Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Isolering af leukocytter fra det murine væv på maternel-føtal grænseflade

Published: May 21, 2015 doi: 10.3791/52866
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1,3,4
1Department of Obstetrics & Gynecology, Wayne State University School of Medicine, 2School of Paediatrics and Reproductive Health, Research Centre for Reproductive Health, the Robinson Research Institute, The University of Adelaide, 3Department of Immunology & Microbiology, Wayne State University School of Medicine, 4Perinatology Research Branch, NICHD/NIH/DHHS

Abstract

Immun tolerance i graviditeten kræver, at immunsystemet hos moderen undergår markante ændringer for at acceptere og give næring fosteret udvikle. Denne tolerance er initieret under coitus, etableret under befrugtning og implantation, og opretholdes under hele graviditeten. Aktive cellulære og molekylære mediatorer af maternel-føtal tolerance er beriget på stedet for kontakt mellem føtale og maternelle væv, kendt som den maternelle-føtale interface, som omfatter moderkagen og livmoderen og decidua væv. Denne grænseflade består af stromale celler og infiltrerende leukocytter, og deres overflod og fænotypiske karakteristika ændres i løbet af graviditeten. Infiltrerende leukocytter på maternel-føtal grænseflade indbefatter neutrofiler, makrofager, dendritiske celler, mastceller, T-celler, B-celler, NK-celler og NKT-celler, der samlet udgør det lokale mikromiljø, som opretholder graviditet. En ubalance mellem disse celler eller enhver inappropriate ændring i deres fænotyper betragtes som en mekanisme for sygdom i graviditeten. Derfor studiet af leukocytter, der infiltrerer maternel-føtal interface er afgørende for at belyse de immune mekanismer, der fører til graviditetsrelaterede komplikationer. Beskrevet heri er en protokol, som anvender en kombination af forsigtig mekanisk dissociation efterfulgt af et robust enzymatisk disaggregering med et proteolytisk og collagenolytisk enzymatisk cocktail at isolere de infiltrerende leukocytter fra de murine væv ved maternel-føtal interface. Denne protokol muliggør isolering af høje antal af levedygtige leukocytter (> 70%) med tilstrækkelig konserverede antigene og funktionelle egenskaber. Isolerede leukocytter kan derefter analyseres ved adskillige teknikker, herunder immunfænotype, cellesortering, imaging, immunoblotting, mRNA-ekspression, cellekultur og in vitro funktionelle assays såsom blandede leukocyt reaktioner, proliferation eller cytotoksicitetsassays.

Introduction

Immuntolerance i graviditeten er en periode, hvor markante ændringer forekommer inden immunsystemet hos moderen. Disse ændringer tillader moderen at tolerere fosteret, en semi-allogent transplantat 1. Fosteret udtrykker faderlige større histokompatibilitetskompleks (MHC) antigener 2, og fosterceller er blevet fundet i den maternelle cirkulation 3; imidlertid fosteret ikke afvist 4,5. Denne gåde er ikke fuldt forstået.

Den seneste hypotese, at maternel-føtal tolerance er skabt under coitus og befrugtning 6,7 og vedligeholdes for at opretholde en fuld sigt graviditet 8-10. En fordeling af dette maternel-føtal tolerance betragtes som en mekanisme for sygdom i tidlige og sene stadier af graviditeten 10-16. Maternel-føtal tolerance involverer deltagelse af forskellige leukocyt subpopulationer, herunder T-celler (regulerende T-celler, Th1-celler, Th2 celler og Th17 celler), macrophages, neutrofiler, mastceller, NK-celler, og NKT celler, dendritiske celler og B-celler, at ændring i tæthed og lokalisering hele graviditeten 15,17-19. Maternel-føtal tolerance er beriget på maternel-føtal grænseflade 20 - den anatomiske sted, hvor immunsystemet hos moderen interagerer med føtale antigener 20,21.

Den maternel-føtal interface er skabt under placentation når føtale extravillous trophoblastceller invadere slimhinden 22-24. På den føtale side af denne grænseflade, de membraner, der omgiver fosteret skabe en specialiseret epiteloverflade i moderkagen, og syncytiotrophoblast cellerne styrer udvekslingen af næringsstoffer gennem deres direkte kontakt med moderens blod 22. På moderens side af grænsefladen, decidua rekrutterer en heterogen pulje af leukocytter, som i mus udgør 30% til 50% af alle moderhindeceller. Ud over deres deltagelse i MATERNal immun tolerance, disse celler er vigtige bidragydere til forskellige processer under graviditeten, fx., beskyttelse af den reproduktive tarmkanalen fra infektioner, befrugtning, embryo implantation 7,25, decidua angiogenese 26, vaskulær remodellering 24,27, trofoblast invasion 28, placenta udvikling 24,25, og i sidste ende, arbejdskraft og levering 15,17. Derfor er studiet af de involverede i maternel-føtal tolerance leukocytter er afgørende for at belyse patogenesen af ​​graviditetsrelaterede komplikationer.

Mens anvendelsen af immunhistokemi og immunfluorescens har genereret data til direkte visualisering og lokalisering af uterin, decidua eller placenta leukocytter 29,30, flowcytometri analyse har yderligere afsløret specifikke delmængder af leukocytter i hvert af disse væv 31,32. Derudover flowcytometri er blevet anvendt til bestemmelse af massefylde og andelen af ​​maternal-føtal grænseflade leukocytter 33 og ekspressionsniveauer af ekstracellulære og intracellulære proteiner 8-10,34. Flowcytometrisk analyse af leukocytter ved maternel-føtal grænseflade kræver en enkelt-cellesuspension. For at isolere infiltrerende leukocytter fra decidua, livmoder og placenta væv, har to metoder til væv dissociation blevet anvendt: mekanisk og enzymatisk. Begge metoder tillader adskillelsen af ​​infiltrerede leukocytter fra den ekstracellulære matrix (ECM), i disse væv. Enzymatisk væv dissociation er overlegen i forhold til mekanisk væv dissociation da det tillader et højere udbytte af leukocytter med mindre forskydningskraft-associeret skade 35. Derfor kræver mekanisk væv dissociation pooling væv 36, hvilket kan øge variationen og heterogenitet af prøverne. Alligevel kan mekanisk dissociation være valg, når antigenet af interesse kan ændres ved enzymatisk dissociation eller når funktionaliteten af ​​cellens af interesse behov for at blive bevaret (f.eks., cytotoksicitet NK-celler) 35.

Anvendelsen af ​​proteolyse med specifikke enzymer til at nedbryde ECM eliminerer de lave udbytter observeret med mekanisk dissociation. Flere undersøgelser har rapporteret brugen af trypsin 32, collagenase 37, DNase 31, dispase 38, og kommercielle cocktails af forskellige enzymer 32,39. Imidlertid må arten og koncentrationen af ​​forskellige enzymer og varigheden af ​​fordøjelsen blive omhyggeligt defineret og valideret for at sikre opretholdelse af integriteten af ​​celleoverflade antigene epitoper, der kræves for immunfænotypebestemmelse. De forskellige overfladestrukturer er differentielt modtagelige for ødelæggelse af forskellige enzymer, med nogle enzymer, såsom trypsin, er berygtet for stripping leukocyt overflade epitoper genkendt af mange monoklonale antistoffer.

Indført heri er en fremgangsmåde under anvendelse af en proteolytic og collagenolytisk enzymatisk cocktail, kaldet Accutase. Denne enzymatiske opløsning er blid nok, mens den stadig effektiv i dissociering murine væv ved maternel-føtal grænseflade, og kræver ikke tilsætning af andre dissocierende reagenser eller serum Dissociation at afslutte reaktionen. Desuden er det klar til brug som leveret, og selv tidspunktet for dissociation skal valideres, er det mere robust end de ovenfor anførte enzymer 40,41.

Udnyttelsen af ​​en kombination af begge typer af væv opdeling forbedrer kvaliteten og mængden af ​​celler opnået; dermed har flere undersøgelser gennemført den kombinerede anvendelse af mekanisk og enzymatisk dissociation med tilfredsstillende resultat 31,32,37. Den her beskrevne protokol blev etableret og valideret i vores laboratorium; det bruger en kombination af en forsigtig mekanisk dissociation efterfulgt af et robust enzymatisk opdeling. Denne protokol tillader isoleringen og yderligere undersøgelse afde infiltrerende leukocytter i murine væv ved maternel-føtal grænseflade (livmoder, decidua og placenta). Følgende protokol opretholder også integriteten af ​​celleoverflademarkører og udbytter nok levedygtige celler til efterfølgende anvendelser som påvist ved flowcytometrisk analyse. Endelig er denne protokol bevarer sammenhængen i forberedelse celle til analyse og sammenligning af forskellige murine væv der udgør maternel-føtal interface.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Før du arbejder med de i denne protokol prøver, skal dyr etisk godkendelse gives af den lokale Research etiske komité og Institutional Review Boards. Når du arbejder med dyreblod, celler eller farlige stoffer, som er nævnt i denne protokol, skal de korrekte biosikkerhed og laboratorieudstyr sikkerhedstiltag følges.

1. Mus Håndtering og Tissue Collection

  1. Forbered en steril arbejdsstation og få sterile værktøjer til væv samling. Disse værktøjer vil omfatte store og små kirurgiske sakse, pincetter og fine-tip pincet. Inkluderer mindre petriskåle mærket med de relevante væv navne, fyldt med 1x phosphatpufret saltvand (PBS) opløsning (3 - 5 ml) ækvilibreret til stuetemperatur (20-22 ° C). Også omfatte en stor petriskål, umærket, fyldt med 1x PBS-opløsning (10 - 15 ml).
  2. Aflive en gravid mus (10,5-19,0 ​​dage efter coitum (DPC), eller før levering) ved hjælp af kuldioxid (CO 2). At sikre, at musen er aflivet, bruge cervikal dislokation teknik.
    Bemærk: Før 10,5 dpc, er det vanskeligt manuelt at adskille de decidua væv fra uterine væv. Hvis isoleringen af ​​decidua leukocytter ikke er påkrævet, leukocytter fra uterine væv af ikke-drægtige mus eller dem fra mus ved <10,5 dpc kan også udføres ved at følge denne protokol.
  3. Anvendelse af et par af sterile kirurgiske sakse, helt at fjerne den nedre abdominale del af huden og muskelvævet. Med en pincet, skub til side alle andre organer, indtil uterus og ovarier er synlige. Med livmoderen stadig er fastgjort, bruge tangen til at flytte den ud af bughulen (figur 1A).
  4. Lokalisere æggestokkene distale til æggelederen og uterotubal krydset af hver uterine horn. Brug af små kirurgiske sakse, gør et snit på uterotubal krydset og adskille uterine horn fra mesenteriet indeholder uterine fartøjer; derefter,punktafgiftsbetaling på livmoderhalsen at frigøre livmoderhornene fra den peritoneale kavitet (figur 1B).
  5. Med små kirurgiske sakse, lave et snit mellem livmoderhalsen og den nedre del af de uterine horn. Leave fastgjort en del af livmoderhalsen under denne proces (figur 1C) for at undgå at åbne den uterine horn.
  6. Fordybe livmoderhornene (herunder livmoderhalsen) i en stor petriskål fyldt med 1x PBS-opløsning (10 - 15 ml) for at hydratisere implantationssteder.
  7. Mens stadig fordybet i 1 x PBS-opløsning, trimme noget fedt fra livmoderhornene med de små kirurgiske sakse. Hold væv nedsænket i 1x PBS-opløsning hele dissektion.
  8. Holder livmoderhornene på plads med pincet, fjerne en af implantationssteder fra livmoderen med en tværgående skære gennem inter-implantation region, under anvendelse af de små kirurgiske sakse (figur 1D). Implantationsstedet indeholder fosteret, omgivet afchorioallantois membran og livmoderens, decidua og placenta væv.
  9. Under anvendelse af de pincet, holde sitet på plads og gør et lille snit i livmodervæggen tilstødende til placentale og decidua væv (figur 1E). Trimme omkring omkredsen af placenta / decidua indtil disse blive adskilt fra både livmodervæggen og chorioallantois membran der omfatter fosteret (figur 1F).
  10. Fjern placenta og vedhæftede decidua væv og sted i 1x PBS-opløsning (3 - 5 ml; se trin 1.12).
  11. Placer fosteret omgivet af chorioallantois membran fastgjort til uterine væv i en petriskål fyldt med 1x PBS-opløsning (3 - 5 ml). Hydreringen af ​​disse væv vil lette adskillelsen af ​​chorioallantois membran fra livmodervæggen (se trin 1.14).
  12. Ved hjælp af et par fine-tip pincet, skræl forsigtigt decidua væv (hvid-grå lag) fra placenta overflade. Udfør dennetrin omhyggeligt for at bevare integriteten af placenta og decidua væv (Figur 1G).
  13. Placer placenta og decidua væv i to separat mærkede petriskåle fyldt med 1x PBS-opløsning (3 - 5 ml hver).
  14. Fjern forsigtigt livmodervæggen fra chorioallantoiske membran med fin-tip pincet. Disse er de uterine væv.
  15. Placer uterine væv i en petriskål fyldt med 1x PBS-opløsning (3 - 5 ml).
  16. Gentag trin 1.8 gennem 1,15, indtil alle implantationssteder er blevet behandlet.
  17. Saml flere uterin, decidua og placenta væv til at forbedre udbyttet af celler under enzymatisk fordøjelse. Mængden af ​​væv afhænger af kuldstørrelse; dog leukocyt isolation kræver> 2 stykker af væv.
    Bemærk: For mere detaljerede oplysninger om dissektion af implantationssteder på forskellige svangerskabsuge dage, se billederne findes i kapitel to af Vejledning til undersøom of Mouse Graviditet 42.

2. uterin, decidua og placentavæv Dissociation

  1. Label flere sterile 2 ml koniske rør med passende væv navn, og placere et hætteglas med 1.000 ul enzymatisk løsning på is.
  2. Fra petriskålen fyldt med 1x PBS-opløsning, overføres to stykker (100 - 150 mg) i uterus, decidua eller placentavæv til en mærket 2 ml konisk rør.
  3. Tilsættes 500 pi kold enzymatisk opløsning i hver 2 ml konisk rør.
  4. Med fine steril saks, begynder at dissociere vævet nedsænket i den enzymatiske løsning, indtil den er fint hakket. Over tid, vil suspensionen udvikle et mælkeagtigt udseende. Dette trin bør ikke overstige mere end 2 minutter for at forhindre over-manipulation af prøven.
  5. Når vævet er blevet dissocieret, tilføje ekstra 500 pi kold enzymatisk løsning på 2 ml konisk rør.
  6. Placer 2 ml konisk rør på is.
  7. Gentag trin 2.2 gennem 2.6 med enkelte væv, indtil alle væv er blevet behandlet.
  8. Overfør alle 2 ml koniske rør med homogeniseret væv (hakket væv + enzymatisk opløsning) prøver fra isen i en inkubator ved 37 * C og udføre en blid orbital omrøring (80 rpm). Inkuber i 30-35 min. Sørg temperaturen af ​​inkubatoren stabiliseres før start inkubationstiden.
  9. Efter inkubation fjernes de 2 ml koniske rør med dissocierede væv fra inkubatoren og placere dem på is for at undgå yderligere fordøjelse.
  10. Label sterile 50 ml koniske rør efter vævstype. Fjern låget og erstatte dem med en steril cellefilter (100 um porestørrelse).
  11. Hæld de dissocierede væv fra de 2 ml koniske rør gennem cellefilter igennem ~ 20 ml 1x PBS-opløsning. Fragmenter af væv forbliver i cellen si og cellesuspensionen vil passere gennem den.
  12. Vask dissociated væv i cellefilter 2 - 3 gange med 20 ml 1x PBS-opløsning ved hjælp af en overførsel pipette.
  13. Skyl de tomme 2 ml koniske rør med 1 x PBS-opløsning (1 ml) og hælde indholdet gennem cellen sier.
  14. Fjern celle sier fra de 50 ml koniske rør og erstatte lågene. Centrifuger rørene ved 1.250 xg i 10 minutter ved 4 * C.
  15. Omhyggeligt, aspireres supernatanten uden at forstyrre cellepelleten. Cellepelleten indeholder de isolerede leukocytter og stromaceller.
  16. Resuspender cellepelleten i 1 ml RPMI dyrkningsmedium uden kalvefosterserum (FBS). Bland forsigtigt. Brug ikke vortex.
  17. Tilsættes 500 pi af pæne FBS til en 5 ml polystyren plastrør og langsomt overlay cellesuspensionen.
  18. Centrifuge i 10 minutter ved 1.100 xg uden bremsen ved stuetemperatur for at pelletere levedygtige celler, mens cellerester tilbageholdes på PBS / FBS interface.
  19. Aspirer supernatanten uden at røre cellepelleten. Den cell pellet indeholder hovedsagelig levedygtige celler.
  20. Eventuelt: For at koncentrere de mononukleære celler, anvendes en 20% mættet opløsning polysaccharid, som beskrevet nedenfor.
    1. Resuspender cellepelleten i 1000 pi RPMI dyrkningsmedium uden FBS.
    2. Der tilsættes 1 ml 20% mættet polysaccharid-opløsning til en 5 ml polystyren plastrør og langsomt overlay cellesuspensionen oven på denne opløsning, ifølge producentens anvisninger. Mens lagdeling prøven, undgå at blande 20% mættet polysaccharidopløsning med cellesuspensionen.
    3. Centrifuge med en swing-out-rotor ved 500 xg i 30 minutter ved stuetemperatur uden bremse. Det er meget vigtigt at slukke bremsen for at undgå at blande cellerne og miste gradienten. Mononukleære celler vil blive fundet i grænsefladen mellem 20% mættet polysaccharid-opløsning, og 1 x PBS-opløsning.
    4. Aspirer og kassér supernatanten. Cellepelleten indeholder hovedsagelig mononukleære celler.
      Ingente: For at udføre levedygtighed farvning og intracellulær farvning, se trin 3. For at udføre immunfænotypebestemmelse Se trin 4. For at udføre levedygtighed farvning og kun ekstracellulær farvning, se trin 5. Hvis du vil udføre en cellekultur af isolerede leukocytter, se trin 6. Hvis du vil udføre magnetisk cellesortering, se trin 7.

3. Levedygtighed Farvning for fixable Cells

  1. Resuspender cellepelleten i 1.100 pi 1x PBS-opløsning. Bland forsigtigt ved hjælp af en mikro-pipette.
  2. Overføre 100 pi af cellesuspensionen i en 5 ml polystyren plastrør. Der tilsættes 400 pi 1x PBS-opløsning til 5 ml polystyrenrør. Dette rør er en kontrol for vævs autofluorescens. Opbevar ved 4 ºC, indtil trin 3.5.
  3. Overføre de resterende 1.000 pi af cellesuspensionen til en ny 5 ml polystyren plastrør. Tilsæt 1 pi viabilitetsfarvestoffet og forsigtigt homogeniseres. Der inkuberes i 30 minutter i mørke ved 4 ºC.
  4. Efter inkubering tilsættes 1,000 & #181 l 1x PBS-opløsning. Bland forsigtigt med hånden.
  5. Centrifuger begge 5 ml polystyren plastrør (trin 3.2 og 3.3) ved 1250 xg i 10 minutter ved 4 * C. Aspirer og kassér supernatanten.
    Bemærk: Cellepelleten (trin 3.3) vil blive anvendt i trin 4. Cellepelleten (trin 3.2) vil tjene som kontrol for vævs autofluorescens.

4. Immunfænotypebestemmelse

  1. Resuspender cellepelleten i 50 pi anti-muse CD16 / CD32 (fortyndet 1: 100 i FACS-buffer [0,1% BSA, 0,05% natriumazid, 1 x PBS, pH 7,4]). Bland cellesuspensionen forsigtigt. Brug ikke vortex.
  2. Inkubér cellesuspensionen i 5 ml polystyrenrør i mørke ved 4 ° C i 10 minutter.
  3. Efter inkubering tilsættes 50 ul af hver anti-leukocyt monoklonalt antistof, der reagerer med extracellulære celleoverflademarkører eller isotype-matchet kontrol antistof (antistof-fortyndinger skal valideres). For eksempel at analysere leukocyt subpopulationer, bruge anti-moanvende antistoffer, der reagerer med følgende leukocyt-celleoverflademarkører: CD45, Ly6G, F4 / 80, CD11c, CD49b, B220, CD3, CD4, CD8 og (tabel 1).
  4. Når antistoffer mod ekstracellulære markører er blevet tilsat til 5 ml polystyren plastrør, bland forsigtigt. Inkuber i mørke i 30 minutter ved 4 ° C.
  5. Under denne inkubering klargør og for-opvarme fiksering pufferopløsning (fortyndet med deioniseret vand, 1: 5) til 37 * C, hvis det kræves. Hold buffer ved 37 ºC i mørke, indtil dets anvendelse er nødvendig.
  6. Efter 30 minutters inkubation tilsættes 500 pi FACS buffer i 5 ml polystyren plastrør og forsigtigt blandes. Dette trin er nødvendigt for at vaske cellerne og fjerne ethvert overskud af ubundet antistof.
  7. Centrifugeres prøverne ved 1.250 xg ved 4 ° C i 10 minutter. Aspirer og kassér supernatanten.
    Bemærk: Hvis intracellulær farvning ikke er påkrævet, se trin 5. Hvis intracellulær farvning er påkrævet, udføre permeabilisering og intracellehandoverular farvning her, og derefter fortsætte med fiksering (trin 4.8).
  8. Tilsættes 500 pi af forvarmet fiksering pufferopløsning til cellepelleten og inkuberes i mørke i 10 minutter ved 37 ºC.
  9. Dispensere 500 pi FACS buffer i 5 ml polystyren plastrør. Bland forsigtigt.
  10. Centrifugeres prøverne ved 1.250 xg ved 4 ° C i 10 minutter. Aspirer og kassér supernatanten.
  11. Tilsættes 500 pi FACS buffer til hver prøve. Disse prøver kan nu analyseres ved flowcytometri. Erhverve prøverne straks for de bedste resultater.

5. Levedygtighed Farvning for uløselige Cells

  1. Efter ekstracellulær immunfænotype, resuspender cellepelleten i 500 pi FACS buffer.
  2. Tilsæt 1 pi 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol dihydrochlorid (DAPI, 200 ug / ml) lige før erhverve prøven.
  3. Visualiser prøverne inden for 1 - 2 min efter tilsætning af DAPI ved hjælp af en flowcytometer.

  1. Forbered en arbejdsstation under en steril emhætte. Pre-varme RPMI dyrkningsmedium til 37 ° C under anvendelse af et vandbad.
  2. Resuspender cellepelleten 1000 pi FACS buffer til celletælling.
  3. Tæl antallet af levedygtige celler ved hjælp af en automatisk celletæller eller hæmocytometer og 0,4% trypanblåt løsning som følge producentens instruktioner. Optage den samlede levende celletal.
  4. Centrifuger cellerne ved 1.250 xg ved 4 ° C i 10 minutter til fjernelse af FACS buffer.
  5. Resuspender cellepelleten i 500 pi forvarmet RPMI dyrkningsmedium ved forsigtigt at pipettere 2 til 3 gange.
  6. Plate det ønskede antal celler i en steril 24-brønds plade og inkuberes ved 37 ° C. Inkubationstiden vil blive bestemt af forskningsspørgsmålet.

7. Magnetisk Cell Sortering

  1. Oprette en ren arbejdsstation med følgende materialer: MS søjler, magnetiske celle separator, 15ml koniske rør, 30 um pre-separation filtre og en multi-stativ.
  2. Resuspender cellepelleten i 500 pi MACS puffer (0,5% BSA, 2 mM EDTA, 1 x PBS, pH 7,2).
  3. Ved hjælp af en automatisk celle counter eller hæmocytometer og 0,4% trypanblåt løsning, tælle og registrere den samlede levende celletal.
  4. Centrifuger cellerne ved 1.250 xg ved 4 ° C i 10 minutter. Aspirer og kassér supernatanten. Tilføje yderligere 500 pi MACS buffer.
  5. Fortsæt til udføre den magnetiske separation efter producentens anbefalinger.
  6. Bestemme renhed ved flowcytometri eller mikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dissektion af murine væv fra maternel-føtal grænseflade er vist i figur 1; denne procedure omfatter åbning af bughulen (figur 1A, B), uterine horn (Figur 1C), herunder de implantationssteder (figur 1D), og indsamlingen af de uterine væv (Figur 1E), placenta (figur 1F), og decidua væv (figur 1G) til 16,5 dpc. Figur 2 viser morfologien af isolerede makrofager (F4 / 80 +) indsamles fra decidua og uterine væv på 16,5 dpc anvender magnetisk cellesortering. Isolerede makrofager opretholder evnen til at frigive cytokiner (data ikke vist). Udbyttet af levedygtige celler isoleret fra decidua, uterus, og placenta er vist i figur 3, og cellelevedygtighed er større end 70% i alle væv. Figur 4 viser gating strategi til analyse polymorphonucle Ar og mononukleære leukocytter inden for pyjamas og levedygtighed porte, herunder T-celler (CD45 + CD3 +), neutrofiler (CD45 + Ly6G +), makrofager (CD45 + F4 / 80 +), dendritiske celler (CD45 + CD11 +), og NK-celler (CD45 + CD49b +) på 16,5 dpc. En høj andel af makrofager co-express CD11c figur 5. Viser neutrofiler, makrofager og T-celler i decidua, livmoder og placenta væv på 16,5 dpc. Figur 6 viser gating strategi til analyse lymfocytter inden for slåbrokker og levedygtighed porte, herunder T-celler (CD45 + CD3 +) og B-celler (CD45 + B220 +) ved 16,5 dpc. T-celler omfatter CD4 + og CD8 + T-celler. Murine væv på maternel-føtal grænseflade også omfatte CD3 + CD4-CD8- (gamma-delta T-celler) i høje andele. Figur 7 viser T-celler og B-celler i decidua, livmoder og placenta væv på 16,5 dpc.

jpg "width =" 700 "/>
Figur 1. Tissue dissektion. (A) livmoderhornene på 16,5 dpc i en B6 mus. Livmoderhornene er fastgjort til mesenterium og drænende fartøjer. (B) livmoderhornene dissekeret fra mesenteriet og stadig fastgjort til livmoderhalsen. (C) livmoderhornene herunder implantationssteder og livmoderhalsen. (D) Dissektion af en implantation site. (E) Dissektion af uterine væv fra implantationsstedet. (F) Separation af placenta og decidua af implantationsstedet. (G) Detachment af decidua (hvid-grå lag) fra moderkagen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Makrofager isoleret fra decidua og uterine væv. Makrofager (F4 / 80 + celler) isoleret fra decidua og uterine væv på 16,5 dpc anvender magnetisk cellesortering. 20X forstørrelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Levedygtighed af isolerede celler. Levedygtige celler (DAPI- celler repræsenteret med pile) isoleret fra decidua, livmoder og placentale væv. Klik her for at se en større version af dette tal.

"/>
Figur 4. Gating strategi for polymorfkernede og mononukleære leukocytter. Total leukocyt population var gated indenfor slåbrokker og levedygtighed porte. T-celler (CD45 + CD3 +), makrofager (CD45 + F4 / 80 +), neutrofiler (CD45 + Ly6G +), dendritiske celler (CD45 + CD11 +) og NK celler (CD45 + CD49b +) blev gated inden for den samlede-leukocyt gate ( CD45 +). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. neutrofiler, makrofager og T-celler i murine væv på maternel-føtal grænseflade. Neutrofiler (CD45 + Ly6G +), makrofager (CD45 + F4 / 80 +), og T-celler (CD45 + CD3 +) blev gated inden levedygtigheden og total-leukocyt (CD45 +) porte i isolerede decidua, livmoder og placenta celler.TPS: //www.jove.com/files/ftp_upload/52866/52866fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6. Gating strategi for lymfocytter. Mononukleære celler blev gated indenfor slåbrokker og levedygtighed porte. T-celler (CD3 +) og B-celler (B220 +) blev gated inden levedygtighed gate. CD4 + og CD8 + T-celler blev gated i T-celle gate (CD3 +). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7
Figur 7. Lymfocyt subpopulationer i murine væv ved maternel-føtal grænseflade. T-celler (CD3 +)og B-celler (B220 +) blev gated inden levedygtighed gate i isoleret decidua, livmoder og placentale celler. CD4 + og CD8 + T-celler blev gated i T-celle gate (CD3 +). Klik her for at se en større version af dette tal.

Cellemarkør Fluorokrom Klon Firma Catalog Number
LIVE / DEAD DAPI - Life Technologies L23105
CD45 V450 30-F11 BD Biosciences 560.501
CD3 FITC 145-2C11 BD Biosciences 553.062
CD4 APC RM4-5 BD Biosciences 553.051
CD8 PE-CF594 53-6,7 BD Biosciences 562.283
B220 APC-Cy7 RA3-6B2 BD Biosciences 552.094
F4 / 80 PE BM8 eBiosciences 12-4801-82
Ly6G APC-Cy7 1A8 BD Biosciences 560.600
CD49b APC DX5 BD Biosciences 560.628
CD11c PE-Cy7 HL3 BD Biosciences 558.079

Tabel 1. Liste over antistoffer anvendes til leukocyt delmængde immunfænotypebestemmelse

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Indsamlingen af ​​sammenhængende data, der registrerer overflod og fænotypiske karakteristika infiltrerende leukocytter ved maternel-føtal interface er afgørende for at forstå patogenesen af ​​graviditetsrelaterede komplikationer. Adskillige teknikker er blevet beskrevet som letter isoleringen af infiltrerende leukocytter fra de murine væv på maternel-føtal grænseflade hele graviditeten 31,38,39,43-46. Men hver teknik er forskellige, anvender forskellige enzymer eller enzymkombinationer, kræver forskellige dissociation gange, specificerer ikke mængder væv, og, vigtigst af alt, ikke altid angive levedygtigheden af ​​de isolerede celler. Den her beskrevne protokol tillader isolering af infiltrerende leukocytter fra de murine væv ved maternel-føtal grænseflade med høj levedygtighed, og giver detaljerede oplysninger om de kommercielle reagenser, forberedelse buffer, væv mængder, og inkubationstider valideret ilaboratorium.

En af de mest kritiske trin af leukocyt isolation processen er vævet dissociation; Dette trin involverer mekanisk homogenisering og / eller enzymatiske reaktioner, der kan ændre integriteten af ekstracellulære proteiner, der anvendes i fænotypisk karakterisering 47. Den heri beskrevne protokol giver en ny tilgang, der kombinerer brugen af ​​blide mekaniske og enzymatiske væv dissociation teknikker til at bevare integriteten af ​​ekstracellulære markører i leukocytterne isoleret fra placenta og decidua og uterine væv fra mus.

Single enzymer og kombinationer af forskellige enzymer er blevet anvendt til at isolere infiltrerende leukocytter fra de murine væv ved maternel-føtal grænseflade 31,32,39,44. I mange tilfælde kan disse enzymer, der er udarbejdet til specifikke koncentrationer i hånden i laboratoriet være underlagt menneskelige fejl. Her, i stedet, en klar-til-brug renset collagenase / neutral protlette cocktail, Accutase, er blevet gennemført i laboratoriet; som en kommercielt tilgængelig enzympræparat, har det vist sig at give pålidelige resultater i cellekultur 48. Denne enzymatiske opløsning er kendt for effektivt at frigøre makrofager fra dyrkningspladerne uden skrabning og, vigtigst af alt, uden at miste overfladeantigener 48. Denne tilberedt enzym er også blevet anvendt til at behandle fordøjelsen af humane og animalske nervesystem væv, hvilket resulterer i levedygtige isolerede celler, som er holdbare over lange perioder, hvilket muliggør deres efterfølgende kultur 47. Desuden er denne enzymatiske løsning bevarer CD24 antigenicitet i isolerede celler fra centralnervesystemet væv 47. Sammenlignet med Liberase-1, en anden cocktail af collagenase og neutral protease, hverken Accutase eller Liberase-1 generere frit DNA aggregater; imidlertid Accutase er mere skånsom end Liberase-1 under væv dissociation 47. Collagenase / neutral protease cocktail anvendt i denne protokol har også vist overlegenhed til trypsin i bevarelsen af CD44, en cancer stamceller overflade markør 49. Denne laboratoriets undersøgelser har konsekvent bemærket, at denne enzymatiske løsning bevarer muse leukocyt overfladeantigener. Faktisk er fundet informative forskelle i ekspressionen af ​​ekstracellulære markører i makrofager (CD11 + F4 / 80 + celler), neutrofiler (CD11b + Ly6G + -celler), NKT-celler (CD3 + CD49b + celler), T-celler (CD3 + celler) og B celler (B220 + CD19 + celler), herunder CD4, CD8, CD69, CD25, CD40L, PD1, CD44, CD62L, og CTLA4, og cytokinfrigivelse. Derfor er den heri beskrevne fremgangsmåde er optimal for immunfænotype af infiltrerende leukocytter ved maternel-føtal grænseflade i mus, som vist i de repræsentative resultater.

En vigtig fordel ved denne fremgangsmåde er samtidig bestemmelse af flere ekstracellulære og intracellulære antigener inden levedygtighed gate. Farvestoffet er mest anvendt til at delevedygtighed Termine celle er propidiumiodid (PI); men dens anvendelse er begrænset, da den kan kun anvendes i kombination med FITC. Dette skyldes, PI ikke i tilstrækkelig grad kan skelnes fra de fleste andre fluorochromer ophidset af blå og røde lasere 50. En løsning er at bruge DAPI 50 eller enhver anden farvestof, som er exciteres af UV-lasere, men ikke af blå og røde lasere der almindeligvis anvendes til immunfænotypebestemmelse. Denne protokol tillader immunfænotypebestemmelse af levedygtige celler, da det omfatter brug af DAPI 50 for uløselige celler eller brug af levedygtighed farvestof for kan rettes celler.

En anden vigtig fordel ved protokollen beskrevet heri er, at den tillader isolering af leukocytter med et højt udbytte af levedygtige celler. Den repræsentative data viser, at 70% til 89% af de isolerede celler er levedygtige. Dette er af stor betydning, da denne protokol har muliggjort studiet af de funktionelle egenskaber af de isolerede celler fra murine væv ved maternel-føtal interface. Feller eksempel har kulturer af decidua og uterin makrofager og studiet af cytokinfrigivelse under stimulation blevet udført under anvendelse af denne metode.

For at opnå gode resultater, anvendelsen af ​​den beskrevne protokol er vigtig, når man overvejer følgende faktorer: 1) væv samling skal udføres inden for 5 til 10 minutter efter åbning af bughulen, og disse væv skal placeres på is for at bevare levedygtigheden af de isolerede celler; 2) mekanisk væv homogenisering skal udføres under anvendelse af fin-spids saks og kan ikke overstige 2 min siden længere perioder er blevet demonstreret at reducere udbyttet af levedygtige celler; 3) varigheden af ​​inkubationen med den enzymatiske løsning skal være mindre end 1 time siden sin aktivitet aftager efter denne periode; 4) temperaturen af ​​inkubation med den enzymatiske opløsning skal holdes på 37 ° C til opnåelse af optimal aktivitet af denne cocktail af enzymer; 5) cellepellet Manipulation skal ske forsigtigt med mikropipetter fordi anvendelse af hvirvlen kan skade integriteten af ​​cellerne (isolerede celler er differentieret og pludselige manipulation kan let reducere deres levedygtighed); 6) buffer og centrifuger temperaturer skal holdes på den samme temperatur som cellesuspensionen; 7) isolerede celler skal behandles for immunofænotypebestemmelse eller anvendes straks som deres levedygtighed reducerer hurtigt; og 8), når du udfører immunfænotypebestemmelse prøver skal erhverves ved hjælp af et flowcytometer straks for de bedste resultater.

En begrænsning af denne protokol er omkostningerne ved den enzymatiske løsning, som er dyrere end andre enzymer med lignende funktioner, f.eks, trypsin, dispase II og collagenase. Men de fordele, denne enzymatiske opløsning viser ud over de beskrevne enzymer er, overlegen.

Udover immunfænotypebestemmelse og cellekultur og sortering, de fremtidige anvendelser af denne protokol er numerous og varieret. For eksempel er det nu muligt at bestemme DNA-methylering, ekspression af målgener, in vitro leukocyt-funktionalitet (f.eks, fagocytose, cytotoksicitet, T-celleproliferation og plasticitet assays, etc.), og produktion af reaktive oxygenarter i leukocytterne isolerede fra murine væv ved maternel føtal interface. Faktisk kan beskrivelse af nye og sjældne leukocytter i murine væv ved maternel-føtal grænseflade også blive udført.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne afslører ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

NGL blev støttet af Wayne State University Perinatal Initiative i Maternal, Perinatal og børns sundhed. Vi takker Maureen McGerty og Amy E. Furcron (Wayne State University) for deres kritisk læsning af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Magentic Cell Separation
MS Columns Militenyi Biotec 130-042-201
Cell Separator Militenyi Biotec 130-042-102
30 μm pre-separation filters Militenyi Biotec 130-041-407
Multistand Militenyi Biotec 130-042-303
15 ml conical tubes Thermo Fisher 339650
MACS Buffer Militenyi Biotec Laboratory preparation (0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1x PBS, pH 7.2)
Reagents
Accutase enzymatic solution Life Technologies A11105-01
Anti-mouse CD16/CD32 BD Biosciences 533142
Anti-mouse extracellular antibodies BD Bioscences/eBiosciences Table 1
Sodium azide Fisher S227-500
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7906-100G
LIVE/DEAD viability dye Life Technologies L23105
Fixation buffer solution BD Biosciences 558049
FACS Buffer BD Biosciences Laboratory preparation 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 1x PBS, pH 7.4
Trypan blue solution 0.4% BIO-RAD 145-0013
Fetal bovine serum (FBS) Life Technologies 16000-044
Additional Instruments
Incubator with shaker Thermo Scientific MaxQ 4450
Flow cytometer BD LSRFortessa
Centrifuge Thermo Scientific Legend LXTR
Vacuum system laboratory constructed
Incubator Thermo Scientific Incubator 3307
Water bath Precision 51221035
Cell counter BIO-RAD TC20 Automated Cell Counter
Optical and fluorescence microscopes Zeiss and Olympus Zeiss LSM780 and Olympus CKX41

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trowsdale, J., Betz, A. G. Mother's little helpers: mechanisms of maternal-fetal tolerance. Nat Immunol. 7 (3), 241-246 (2006).
  2. King, A., et al. Evidence for the expression of HLAA-C class I mRNA and protein by human first trimester trophoblast. J Immunol. 156 (6), 2068-2076 (1996).
  3. Bonney, E. A., Matzinger, P. The maternal immune system's interaction with circulating fetal cells. J Immunol. 158 (1), 40-47 (1997).
  4. Tafuri, A., Alferink, J., Moller, P., Hammerling, G. J., Arnold, B. T cell awareness of paternal alloantigens during pregnancy. Science. 270 (5236), 630-633 (1995).
  5. Chaouat, G., Petitbarat, M., Dubanchet, S., Rahmati, M., Ledee, N. Tolerance to the foetal allograft. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 624-636 (2010).
  6. Robertson, S. A., et al. Seminal fluid drives expansion of the CD4+CD25+ T regulatory cell pool and induces tolerance to paternal alloantigens in mice. Biol Reprod. 80 (5), 1036-1045 (2009).
  7. Robertson, S. A., Moldenhauer, L. M. Immunological determinants of implantation success. Int J Dev Biol. 58 (2-4), 205-217 (2014).
  8. Aluvihare, V. R., Kallikourdis, M., Betz, A. G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat Immunol. 5 (3), 266-271 (2004).
  9. Rowe, J. H., Ertelt, J. M., Xin, L., Way, S. S. Pregnancy imprints regulatory memory that sustains anergy to fetal antigen. Nature. 490 (7418), 102-106 (2012).
  10. Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict. Cell. 150 (1), 29-38 (2012).
  11. Saito, S., Sakai, M., Sasaki, Y., Nakashima, A., Shiozaki, A. Inadequate tolerance induction may induce pre-eclampsia. J Reprod Immunol. 76 (1-2), 30-39 (2007).
  12. Lee, J., et al. A signature of maternal anti-fetal rejection in spontaneous preterm birth: chronic chorioamnionitis, anti-human leukocyte antigen antibodies, and C4d. PLoS One. 6 (2), 0016806 (2011).
  13. Steinborn, A., et al. Pregnancy-associated diseases are characterized by the composition of the systemic regulatory T cell (Treg) pool with distinct subsets of Tregs. Clin Exp Immunol. 167 (1), 84-98 (2012).
  14. Gomez-Lopez, N., Laresgoiti-Servitje, E. T regulatory cells: regulating both term and preterm labor. Immunol Cell Biol. 90 (10), 919-920 (2012).
  15. Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. A., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol. 23 (10), 46 (2014).
  16. Romero, R., Dey, S. K., Fisher, S. J. Preterm labor: one syndrome, many causes. Science. 345 (6198), 760-765 (2014).
  17. Gomez-Lopez, N., Guilbert, L. J., Olson, D. M. Invasion of the leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy. J Leukoc Biol. 88 (4), 625-633 (2010).
  18. Timmons, B., Akins, M., Mahendroo, M. Cervical remodeling during pregnancy and parturition. Trends Endocrinol Metab. 21 (6), 353-361 (2010).
  19. Arck, P. C., Hecher, K. Fetomaternal immune cross-talk and its consequences for maternal and offspring's health. Nat Med. 19 (5), 548-556 (2013).
  20. Erlebacher, A. Immunology of the maternal-fetal interface. Annu Rev Immunol. 31, 387-411 (2013).
  21. Wambach, C. M., Patel, S. N., Kahn, D. A. Maternal and fetal factors that contribute to the localization of T regulatory cells during pregnancy. Am J Reprod Immunol. 71 (5), 391-400 (2014).
  22. Cross, J. C., Werb, Z., Fisher, S. J. Implantation and the placenta: key pieces of the development puzzle. Science. 266 (5190), 1508-1518 (1994).
  23. Georgiades, P., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Comparative developmental anatomy of the murine and human definitive placentae. Placenta. 23 (1), 3-19 (2002).
  24. Croy, B. A., et al. Imaging of vascular development in early mouse decidua and its association with leukocytes and trophoblasts. Biol Reprod. 87 (5), (2012).
  25. Hofmann, A. P., Gerber, S. A., Croy, B. A. Uterine natural killer cells pace early development of mouse decidua basalis. Mol Hum Reprod. 20 (1), 66-76 (2014).
  26. Lima, P. D., Zhang, J., Dunk, C., Lye, S. J., Anne Croy, B. Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy. Cell Mol Immunol. , (2014).
  27. Robson, A., et al. Uterine natural killer cells initiate spiral artery remodeling in human pregnancy. FASEB J. 26 (12), 4876-4885 (2012).
  28. Lash, G. E., et al. Regulation of extravillous trophoblast invasion by uterine natural killer cells is dependent on gestational age. Hum Reprod. 25 (5), 1137-1145 (2010).
  29. Kruse, A., Merchant, M. J., Hallmann, R., Butcher, E. C. Evidence of specialized leukocyte-vascular homing interactions at the maternal/fetal interface. Eur J Immunol. 29 (4), 1116-1126 (1999).
  30. Degaki, K. Y., Chen, Z., Yamada, A. T., Croy, B. A. Delta-like ligand (DLL)1 expression in early mouse decidua and its localization to uterine natural killer cells. PLoS One. 7 (12), 28 (2012).
  31. Habbeddine, M., Verbeke, P., Karaz, S., Bobe, P., Kanellopoulos-Langevin, C. Leukocyte Population Dynamics and Detection of IL-9 as a Major Cytokine at the Mouse Fetal-Maternal Interface. PLoS One. 9 (9), (2014).
  32. Blaisdell, A., Erlbacher, E. Ch. 53. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. Yamada, A. T., Croy, B. A., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. , Elsevier Academic Press. 619-635 (2014).
  33. Rinaldi, S. F., Catalano, R. D., Wade, J., Rossi, A. G., Norman, J. E. Decidual neutrophil infiltration is not required for preterm birth in a mouse model of infection-induced preterm labor. J Immunol. 192 (5), 2315-2325 (2014).
  34. Plaks, V., et al. Uterine DCs are crucial for decidua formation during embryo implantation in mice. J Clin Invest. 118 (12), 3954-3965 (2008).
  35. Parr, E. L., Szary, A., Parr, M. B. Measurement of natural killer activity and target cell binding by mouse metrial gland cells isolated by enzymic or mechanical methods. J Reprod Fertil. 88 (1), 283-294 (1990).
  36. Arck, P. C., et al. Murine T cell determination of pregnancy outcome. Cell Immunol. 196 (2), 71-79 (1999).
  37. Male, V., Gardner, L., Moffett, A. Isolation of cells from the feto-maternal interface. Curr Protoc Immunol. 7 (7), 1-11 (2012).
  38. Li, L. P., Fang, Y. C., Dong, G. F., Lin, Y., Saito, S. Depletion of invariant NKT cells reduces inflammation-induced preterm delivery in mice. J Immunol. 188 (9), 4681-4689 (2012).
  39. Collins, M. K., Tay, C. S., Erlebacher, A. Dendritic cell entrapment within the pregnant uterus inhibits immune surveillance of the maternal/fetal interface in mice. J Clin Invest. 119 (7), 2062-2073 (2009).
  40. Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Mol Reprod Dev. 75 (5), 818-827 (2008).
  41. Zhang, P., Wu, X., Hu, C., Wang, P., Li, X. Rho kinase inhibitor Y-27632 and Accutase dramatically increase mouse embryonic stem cell derivation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 48 (1), 30-36 (2012).
  42. Pang, S. C., Janzen-Pang, J., Tse, Y., Croy, B. A. Ch. 2. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. Yamada, A. T., Croy, B. A., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. , Elsevier Academic Press. 21-42 (2014).
  43. Zenclussen, A. C., et al. Murine abortion is associated with enhanced interleukin-6 levels at the feto-maternal interface. Cytokine. 24 (4), 150-160 (2003).
  44. Mallidi, T. V., Craig, L. E., Schloemann, S. R., Riley, J. K. Murine endometrial and decidual NK1.1+ natural killer cells display a B220+CD11c+ cell surface phenotype. Biol Reprod. 81 (2), 310-318 (2009).
  45. Addio, F., et al. The link between the PDL1 costimulatory pathway and Th17 in fetomaternal tolerance. J Immunol. 187 (9), 4530-4541 (2011).
  46. Shynlova, O., et al. Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling. J Cell Mol Med. 17 (2), 311-324 (2013).
  47. Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
  48. Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. , 670-672 (2014).
  49. Quan, Y., et al. Impact of cell dissociation on identification of breast cancer stem cells. Cancer Biomark. 12 (3), 125-133 (2012).
  50. Gordon, K. M., Duckett, L., Daul, B., Petrie, H. T. A simple method for detecting up to five immunofluorescent parameters together with DNA staining for cell cycle or viability on a benchtop flow cytometer. J Immunol Methods. 275 (1-2), 113-121 (2003).

Tags

Immunologi decidua Dissociation Isolation Leukocytter myometrium Placenta Graviditet Uterus
Isolering af leukocytter fra det murine væv på maternel-føtal grænseflade
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arenas-Hernandez, M.,… More

Arenas-Hernandez, M., Sanchez-Rodriguez, E. N., Mial, T. N., Robertson, S. A., Gomez-Lopez, N. Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface. J. Vis. Exp. (99), e52866, doi:10.3791/52866 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter