra basal plate når isolere decidua basalis (figur 1C) 10,28. Derfor er den protokoll som er beskrevet her, omfatter både prosedyrer som første trinn. Men det er viktig å tenke på at basalplaten (mors vev) og (fostervev) placenta villi er nært knyttet, noe som kan føre til forurensning av føtale leukocytter når isolere leukocytter fra decidua basalis. For å unngå forurensning foster, protokollen heri foreslår vasking av den trimmede basalplaten to eller tre ganger (figur 1D). Etter celle skraping eller trimmingfra decidua basalis eller decidua parietalis, har et ekstra trinn for mekanisk vev disaggregation blitt anbefalt 39. Dette trinnet er anbefalt fordi de infiltrere leukocytter på mors-fetal grensesnitt ekspress celleadhesjonsmolekyler som fast fester dem til ekstracellulære matrise 6,7. Derfor protokollen beskrevet her innebærer mekanisk disaggregation med en automatisk vev dissociator som øker konsistens samtidig som du sparer tid og arbeid i forhold til tradisjonelle hakking med skalpeller, barberblad, eller kirurgisk saks 10,28.
Et annet kritisk punkt i vevet dissosiasjon prosessen er enzymatisk dissosiasjon. Enkelt enzymer og en kombinasjon av ulike enzymer har blitt brukt til å isolere infiltrere leukocytter fra decidua basalis og decidua parietalis 10,14,25,28,37,42,43. I mange tilfeller er de enzymer fremstilt til en viss konsentrasjon for hånd i laboratory kan være gjenstand for menneskelige feil. Her, i stedet, en klar til bruk renset collage / nøytral protease cocktail, Accutase, har vært gjennomført i laboratoriet; som et kommersielt enzym, har det vist seg å gi pålitelige resultater i cellekultur 51. Accutase (en celle løsgjøring løsning) er kjent for effektivt å koble makrofager fra kulturplater uten skraping og, viktigst, uten tap av overflateantigener 51. Denne klare for enzymet har også blitt brukt til å behandle fordøyelse av humane og animalske vev fra nervesystemet, noe som resulterer i levedyktige isolerte celler som forblir bærekraftig i en lang periode, som over tid, gjør det mulig for deres cellekultur 52. Dessuten, denne løsningen også bevarer CD24 antigenevne i celler isolert fra sentralnervesystemet vev 52. Sammenlignet med Liberase-1, en annen cocktail av kollagenase og nøytral protease, verken Accutase heller Liberase-en generere frie DNA-aggregater; Imidlertid er Accutase gEntler enn Liberase-en i løpet av vev dissosiasjon 52. På grunn av dette, ikke Accutase ikke dissosierer celleaggregater etter at fordøyelsen 52. For å overvinne denne begrensningen protokollen beskrevet her, omfatter den automatiske vev disaggregering av decidua basalis og decidua parietalis før vevet dissosiasjon med løsningen. Accutase har også vist sin overlegenhet til trypsin i bevaringen av CD44, en kreftstamcelle overflate markør 53. Vår laboratoriestudier har konsekvent bemerket at avløsning løsning bevarer overflateantigenene. Faktisk har forskjeller mellom graviditet lidelser og normale svangerskap er funnet i uttrykket av flere ekstracellulære og intracellulære markører i makrofager (CD14 + -celler), neutrofiler (CD15 + -celler), T-celler (CD3 + celler), og B-celler (CD19 + -celler), inkludert CD80, CD86, CD163, CD209, ICAM3, CD45RO, CD45RA, CXCR3, CCR7, CCR6, CD4, CD8, CD25, foxp3, CD24, CD38, CD27, CD38, CD43, CD23, IgM, IgD, CD5, T-bet, GATA-3, og RORγt, og i cytokinfrigjøring. Derfor protokollen beskrevet heri er optimal for immunfenotyping av infiltrasjons leukocytter ved human mor til foster grensesnitt som vist i de representative resultater.
En viktig fordel ved den protokoll som er beskrevet heri, er at det gir mulighet for isolering av leukocytter med et høyt utbytte av levedyktige celler. Den representative data viser at> 90% av de isolerte cellene er levedyktige. Dette er av stor betydning da denne protokollen har tillatt studiet av de funksjonelle egenskapene til de celler isolert fra humant vev på fra mor til foster grensesnitt. For eksempel har kulturer av Deciduale makrofager og studiet av cytokinfrigjøring henhold stimulering blitt utført ved bruk av denne protokoll.
For å oppnå gode resultater ved å bruke den beskrevne protokollen, er det viktig å vurdere følgende faktorer: 1) vev collectiden må utføres i løpet av 1-2 timer etter levering, og disse vev må plasseres i en beholder med 1 x PBS ved 4 ° C for å opprettholde levedyktigheten av de isolerte celler; 2) mekaniske vev disaggregation må utføres ved hjelp av en automatisk homogenisator ved validerte tider, som beskrevet i denne protokollen; 3) varigheten av inkubasjonen med cellen løsgjøring løsningen må være mindre enn 1 time, siden dens aktivitet etter denne tid avtar; 4) temperaturen av inkubering med cellen løsgjøring oppløsningen må holdes ved 37 ° C for å oppnå optimal aktivitet av dette enzymet; 5) Cellepelleten manipulering må gjøres forsiktig med mikropipetter grunn bruk av virvelen kan ødelegge integriteten av cellene (husk at isolerte celler er differensiert og brå manipulering kan lett redusere deres levedyktighet); 6) buffer og sentrifugeres temperatur må holdes på samme temperatur som den cellesuspensjon; 7) isolerte celler må behandles for immunfenotyping eller brukes omgåbart som sin levedyktighet reduserer raskt; og 8) når du utfører immunfenotyping, prøvene må anskaffes ved hjelp av et strømningscytometer umiddelbart for best resultat.
En av begrensningene i denne protokollen er kostnaden for Accutase, som er dyrere enn andre enzymer med lignende funksjoner, for eksempel, trypsin, dispase II og kollagenase. Imidlertid, fordelene som Accutase viser utover disse enzymer er overlegen. En annen begrensning av protokollen er kravet til en automatisk vev dissociator, som ikke er en vanlig laboratorieinstrument, og derfor kan være kostbart. For å overvinne denne begrensningen, kan vevet desegregation også utføres ved hjelp av små kirurgiske saks; Imidlertid kan dette trinnet ikke overstige 3-5 minutter etter lengre tid har vist seg å redusere utbyttet av levedyktige celler. Alle dissociations må utføres av den samme forskeren å redusere variabiliteten.
I sammendraget, proprotokollen her tilbyr en ny tilnærming som kombinerer bruk av milde mekaniske og enzymatiske vev dissosiasjon teknikker for å bevare integriteten til ekstracellulære og intracellulære markører i leukocytter isolert fra menneskelig vev ved maternal-føtal grensesnitt. Bortsett fra immunfenotyping, cellekultur, og celle sortering, de fremtidige anvendelser av denne protokollen er mange og varierte. Vi har vært vellykket ved bruk av denne protokollen for å isolere Deciduale leukocytter for in vitro studier av leukocytt-funksjonalitet (dvs. cytotoksisitet, T-celle proliferasjon og plastisitet, etc.), og produksjon av reaktive oksygenarter i leukocytter isolert fra Deciduale vev (data ikke vist). Faktisk bruker den beskrevne protokollen, har vårt laboratorium kunnet beskrive nye og sjeldne leukocytter ved maternal-føtal grensesnitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, NIH / DHHS. Dette arbeidet ble også støttet, delvis ved Wayne State University Perinatal Initiative i Maternal, Perinatal and Child Health. Vi ønsker å takke for Maureen McGerty (Wayne State University) for hennes kritiske lesninger av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection | |||
| Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers | Any vendor | 20012-027 | |
| 1X phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | (1X PBS) | |
| Large and small Petri dishes | Any vendor | ||
| Dissociation | |||
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | (cell detachment solution) |
| Sterile 2 ml safe-lock conical tubes | Any vendor | ||
| 50 ml conical centrifuge tubes | Any vendor | ||
| 100 µm cell strainers | FALCON/Corning | 352360 | |
| 5 ml round bottom polystyrene test tubes | Any vendor | ||
| Transfer pipettes | Any vendor | ||
| C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| Cell Culture | |||
| RPMI culture medium 1640 | Life Technologies | 22400-089 | (1X) (10% FBS and 1% P/S) |
| Plastic chamber slides | Thermo Scientific | 177437 | |
| Incubator | Thermo Scientific Corporation | HEPA Class 100 | |
| Water bath | Fisher Scientific | ISOTEMP 110 | |
| Cell counter | Nexelcom | Cellometer Auto2000 | |
| Microscope | Olympus | Olympus CKX41 | |
| Cell Separation | |||
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Cell separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| 30 μm pre-separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-40 | |
| Multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 15 ml safe-lock conical tubes | Any Vendor | ||
| MACS buffer | (0.5% bovine serum albumin, 2 mM EDTA and 1X PBS) | ||
| Reagents | |||
| FcR Blocking | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | (Fc Block) |
| Anti-human cell surface antigen antibodies | BD Biosciences | (Table 1) | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| LIVE/DEAD viability dye | BD Biosciences | 564406 | |
| Lyse/Fix buffer | BD Biosciences | 346202 | |
| FACS buffer | (0.1% BSA, 0.05% Sodium Azide, and 1X PBS, pH=7.4) | ||
| Staining buffer | BD Biosciences | 554656 | |
| Trypan Blue solution 0.4% | Life Technologies | 15250-011 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | 20% density gradient media (1.077 + 0.001 g/ml) |
| Additional Instruments | |||
| Incubator with shaker | Thermo Scientific | MAXQ 4450 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSR-Fortessa | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | SpinChron DLX | |
| Vacuum system | Any vendor | ||
| Automatic tissue dissociator | Miltenyi Biotec | gentleMACS Dissociator | |
References
- Kelly, R. W.
- Keelan, J. A., et al. Cytokines, prostaglandins and parturition--a review. Placenta. 24, Suppl A. S33-S46 (2003).
- Romero, R., et al. Inflammation in preterm and term labour and delivery. Semin Fetal Neonatal Med. 11 (5), 317-326 (2006).
- Norman, J. E., Bollapragada, S., Yuan, M., Nelson, S. M.
- Mor, G., Cardenas, I. The immune system in pregnancy: a unique complexity. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 425-433 (2010).
- Gomez-Lopez, N., Guilbert, L. J., Olson, D. M. Invasion of the leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy. J Leukoc Biol. 88 (4), 625-633 (2010).
- Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. A., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol. , (2014).
- Bulmer, J. N., Morrison, L., Longfellow, M., Ritson, A., Pace, D. Granulated lymphocytes in human endometrium: histochemical and immunohistochemical studies. Hum Reprod. 6 (6), 791-798 (1991).
- Bulmer, J. N., Williams, P. J., Lash, G. E.
- Sindram-Trujillo, A., Scherjon, S., Kanhai, H., Roelen, D., Claas, F. Increased T-cell activation in decidua parietalis compared to decidua basalis in uncomplicated human term pregnancy. Am J Reprod Immunol. 49 (5), 261-268 (2003).
- Red-Horse, K., et al. Trophoblast differentiation during embryo implantation and formation of the maternal-fetal interface. J Clin Invest. 114 (6), 744-754 (2004).
- Erlebacher, A.
- Christiansen, O. B.
- Vince, G. S., Starkey, P. M., Jackson, M. C., Sargent, I. L., Redman, C. W. Flow cytometric characterisation of cell populations in human pregnancy decidua and isolation of decidual macrophages. J Immunol Methods. 132 (2), 181-189 (1990).
- Trundley, A., Moffett, A. Human uterine leukocytes and pregnancy. Tissue Antigens. 63 (1), 1-12 (2004).
- Richards, R. G., Brar, A. K., Frank, G. R., Hartman, S. M., Jikihara, H. Fibroblast cells from term human decidua closely resemble endometrial stromal cells: induction of prolactin and insulin-like growth factor binding protein-1 expression. Biol Reprod. 52 (3), 609-615 (1995).
- Rango, U. Fetal tolerance in human pregnancy--a crucial balance between acceptance and limitation of trophoblast invasion. Immunol Lett. 115 (1), 21-32 (2008).
- Robson, A., et al. Uterine natural killer cells initiate spiral artery remodeling in human pregnancy. FASEB J. 26 (12), 4876-4885 (2012).
- Lima, P. D., Zhang, J., Dunk, C., Lye, S. J., Anne Croy,, B, Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy. Cell Mol Immunol. , (2014).
- Aluvihare, V. R., Kallikourdis, M., Betz, A. G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat Immunol. 5 (3), 266-271 (2004).
- Thomson, A. J., et al. Leukocytes infiltrate the myometrium during human parturition: further evidence that labour is an inflammatory process. Hum Reprod. 14 (1), 229-236 (1999).
- Young, A., et al. Immunolocalization of proinflammatory cytokines in myometrium, cervix, and fetal membranes during human parturition at term. Biol Reprod. 66 (2), 445-449 (2002).
- Osman, I., et al. Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term. Mol Hum Reprod. 9 (1), 41-45 (2003).
- Hamilton, S., et al. Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor. Biol Reprod. 86 (2), 39 (2012).
- Gomez-Lopez, N., et al. Evidence for a role for the adaptive immune response in human term parturition. Am J Reprod Immunol. 69 (3), 212-230 (2013).
- Hamilton, S. A., Tower, C. L., Jones, R. L. Identification of chemokines associated with the recruitment of decidual leukocytes in human labour: potential novel targets for preterm labour. PLoS One. 8 (2), e56946 (2013).
- Sindram-Trujillo, A. P., et al. Differential distribution of NK cells in decidua basalis compared with decidua parietalis after uncomplicated human term pregnancy. Hum Immunol. 64 (10), 921-929 (2003).
- Repnik, U., et al. Comparison of macrophage phenotype between decidua basalis and decidua parietalis by flow cytometry. Placenta. 29 (5), 405-412 (2008).
- Sanguansermsri, D., Pongcharoen, S. Pregnancy immunology: decidual immune cells. Asian Pac J Allergy Immunol. 26 (2-3), 171-181 (2008).
- Houser, B. L. Decidual macrophages and their roles at the maternal-fetal interface. Yale J Biol Med. 85 (1), 105-118 (2012).
- Tamiolakis, D., et al. Human decidual cells activity in women with spontaneous abortions of probable CMV aetiology during the first trimester of gestation. An immunohistochemical study with CMV-associated antigen. Acta Medica (Hradec Kralove). 47 (3), 195-199 (2004).
- Williams, P. J., Bulmer, J. N., Searle, R. F., Innes, B. A., Robson, S. C. Altered decidual leucocyte populations in the placental bed in pre-eclampsia and foetal growth restriction: a comparison with late normal pregnancy. Reproduction. 138 (1), 177-184 (2009).
- Eide, I. P., et al. Serious foetal growth restriction is associated with reduced proportions of natural killer cells in decidua basalis. Virchows Arch. 448 (3), 269-276 (2006).
- Brown, M., Wittwer, C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin Chem. 46 (8 Pt 2), 1221-1229 (2000).
- He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor flow cytometry analyses of cellular immune response in rhesus macaques. J Vis Exp. (38), (2010).
- Jaso, J. M., Wang, S. A., Jorgensen, J. L., Lin, P. Multi-color flow cytometric immunophenotyping for detection of minimal residual disease in AML: past, present and future. Bone Marrow Transplant. 49 (9), 1129-1138 (2014).
- Ritson, A., Bulmer, J. N. Isolation and functional studies of granulated lymphocytes in first trimester human decidua. Clin Exp Immunol. 77 (2), 263-268 (1989).
- Nagaeva, O., Bondestam, K., Olofsson, J., Damber, M. G., Mincheva-Nilsson, L. An optimized technique for separation of human decidual leukocytes for cellular and molecular analyses. Am J Reprod Immunol. 47 (4), 203-212 (2002).
- Male, V., Gardner, L., Moffett, A. Chapter 7. Isolation of cells from the feto-maternal interface. Curr Protoc Immunol. (UNIT 7.40), Wiley Online Library. 41-11 (2012).
- Soares, M. J., Hunt, J. S. Placenta and trophoblast: methods and protocols overview II. Methods Mol Med. 122, 3-7 (2006).
- Ritson, A., Bulmer, J. N. Extraction of leucocytes from human decidua. A comparison of dispersal techniques. J Immunol Methods. 104 (1-2), 231-236 (1987).
- White, H. D., et al. A method for the dispersal and characterization of leukocytes from the human female reproductive tract. Am J Reprod Immunol. 44 (2), 96-103 (2000).
- Maruyama, T., et al. Flow-cytometric analysis of immune cell populations in human decidua from various types of first-trimester pregnancy. Hum Immunol. 34 (3), 212-218 (1992).
- Zhang, J., et al. Isolation of lymphocytes and their innate immune characterizations from liver, intestine, lung and uterus. Cell Mol Immunol. 2 (4), 271-280 (2005).
- Carlino, C., et al. Recruitment of circulating NK cells through decidual tissues: a possible mechanism controlling NK cell accumulation in the uterus during early pregnancy. Blood. 111 (6), 3108-3115 (2008).
- Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Mol Reprod Dev. 75 (5), 818-827 (2008).
- Zhang, P., Wu, X., Hu, C., Wang, P., Li, X. Rho kinase inhibitor Y-27632 and Accutase dramatically increase mouse embryonic stem cell derivation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 48 (1), 30-36 (2012).
- Snegovskikh, V. V., et al. Intra-amniotic infection upregulates decidual cell vascular endothelial growth factor (VEGF) and neuropilin-1 and -2 expression: implications for infection-related preterm birth. Reprod Sci. 16 (8), 767-780 (2009).
- Oliver, C., Cowdrey, N., Abadia-Molina, A. C., Olivares, E. G. Antigen phenotype of cultured decidual stromal cells of human term decidua. J Reprod Immunol. 45 (1), 19-30 (1999).
- Chang, Y., Hsieh, P. H., Chao, C. C. The efficiency of Percoll and Ficoll density gradient media in the isolation of marrow derived human mesenchymal stem cells with osteogenic potential. Chang Gung Med J. 32 (3), 264-275 (2009).
- Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. , 670-672 (2014).
- Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
- Quan, Y., et al. Impact of cell dissociation on identification of breast cancer stem cells. Cancer Biomark. 12 (3), 125-133 (2012).
