Abstract
Gebelik yeniden üretici dokularda ve maternal-fetal arayüzünde lökositlerin (Desidua basalis ve Desidua parietalis) infiltrasyonu ile karakterize edilir. Bu arayüz maternal ve fetal dokular arasındaki temas anatomik sitedir; bu nedenle, gebelik sırasında eylem bir immünolojik sitedir. Maternal-fetal arayüzünde infiltre lökositler teslimat merkezi implantasyon rol, gebelik bakımı ve zamanlama oynarlar. Bu nedenle, bu lökositlerin fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonu gebelik bozukluklarına sebep mekanizmalarına fikir verecektir. Birçok protokol Desidua basalis ve Desidua parietalis gelen lökositlerin infiltre izole etmek için de tarif edilmiştir; bununla birlikte inkübasyon, reaktifler, enzimler ve belirli bir süre içinde düzenli olmaması zor bu sonuçları karşılaştırma yapar. Burada tarif edilen yumuşak mekanik ve enzimatik diss kullanımını birleştiren yeni bir yaklaşımdırociation teknikleri maternal fetal ara yüzeyde insan dokularından izole edilen lökosit hücre dışı ve hücre içi işaretlerinin canlılığı ve bütünlüğünü korumak için. Kenara immünofenotiplendirme, hücre kültürü ve hücre sıralama gelen, bu protokolün gelecekteki uygulamaları çok sayıda ve çeşitlidir. Bu protokol, izole edilmiş DNA, lökosit nitro lökosit işlev (yani, fagositoz, sitotoksisite, T-hücresi çoğalması ve plastiklik, vs.) metilasyonu, hedef genlerin ekspresyonunu, ve reaktif oksijen türlerinin üretimini belirlemek için kullanılabilir maternal-fetal arayüzünde. Ayrıca, açıklanan protokolünü kullanarak, bu laboratuar maternal-fetal arayüzünde yeni ve nadir lökosit tanımlamak mümkün olmuştur.
Introduction
Gebelik üç ayrı aşamadan immünolojik ile karakterize edilir: 1) implantasyon ve pro-enflamatuar yanıt ile ilişkili erken plasenta (yani, implantasyon, bir 'açık yara' benzeyen); 2) ikinci trimester ve bağışıklık homeostazı maternal-fetal arayüzünde ağırlıklı anti-inflamatuar devlet yoluyla elde edilir gebeliğin üçüncü trimesterde en; ve 3) doğum, bir pro-inflamatuar durum 1-7. Bağışıklık hücreleri maternal-fetal arayüzünde inflamatuar yanıtın düzenlenmesinde önemli bir rol oynar nerede onların bereket ve gebelik süresince 6-9 yerelleştirme değişim.
İnsanlarda, maternal-fetal arayüz anne (desidua) ve fetal (koryon veya trofoblast) dokular arasındaki doğrudan temas bir alanı temsil eder. 1) desidua hatları uterin kavite plasenta kapsamında değil parietalis ve yan yana olan: Bu arayüz içerirkoryon laeve için; ve 2) interstisyel trofoblastlar 10 (Şekil 1) tarafından işgal plasenta bazal plaka bulunan desidua basalis. temas bu alanların samimiyet maternal bağışıklık sistemi 11-13 fetal antijenik maruz kalma koşulları yaratır. Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, lökositlerin normal stromal tipi hücreler ve bez hücrelerinde 8,14,16 ilave olarak desidual hücrelerde 8,9,14,15% 30-40 kadar içermektedir. maternal-fetal arayüzünde lökositlerin rolü trofoblast invazyonu 17 sınırlandırılmasına spiral arterlerin 18,19 yenileme, anne hoşgörü 12,20 bakım ve emek 21-26 başlatılmasını dahil çoklu süreçleri kapsar. Uyarlanabilir ve örneğin, T hücreleri, makrofajlar, nötrofiller, B hücreleri, dendritik hücreler ve NK hücreleri, desidual dokularda tespit edilmiştir bağışıklık sistemi, doğuştan gelen uzuvlar, ve bunların her ikisinin de Lökositleroranlar ve aktivasyon durumu gebelik 6-10,12,14,24,27-30 boyunca mekansal ve zamansal olarak değişir gösterilmiştir. Lökosit nüfus ve / veya işlev tedirginlikler spontan abortus 31 preeklampsi 32, intrauterin gelişme geriliği 32,33 ve preterm eylem 7,24 ile ilişkilidir. Bu nedenle, insan maternal-fetal arayüzünde fenotipik özellikleri ve lökositlerin işlevselliği çalışma gebelik bozukluklarında disregüle immünolojik yolların açıklanmasını kolaylaştıracaktır.
Birden parametrelerin eş zamanlı olarak 34-36 kantitatif analiz sağlar akım sitometri olan fenotip ve lökositlerin işlevsel özelliklerini belirlemek için kullanılan en güçlü araçlardan biri, teknoloji. Akış sitometrisi ile lökosit analiz etmek için, tek hücreli bir süspansiyon içinde lökositlerin izolasyonu gereklidir. Bu nedenle, bir yöntem, leu infiltre ayırmakmaternal-fetal arayüzden kocytes kendi fenotipik ve fonksiyonel özelliklerini incelemek için gereklidir.
Çeşitli yöntemler, insan maternal-fetal arayüz 10,14,25,27,37-39 gelen lökositleri izole etmek için tarif edilmiştir. Bazı mekanik ayrıştırılmasına yönelik çabalara 10,25,27,38 geçerli olsa da, diğerleri doku ayrılma için enzimatik sindirimi 37,40 kullanın. Mekanik parçalanma daha düşük bir verim ve düşük canlılığı 41 ve canlılık ve hücre yüzeyi işaretleme tutma 42 etkileyebilir enzimatik dissosiasyonunu için, burada tarif edilen yöntem, hücre canlılığını tehlikeye atmadan izole lökositlerin verimini artırmak için enzimatik ön-muamele ile hafif mekanik bir ayrışma birleştirir. Yöntemlerin de benzer bir kombinasyonu maternal fetal arabirim 39 ile desidual dokulardan lökositlerin izolasyonu ile etkili olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, burada tarif edilen bir protokol mekanizmalarını içermektedirkarşıt neşter, tıraş bıçakları, veya cerrahi makas 10,28 geleneksel kıyma haline gelme işleminde göre zaman ve emek tasarrufu sağlarken tutarlılığını artırır otomatik doku dissociator ile nical parçalanma. Doku Ayrılma için seçilen enzim Accutase oldu. Yaygın olarak kullanılan kollajenaz 43 aksine 44 dispase ve tripsin 45 Accutase (hücre dekolmanı çözeltisi) genel proteolitik ve verimli henüz nazik ayrılma 46,47 katkıda kolajenolitik faaliyetleri hem birleştirir. Ayrıştırmadan sonra, lökosit yoğunluk gradyan santrifüjü ile desidual hücrelerin toplam popülasyonundan zenginleştirilmiştir. Çeşitli yoğunluk gradyan Ortam daha önce Percoll (koloidal silis taneciklerinin bir süspansiyon), 48 ve Ficoll (yüksek sentetik bir molekül ağırlığına sahip olan, sukrozun bir polimer) 49 En yaygın olanı, kullanılmıştır. sakaroz polimerin tarafından tecrit üstün verim onceki olmuşturusly 50 gösterilmektedir, ve burada daha fazla tarif protokolü bu yoğunluk gradyan ortam mononükleer lökositlerin yeterince yüksek saflığa ürettiğini kanıtlamaktadır.
Bu nedenle, burada tarif edilen bir protokol, insan desidual dokularından lökosit izole etmek için bir yoğunluk gradyan ortam (1.077 + 0.001 gr / ml) ile otomatik bir doku aynştıncı, bir hücre ayırma çözeltisi ile enzimatik sindirme ve lökosit ayırma mekanik doku parçalanmalanna birleştirir. Bu protokol, hücre canlılığı ile birlikte hücre yüzey antijenlerini korumak için kanıtlanmıştır. İzole lökosit akış sitometrisi ve in vitro fonksiyonel çalışmalar ile immünofenotıpleme birden fazla uygulama için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol, akış sitometrisi ile, immünofenotipik hazırlık Desidua basalis ve Desidua parietalis lökosit izolasyonu için uygundur. Bundan başka, izole edilen hücreler hücre sıralama, hücre kültürü, RNA izolasyonu ve sitoloji için kullanılabilir. Bu protokolde belirtilen numuneler ile çalışmaya başlamadan önce, insan etik onay Yerel Araştırma Etik Kurulu ve Kurumsal Gözden Kurulları alınmalıdır. toplanması ve araştırma amaçlı insan örneklerinin kullanılması Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi (NICHD) Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü Kurumsal İnceleme Kurulları, Sağlık (NIH) National Institutes of, Sağlık ve İnsan Hizmetleri Departmanı (DHHS tarafından kabul edildi , Bethesda, MD, ABD) ve Wayne State Üniversitesi (Detroit, MI, USA). Yazılı bilgilendirilmiş onam önce doku örneklerinin toplanması için tüm hamile kadınların elde edilmiştir.
NOT: Hayvan kanı, hücreleri, ya da tehlike ile çalışırkenBu protokolde belirtildiği gibi lı ajanlar, doğru biyogüvenlik ve laboratuvar güvenliği eylemleri takip edilmesi esastır.
İnsan Desidual Dokuların 1. Diseksiyon
NOT: Bazal plaka tabanı altında ve plasenta bağlı olduğu ve anne yüzeyi temsil eder. chorioamniotic membranlar amniyon ve koryon bulunmaktadır. bazal plaka desidua basalis içerir ve koryon desidua parietalis (Şekil 1) içerir.
- Desidua Basalis
- Plasenta (Şekil 1A ve 1B) bir kotiledondan taban levhasının bir parça teşrih.
- Yukarı bakacak şekilde plasental villus ile steril bir kesme tahtası üzerine yerleştirin. plasental villus gösteren tarafı genellikle görünüşte kıllı doku ile kanlı kırmızı. bazal plaka pürüzsüz ve kırmızı renkli solgun.
- Vill çıkarmak için keskin, ince nokta makas ve forseps kullanınlı doku ve kan damarları. Süreç (Şekil 1C) sırasında (serbest - - 2 + ve Mg Ca 2+) 1x PBS batırılmış doku tutun. Bu parçaların 2-3 toplayın ve kan (Şekil 1D) kaldırmak için 1x PBS ile iyice durulayın.
- Desidua Parietalis
- Chorioamniotic membran bir parça teşrih (yaklaşık 10 cm, 10 cm, Şekil 1E x). Koryon yukarı bakacak şekilde gemide yerleştirin. koryon tarafı kanlı pıhtıları içerir ve genellikle sarımsı renkte ışık.
- Mümkün (Şekil 1E) olarak kan pıhtılaşması gibi birçok kaldırmak için ince nokta forseps kullanın. 1x PBS berrak bitene kadar membran aşırı kan temizlemek için steril 1x PBS membran durulayın.
- Yavaşça zardan desidual katman kazımak için tek kullanımlık steril hücre kazıyıcı kullanın. Mem steril 1x PBS Uygulabrane bu süreci (Şekil 1F) tamamlarken. Desidual dokuları toplamak ve steril 1 x PBS (Şekil 1G), bir 50 ml plastik tüp içine yerleştirin.
2. Mekanik Ayrıştırma ve Enzimatik Sindirim
- Bir 50 ml'lik plastik bir tüp içinde, steril 1 x PBS ile (Aşama 1.1.3 den) Desidua basalis kesilerek doku ya da (Kademe 1.2.3 den) Desidua parietalis yıkayın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile pelet doku toplanır.
- Dikkatlice pelet bozmadan doku pelet üzerinde bulunan süpernatant aspire.
NOT: kırmızı kan hücreleri içerdiğinden bu noktada, pelet çok gevşek. Pelet hacmi veya 3 mi ise, hücre ayırma çözeltisi, 6 ml, 37 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış pelet yeniden askıya. Pelet hacmi 3 ml büyükse, daha fazla hücre dekolmanı çözüm eklemek (th yaklaşık 2 kat eklemekdoku örneklerinin e hacmi). - Bir Cı tüpüne homojenize dokular (Desidua basalis + hücre dekolmanı çözelti veya Desidua parietalis + hücre sıyrılma çözeltisi) aktarın.
- Otomatik dissociator C tüpü yerleştirin ve ilgili programı çalıştırın.
NOT: desidua bazalisin program çalıştırmak başına 668 toplam mermi ile 17 saniye boyunca çalışır. desidua parietalis program çalıştırmak başına 235 toplam mermi ile 37 saniye boyunca çalışır. Bu programlar desidua bazalisin ya da iyi verim ve hücre canlılığı ile desidua parietalis gelen lökosit izole etmek için özelleştirilmiş edilmiştir. - Örneğin Accutase gibi ticari olarak temin edilebilen hücre ayırma çözeltisi ile dokuları sindirmek, dokuların mekanik parçalanmalanna sonra; Hafifçe çalkalama ile 37 ° C'de 45 dakika boyunca (proteolitik ve kolajenolitik enzimleri içeren bir kokteyl).
Lökosit 3. İzolasyonu
- İnkübasyondan sonra, Dige 1x 10 ml PBS ilavestion Karışım bir 50 ml plastik tüp içine, bir 100 mikron hücre süzgecinden geçirilir. Sindirim karışımı yapışkanlığının bağlı olarak, bir tek bir karışım için çok sayıda hücre gericileri kullanmak gerekebilir.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 xg'de 1 x PBS ile tüp ve santrifüj doldurun. Dikkatli bir şekilde, hücre peletleri üzerinde 1x PBS çıkarın ve buz gibi soğuk FACS tampon maddesi, 5 ml pelet yeniden askıya.
NOT: 6.1 adıma gidin, birlikte polimorfonükleer ve mononükleer lökosit incelemek için; mononükleer lökosit incelemek için, 3.3 Adım ile devam edin. - 15 ml plastik tüp 20 ila% 5 ml yoğunluk gradyan ortamı (1.077 + 0.001 gr / ml) ilave edin ve yavaş yavaş yoğunluk gradyan medyanın üstüne hücre süspansiyonu kaplar. Örnek katman iken, hücre süspansiyonu ile yoğunluk gradyan ortamı karıştırmak için önemlidir.
- Frensiz 4 ˚C 30 dakika boyunca 500 xg'de bir salıncak-out rotorlu santrifüj. Bu hücreleri ve l karışmasını önlemek için fren kapatmak için çok önemlidirdegrade Osing. Lökositler yoğunluk gradyan medya ve FACS tampon arasındaki arayüz bulunacaktır.
- Bir pipet kullanarak çok dikkatli FACS tampon ve hücre artıkları içeren üst katmanı kaldırın. arayüzde bandı desidual mononükleer hücreleri ve polimorfonükleer lökositlerin bir kısmını içerir.
- Yeni bir 15 ml'lik plastik tüp tamamen Ara yüzeydeki hücreleri aktarın. FACS tampon, en az 3 kat daha fazla hacim.
- Hücreleri topaklaşmasına 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı aspire ve FACS tamponu ile hücreleri yıkayın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de bir santrifüj ile hücreler topaklaşmasına.
NOT: Adım 6, bkz immünofenotıpleme gerçekleştirmek için adım 5. bkz hücre sıralama gerçekleştirmek için adım 4'e bakın, hücre kültürü gerçekleştirmek için.
4. Uygulamalar - Hücre kültürü
- USI canlı hücreleri sayın RPMI kültür ortamı 1640 1 ml Adım 3.7 hücreleri yeniden askıyaOtomatik hücre sayıcı veya hemasitometre ve tripan mavisi çözüm% 0.4 ng.
- 1 x 10 6 hücre / ml'lik bir hücre konsantrasyonunu yapmak için RPMI kültür ortamı miktarı kadar ekleyin. Hücreler artık kültür için hazırız.
5. Uygulamalar - Birincil Hücre Kültürü için Makrofagların izolasyonu
- Manyetik CD14 mikro boncuklar (10 7 hücre başına 20 ul boncuklar) ile Aşama 3,7 hücreleri etiketlemek, CD14 + hücreler izole edilmesi için, 15 ° C'de 4 dakika, ve manyetik bir alan uygulanması ile diğer hücre tiplerinden ayrı CD14 + hücrelerinin inkübe edilir. MACS tamponu ve manyetik alanın ayrılması ile 2 kez yıkamadan sonra, MACS tamponu ile manyetik muhafaza CD14 + hücreler elüte.
- Santrifüj sonrasında yeniden askıya hücreleri kaplama (Şekil 2) için hazır olan RPMI 1640 kültür ortamında, hücre peletleri.
6. Uygulamalar - İmmünofenotipleme
- Immunophenot hücreleri kullanmak içinyping, 1 x PBS içinde 1 ml Aşama 3.7 hücreleri yeniden askıya. Otomatik hücre sayıcı veya hemasitometre ve tripan mavisi çözeltisi% 0.4 kullanılarak canlı hücreleri saymak.
- Bir fixable canlılığı boya (Şekil 3) ile hücrelerin etiketleyin. FACS tamponu ile hücreler iki kez yıkayın ve leke tampon hücreleri yeniden askıya. 4 ° C'de 15 dakika boyunca bir FcR engelleyicisi ile inkübe edin.
- Florokromların konjüge hücre dışı antikor ekleyin. Örneğin, bu protokolde, anti-CD3 kullanımı, anti-CD19, anti-CD14, anti-CD15 ve anti-CD56 antikorları (Tablo 1). Karanlıkta 4 ° C'de 30 dakika süreyle inkübe edilir.
- 1x PBS ile 2 kez yıkamadan sonra, hücreler, bir akış sitometrisi kullanılarak boya tamponu 500 ul analiz edilecektir. Desidual dokularda bulunan lökosit alt popülasyonları analiz etmek için kullanılan yolluk stratejisinin bir temsili Şekil 4'de gösterilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
. maternal fetal ara yüzeyde insan dokularıyla (Desidua basalis ve Desidua parietalis) disseksiyon Şekil 1 'de gösterilen bu prosedür, Desidua basalis (- D Şekil 1 A) içeren taban plaka, diseksiyon içerir. Desidua basalis taban plakasına (Şekil 1C) plasental villi (fetal yan) çıkarılması ile elde edilir. Desidua parietalis yavaşça koryonik membran (Şekil 1E - F) kazınarak toplanır. 2 manyetik hücre sıralama kullanarak bir terim gebelikte Desidua parietalis toplanan izole edilmiş makrofajlar (CD14 +) morfolojisini göstermektedir. Izole edilmiş makrofajlar kültür 3 gün sonra sitokin serbest yeteneğini muhafaza (veriler gösterilmemiştir). Desidua basalis ve Desidua parietalis izole canlı hücre verimi, Şekil 3 'de gösterilmiştir, ve hem de% 90'dan fazla değildir.
Şekil 1. İnsan maternal-fetal arayüzü:. Plasenta ve chorioamniotic zarlar (A) Bazal plaka plasentadan disseke edilir; (B), taban plakası plasental villi ayrılır; (C) plasental villus desidua bazalisin dahil bazal plakadan kesilmiş; (D) Desidua basa lis 1x PBS 'de çalkalanır; (E) koryonik membran bir parçası elde edilir ve kan pıhtıları nazikçe kaldırılır; (F) desidua parietalis hafifçe kazınır; ve (G) desidua parietalis (noktalı çizgi) koryonik zarından ayrılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil kültüründe 2. Desidual makrofaj. Makrofajlar (CD14 + hücreler), hamilelik döneminde, Desidua parietalis izole edilmiştir. Makrofajlar RPMI1640 +% 10 FBS +% 1 Penisilin-Streptomisin ile + 50 ng / ml mCSF plastik oda slaytlar kaplanmıştır. Fotoğraflar kaplama (A) sırasında çekilen ve 3 gün sonra kültür (C) bulundu.3 / 52863fig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Desidua bazalisin izole toplam hücrelerin Şekil 3. Toplam hücre canlılığı. Canlılık ve desidua parietalis bir fixable canlılığı boya (adım 6.2) kullanılarak aşağıdaki yoğunluk gradiyenti belirlendi. İzole hücrelerin canlılığı, canlı / ölü hücre canlılığı boyaması göre>% 95'tir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Desidual lökosit alt popülasyonlar için Şekil 4. Yolluk stratejisi. Lökositler FSC ve SSC ile Geçitli bulundu. Canlı hücreler daha sonra canlılık kapısı (Canlı) 'e göre kapı bulundu. Canlı hücreler, n ayrıldıeutrophils (CD15 +) ve makrofajlar (CD14 +). CD14-CD15- nüfusu daha sonra NK hücreleri (CD3-CD56 +), NKT hücrelerinin (CD3 + CD56 +), T hücreleri (CD3 +) ve B hücreleri (CD19 +) ayrıldı. Bu daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız rakam.
. Şekil desidual dokularda 5. lökosit alt popülasyonları Nötrofiller (CD15 +) ve makrofajlar (CD14 +) canlılık kapısı içinde kapı edildi; T hücreleri (CD3 +) ve B hücreleri (CD19 +) CD14-CD15- kapısı içinde kapı bulundu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Yaprak döken Şekil 6. Nadir lökosit alt popülasyonlarıual dokular. NK hücreleri (CD56 +) ve NKT hücreleri (CD56 + CD3 +) CD14-CD15- kapısı içinde kapı bulundu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Antikor listesi | Şirket | Katalog No. |
| BD Pharmingen Anti-insan CD56-PE-Cy7 | BD Biosciences | 557.747 |
| BD Horizon Anti-insan CD15-BV605 | BD Biosciences | 562.980 |
| BD Horizon Anti-insan CD14-BUV395 | BD Biosciences | 563.561 |
| BD Horizon Anti-insan CD19-BUV737 | BD Biosciences | 564.303 |
| Parlak Violet 650 Anti-insan CD3 antikoru | Biolegend | 317.323 |
Antikorların Tablo 1. listesi lökosit alt kümesi immünofenotiplendirme için kullanılan
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İnsan maternal-fetal arayüzünde lökositler infiltre fonksiyonel ve fenotipik özelliklerinin karakterizasyonu gebelik bozukluklarına sebep bağışıklık mekanizmalarının anlaşılması için gereklidir. Çeşitli teknikler gebelik 10,14,25,28,37,42,43 boyunca insan maternal-fetal arayüzünden lökositleri izole etmek için tarif edilmiştir. Bununla birlikte, bu tekniklerin her biri farklı olan, her zaman izole edilmiş hücrelerin canlılığını belirtmez, en önemlisi, enzim veya enzim kombinasyonları, değişik kullanır gerektirir, farklı ayrışma süreleri, doku miktarları belirtmez ve. Bu tarifnamede tarif edilen protokol, canlılık açısından yüksek verimle elde edilen insan maternal-fetal arayüzünde lökosit (Desidua basalis ve Desidua parietalis) infiltre izolasyonuna izin verir ve ayrıntılı ticari reaktifler ile ilgili bilgileri, tampon hazırlanması, doku miktarları ve inkübasyon sürelerini valida içerirLaboratuvarımızda ted.
lökosit izolasyon sürecinin ilk kritik adım, doku ayrışma olduğu; bu adım, mekanik ırk ayrımının kaldırılması ve / veya enzimatik ayrışma içerir. Mekanik ırk ayırımına son verme başarıyla desidua parietalis (Şekil 1F) izole sırasında koryon kazıyarak ve desidua basalis (Şekil 1C) 10,28 izole sırasında bazal plakadan plasental villus kırparak gerçekleştirilir. Bu nedenle, burada tarif edilen protokol ilk adımlar olarak her iki prosedürleri içermektedir. Ancak, desidua bazalisin gelen lökosit izole fetal lökositlerin kirlenmesine neden olan bazal plaka (anne dokular) ve plasental villus (fetal dokular) yakından bağlı olduğunu dikkate almak önemlidir. Fetal kontaminasyonu önlemek için, protokol, burada kesilmiş bazal plaka iki veya üç kez (Şekil 1D) yıkama önerir. Hücre kazıma takiben veya kırpmaDesidua basalis ya Desidua parietalis gelen, mekanik doku ayrıştırma için ek bir aşama 39 tavsiye edilmiştir. Bu adım önerilir, çünkü sıkıca ekstraselüler matriks 6,7 ekleyebilirsiniz maternal-fetal arayüz ekspres hücre adezyon molekülleri de infiltre lökositler. Bu nedenle, burada tarif edilen protokol neşter, tıraş bıçakları, veya cerrahi makas 10,28 geleneksel kıyma haline gelme işleminde göre zaman ve emek tasarrufu sağlarken tutarlılığını artırır otomatik doku dissociator mekanik ayrıştırılmasına yönelik çabalara içerir.
Doku ayrışma sürecinde ikinci kritik bir adım enzimatik ayrışma olduğunu. Tek enzimler ve farklı enzimlerin bir kombinasyonu Desidua basalis arasında süzücü lökositlerin izole etmek için kullanılır ve Desidua 10,14,25,28,37,42,43 parietalis edilmiştir. Birçok durumda, bu enzimler, bir laboratuar el ile, belirli bir konsantrasyonda hazırlananedici insan hatası tabi olabilir. Burada, bunun yerine, bir hazır kullanımlı saflaştırılmış kollajenaz / nötr proteaz kokteyli, Accutase, laboratuvarda uygulamaya konmuştur; ticari bir enzim olarak, bu, hücre kültüründe 51 güvenilir sonuçlar gösterilmiştir. Yüzey kaybetmeden 51 antijenleri olmayan Accutase (hücre ayırma çözeltisi), etkili bir şekilde daha da önemlisi, kazıma olmayan kültür plakalarından makrofajlar ayırmak için bilinmektedir. Hazırlanan bu enzim, zaman içinde, hücre kültürünün 52 sağlar, bu uzun bir süre boyunca sürdürülebilir bir kalır uygun bir izole edilmiş hücrelerde elde edilen, insan ve hayvan sinir sistemi dokuların sindirim işlemek için kullanılmıştır. Ayrıca bu çözüm, aynı zamanda merkezi sinir sistemi 52 izole edilmiş hücrelerde CD24 antijenliğini korur. Liberase®-1, kollajenaz ve nötr proteaz başka kokteyl, ne Accutase ne Liberase®-1 serbest DNA agrega üretmek için karşılaştırıldığında; Bununla birlikte, Accutase gDoku ayrılma 52 sırasında Liberase®-1 den Entler. Bu nedenle, Accutase sindirim 52 sonra hücre agregatları ayırmak etmez. Bu sınırlamayı aşmak için, bu tarifnamede tarif edilen bir protokol Desidua basalis ve Desidua parietalis önceden çözeltisi doku disosiasyon otomatik doku parçalanmalanna içerir. Accutase ayrıca CD44, bir kanser kök hücre yüzey belirteci 53 korunmasında tripsin onun üstünlüğünü göstermiştir. Bizim laboratuarın çalışmaları sürekli dekolmanı çözüm yüzey antijenleri koruduğunu kaydetti. Gerçekten de, gebelik bozuklukları ve normal gebelikler arasındaki fark makrofajlar (CD14 + hücreler), nötrofil (CD15 + hücreler), T hücreleri (CD3 + hücreleri) ve B hücreleri, çok sayıda hücre dışı ve hücre içi işaretlerinin ifadesi bulunmuştur (CD19 + hücreler), dahil olmak üzere CD80, CD86, CD163, CD209, ICAM3, CD45RO, CD45RA, CXCR3, CCR7, CCR6, CD4, CD8, CD25, FoxP3, CD24, CD38, CD27, CD38, CD43, CD23, IgM, IgD, CD5, T-bet, GATA-3 ve RORγt ve sitokin salınımında. Temsilcisi sonuçları gösterildiği gibi nedenle, burada tarif edilen protokol, insan maternal-fetal arayüzünde infiltrasyon lökositlerin immünfenotipleme için en uygunudur.
Bu tarifnamede tarif edilen protokol önemli bir avantajı, canlı hücrelerin yüksek bir verimle lökositlerin izolasyonu için izin vermesidir. Örnek veriler izole edilmiş hücrelerin>% 90 uygulanabilir olduğunu göstermektedir. Bu protokol, maternal fetal ara yüzeyde insan dokularından izole edilmiş hücrelerin fonksiyonel özelliklerinin çalışma imkan veren bu büyük bir önem taşımaktadır. Örneğin, desidual makrofaj ve stimülasyon altında sitokin salınımının çalışmanın kültürleri bu protokol kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
1) Doku collecti: açıklanan protokolünü kullanarak başarılı sonuçlar elde etmek için, aşağıdaki faktörler göz önünde bulundurmak önemlidirilgili doğum sonrası 1-2 saat içinde yapılmalıdır, ve bu dokular izole edilmiş hücrelerin canlılığını korumak için 4 ° C 'de 1X PBS ile bir kap içinde yerleştirilmesi gerekir; Bu protokol açıklandığı gibi 2) mekanik doku parçalanma, valide zamanlarda otomatik homojenleştirici kullanılarak yapılmalıdır; 3) hücre ayırma çözeltisi ile inkübasyon süresi de aktivitesi, bu kez azalır sonra yana 1 saat daha az olmalıdır; 4) hücre ayırma çözeltisi ile inkübasyon sıcaklığı, bu enzimin optimum aktivitesi elde etmek üzere 37 ° C 'de muhafaza edilmesi gerekmektedir; Girdap kullanımı hücrelerinin bütünlüğünü zarar verebilir, çünkü 5) hücre pelet manipülasyon () izole hücreler farklılaşmış ve ani manipülasyon kolayca canlılığını azaltabilir olduğunu unutmayın mikropipetler ile nazikçe yapılmalıdır; 6) tampon ve santrifüj sıcaklıkları hücre süspansiyonu olarak aynı sıcaklıkta tutulmalıdır; 7) izole edilmiş hücreler immünofenotipleme için işlenen veya acilen bu kullanılmalıdırulaştırılması bunların canlılığı hızlı bir şekilde azaltır; immünofenotıpleme yaparken ve 8), numune en iyi sonuçlar için sitometresi hemen akış kullanılarak elde edilmelidir.
Bu protokolün sınırlamaları biri benzer fonksiyonları, örneğin, tripsin, dispase II ve kollajenaz ile diğer enzimler daha pahalı Accutase maliyeti vardır. Ancak, aşırı ve bu enzimler üzerindeki görüntüler Accutase avantajlar üstündür. Protokolün ikinci sınırlaması dolayısıyla, pahalıya mal olabilir, ortak laboratuvar araç değildir ve bir otomatik doku dissociator, bir gerekliliktir. Bu sınırlamayı aşmak için, doku ırk ayırımına son verme, aynı zamanda, küçük bir cerrahi makas kullanılarak gerçekleştirilebilir; daha uzun süreler canlı hücre verimini düşürmek için gösterilmiştir Bununla birlikte, bu adım 3-5 dakika geçemez. Tüm çözünme ve değişkenliği en aza indirmek için aynı araştırmacı tarafından gerçekleştirilmelidir.
Özet olarak, öntokol tarifnamede maternal fetal ara yüzeyde insan dokularından izole edilen lökosit hücre dışı ve hücre içi işaretlerinin bütünlüğünü korumak için hafif bir mekanik ve enzimatik doku ayrılma tekniklerinin kullanılmasını birleştiren yeni bir yaklaşım sunmaktadır. Kenara immünofenotiplendirme, hücre kültürü ve hücre sıralama gelen, bu protokolün gelecekteki uygulamaları çok sayıda ve çeşitlidir. Başarıyla desidual lökosit işlev (örneğin, sitotoksisite, T-hücresi çoğalması ve plastisite, vs.) ve desidual dokulardan izole lökositlerin reaktif oksijen türlerinin üretilmesi, in vitro çalışmalar için lökosit (veriler izole etmek için bu protokolü kullanarak edilmiştir gösterilir). Nitekim, açıklanan protokol kullanılarak, laboratuvar maternal-fetal arayüzünde yeni ve nadir lökosit tanımlamak mümkün olmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu eser Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü, NIH / DHHS tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma aynı zamanda Anne, Perinatal ve Çocuk Sağlığı Wayne State Üniversitesi Perinatoloji Girişimi tarafından, kısmen, desteklenmiştir. Biz minnetle yazının onun eleştirel okumalar için Maureen McGerty (Wayne State Üniversitesi) kabul eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection | |||
| Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers | Any vendor | 20012-027 | |
| 1X phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | (1X PBS) | |
| Large and small Petri dishes | Any vendor | ||
| Dissociation | |||
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | (cell detachment solution) |
| Sterile 2 ml safe-lock conical tubes | Any vendor | ||
| 50 ml conical centrifuge tubes | Any vendor | ||
| 100 µm cell strainers | FALCON/Corning | 352360 | |
| 5 ml round bottom polystyrene test tubes | Any vendor | ||
| Transfer pipettes | Any vendor | ||
| C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| Cell Culture | |||
| RPMI culture medium 1640 | Life Technologies | 22400-089 | (1X) (10% FBS and 1% P/S) |
| Plastic chamber slides | Thermo Scientific | 177437 | |
| Incubator | Thermo Scientific Corporation | HEPA Class 100 | |
| Water bath | Fisher Scientific | ISOTEMP 110 | |
| Cell counter | Nexelcom | Cellometer Auto2000 | |
| Microscope | Olympus | Olympus CKX41 | |
| Cell Separation | |||
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Cell separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| 30 μm pre-separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-40 | |
| Multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 15 ml safe-lock conical tubes | Any Vendor | ||
| MACS buffer | (0.5% bovine serum albumin, 2 mM EDTA and 1X PBS) | ||
| Reagents | |||
| FcR Blocking | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | (Fc Block) |
| Anti-human cell surface antigen antibodies | BD Biosciences | (Table 1) | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| LIVE/DEAD viability dye | BD Biosciences | 564406 | |
| Lyse/Fix buffer | BD Biosciences | 346202 | |
| FACS buffer | (0.1% BSA, 0.05% Sodium Azide, and 1X PBS, pH=7.4) | ||
| Staining buffer | BD Biosciences | 554656 | |
| Trypan Blue solution 0.4% | Life Technologies | 15250-011 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | 20% density gradient media (1.077 + 0.001 g/ml) |
| Additional Instruments | |||
| Incubator with shaker | Thermo Scientific | MAXQ 4450 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSR-Fortessa | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | SpinChron DLX | |
| Vacuum system | Any vendor | ||
| Automatic tissue dissociator | Miltenyi Biotec | gentleMACS Dissociator | |
References
- Kelly, R. W. Inflammatory mediators and parturition. Rev Reprod. 1 (2), 89-96 (1996).
- Keelan, J. A., et al. Cytokines, prostaglandins and parturition--a review. Placenta. 24, Suppl A. S33-S46 (2003).
- Romero, R., et al. Inflammation in preterm and term labour and delivery. Semin Fetal Neonatal Med. 11 (5), 317-326 (2006).
- Norman, J. E., Bollapragada, S., Yuan, M., Nelson, S. M. Inflammatory pathways in the mechanism of parturition. BMC Pregnancy Childbirth. 7, Suppl 1. S7 (2007).
- Mor, G., Cardenas, I. The immune system in pregnancy: a unique complexity. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 425-433 (2010).
- Gomez-Lopez, N., Guilbert, L. J., Olson, D. M. Invasion of the leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy. J Leukoc Biol. 88 (4), 625-633 (2010).
- Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. A., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol. , (2014).
- Bulmer, J. N., Morrison, L., Longfellow, M., Ritson, A., Pace, D. Granulated lymphocytes in human endometrium: histochemical and immunohistochemical studies. Hum Reprod. 6 (6), 791-798 (1991).
- Bulmer, J. N., Williams, P. J., Lash, G. E. Immune cells in the placental bed. Int J Dev Biol. 54 (2-3), 281-294 (2010).
- Sindram-Trujillo, A., Scherjon, S., Kanhai, H., Roelen, D., Claas, F. Increased T-cell activation in decidua parietalis compared to decidua basalis in uncomplicated human term pregnancy. Am J Reprod Immunol. 49 (5), 261-268 (2003).
- Red-Horse, K., et al. Trophoblast differentiation during embryo implantation and formation of the maternal-fetal interface. J Clin Invest. 114 (6), 744-754 (2004).
- Erlebacher, A. Immunology of the maternal-fetal interface. Annu Rev Immunol. 31, 387-411 (2013).
- Christiansen, O. B. Reproductive immunology. Mol Immunol. 55 (1), 8-15 (2013).
- Vince, G. S., Starkey, P. M., Jackson, M. C., Sargent, I. L., Redman, C. W. Flow cytometric characterisation of cell populations in human pregnancy decidua and isolation of decidual macrophages. J Immunol Methods. 132 (2), 181-189 (1990).
- Trundley, A., Moffett, A. Human uterine leukocytes and pregnancy. Tissue Antigens. 63 (1), 1-12 (2004).
- Richards, R. G., Brar, A. K., Frank, G. R., Hartman, S. M., Jikihara, H. Fibroblast cells from term human decidua closely resemble endometrial stromal cells: induction of prolactin and insulin-like growth factor binding protein-1 expression. Biol Reprod. 52 (3), 609-615 (1995).
- Rango, U. Fetal tolerance in human pregnancy--a crucial balance between acceptance and limitation of trophoblast invasion. Immunol Lett. 115 (1), 21-32 (2008).
- Robson, A., et al. Uterine natural killer cells initiate spiral artery remodeling in human pregnancy. FASEB J. 26 (12), 4876-4885 (2012).
- Lima, P. D., Zhang, J., Dunk, C., Lye, S. J., Anne Croy,, B, Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy. Cell Mol Immunol. , (2014).
- Aluvihare, V. R., Kallikourdis, M., Betz, A. G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat Immunol. 5 (3), 266-271 (2004).
- Thomson, A. J., et al. Leukocytes infiltrate the myometrium during human parturition: further evidence that labour is an inflammatory process. Hum Reprod. 14 (1), 229-236 (1999).
- Young, A., et al. Immunolocalization of proinflammatory cytokines in myometrium, cervix, and fetal membranes during human parturition at term. Biol Reprod. 66 (2), 445-449 (2002).
- Osman, I., et al. Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term. Mol Hum Reprod. 9 (1), 41-45 (2003).
- Hamilton, S., et al. Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor. Biol Reprod. 86 (2), 39 (2012).
- Gomez-Lopez, N., et al. Evidence for a role for the adaptive immune response in human term parturition. Am J Reprod Immunol. 69 (3), 212-230 (2013).
- Hamilton, S. A., Tower, C. L., Jones, R. L. Identification of chemokines associated with the recruitment of decidual leukocytes in human labour: potential novel targets for preterm labour. PLoS One. 8 (2), e56946 (2013).
- Sindram-Trujillo, A. P., et al. Differential distribution of NK cells in decidua basalis compared with decidua parietalis after uncomplicated human term pregnancy. Hum Immunol. 64 (10), 921-929 (2003).
- Repnik, U., et al. Comparison of macrophage phenotype between decidua basalis and decidua parietalis by flow cytometry. Placenta. 29 (5), 405-412 (2008).
- Sanguansermsri, D., Pongcharoen, S. Pregnancy immunology: decidual immune cells. Asian Pac J Allergy Immunol. 26 (2-3), 171-181 (2008).
- Houser, B. L. Decidual macrophages and their roles at the maternal-fetal interface. Yale J Biol Med. 85 (1), 105-118 (2012).
- Tamiolakis, D., et al. Human decidual cells activity in women with spontaneous abortions of probable CMV aetiology during the first trimester of gestation. An immunohistochemical study with CMV-associated antigen. Acta Medica (Hradec Kralove). 47 (3), 195-199 (2004).
- Williams, P. J., Bulmer, J. N., Searle, R. F., Innes, B. A., Robson, S. C. Altered decidual leucocyte populations in the placental bed in pre-eclampsia and foetal growth restriction: a comparison with late normal pregnancy. Reproduction. 138 (1), 177-184 (2009).
- Eide, I. P., et al. Serious foetal growth restriction is associated with reduced proportions of natural killer cells in decidua basalis. Virchows Arch. 448 (3), 269-276 (2006).
- Brown, M., Wittwer, C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin Chem. 46 (8 Pt 2), 1221-1229 (2000).
- He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor flow cytometry analyses of cellular immune response in rhesus macaques. J Vis Exp. (38), (2010).
- Jaso, J. M., Wang, S. A., Jorgensen, J. L., Lin, P. Multi-color flow cytometric immunophenotyping for detection of minimal residual disease in AML: past, present and future. Bone Marrow Transplant. 49 (9), 1129-1138 (2014).
- Ritson, A., Bulmer, J. N. Isolation and functional studies of granulated lymphocytes in first trimester human decidua. Clin Exp Immunol. 77 (2), 263-268 (1989).
- Nagaeva, O., Bondestam, K., Olofsson, J., Damber, M. G., Mincheva-Nilsson, L. An optimized technique for separation of human decidual leukocytes for cellular and molecular analyses. Am J Reprod Immunol. 47 (4), 203-212 (2002).
- Male, V., Gardner, L., Moffett, A. Chapter 7. Isolation of cells from the feto-maternal interface. Curr Protoc Immunol. (UNIT 7.40), Wiley Online Library. 41-11 (2012).
- Soares, M. J., Hunt, J. S. Placenta and trophoblast: methods and protocols overview II. Methods Mol Med. 122, 3-7 (2006).
- Ritson, A., Bulmer, J. N. Extraction of leucocytes from human decidua. A comparison of dispersal techniques. J Immunol Methods. 104 (1-2), 231-236 (1987).
- White, H. D., et al. A method for the dispersal and characterization of leukocytes from the human female reproductive tract. Am J Reprod Immunol. 44 (2), 96-103 (2000).
- Maruyama, T., et al. Flow-cytometric analysis of immune cell populations in human decidua from various types of first-trimester pregnancy. Hum Immunol. 34 (3), 212-218 (1992).
- Zhang, J., et al. Isolation of lymphocytes and their innate immune characterizations from liver, intestine, lung and uterus. Cell Mol Immunol. 2 (4), 271-280 (2005).
- Carlino, C., et al. Recruitment of circulating NK cells through decidual tissues: a possible mechanism controlling NK cell accumulation in the uterus during early pregnancy. Blood. 111 (6), 3108-3115 (2008).
- Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Mol Reprod Dev. 75 (5), 818-827 (2008).
- Zhang, P., Wu, X., Hu, C., Wang, P., Li, X. Rho kinase inhibitor Y-27632 and Accutase dramatically increase mouse embryonic stem cell derivation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 48 (1), 30-36 (2012).
- Snegovskikh, V. V., et al. Intra-amniotic infection upregulates decidual cell vascular endothelial growth factor (VEGF) and neuropilin-1 and -2 expression: implications for infection-related preterm birth. Reprod Sci. 16 (8), 767-780 (2009).
- Oliver, C., Cowdrey, N., Abadia-Molina, A. C., Olivares, E. G. Antigen phenotype of cultured decidual stromal cells of human term decidua. J Reprod Immunol. 45 (1), 19-30 (1999).
- Chang, Y., Hsieh, P. H., Chao, C. C. The efficiency of Percoll and Ficoll density gradient media in the isolation of marrow derived human mesenchymal stem cells with osteogenic potential. Chang Gung Med J. 32 (3), 264-275 (2009).
- Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. , 670-672 (2014).
- Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
- Quan, Y., et al. Impact of cell dissociation on identification of breast cancer stem cells. Cancer Biomark. 12 (3), 125-133 (2012).
