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Immunology and Infection

Isolierung von Leukozyten aus dem Mausgeweben an der Maternal-Fetal-Schnittstelle

Published: May 21, 2015 doi: 10.3791/52866
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1,3,4
1Department of Obstetrics & Gynecology, Wayne State University School of Medicine, 2School of Paediatrics and Reproductive Health, Research Centre for Reproductive Health, the Robinson Research Institute, The University of Adelaide, 3Department of Immunology & Microbiology, Wayne State University School of Medicine, 4Perinatology Research Branch, NICHD/NIH/DHHS

Abstract

Immuntoleranz bei Schwangerschaft erfordert, dass das Immunsystem der Mutter erfährt Scheidungsänderungen, um zu akzeptieren und zu pflegen sich entwickelnden Fötus. Diese Toleranz wird während des Koitus eingeleitet, während der Befruchtung und Implantation gegründet und während der Schwangerschaft beibehalten wird. Aktive zellulären und molekularen Mediatoren von Mutter und Fötus Toleranz werden an der Stelle des Kontaktes zwischen fetalen und mütterlichen Gewebe, wie die Mutter und Fötus-Schnittstelle, die die Plazenta und die Gebärmutter und dezidualen Gewebe enthält bekannt bereichert. Diese Schnittstelle wird von Stromazellen und infiltrieren Leukozyten besteht, und deren Fülle und phänotypischen Eigenschaften im Laufe der Schwangerschaft zu ändern. Infiltrieren Leukozyten an der Mutter und Fötus-Schnittstelle umfassen Neutrophile, Makrophagen, dendritische Zellen, Mastzellen, T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen und NKT-Zellen, die zusammen das lokale Mikroumgebung, die Schwangerschaft aufrecht zu erstellen. Ein Ungleichgewicht zwischen diesen Zellen oder jede inappropriate Veränderung ihrer Phänotypen wird als ein Mechanismus der Erkrankung in der Schwangerschaft. Daher ist die Untersuchung der Leukozyten, die die Mutter und Fötus Schnittstelle infiltrieren wesentlich, um die Immunmechanismen, die schwangerschaftsbedingten Komplikationen aufzuklären. Hierin ist ein Protokoll, das eine Kombination von leichter mechanischer Dissoziation gefolgt von einem robusten enzymatische Zerlegung mit einem proteolytischen und kollagenolytischen Enzymcocktail, um die Infiltration von Leukozyten aus den Mäusegeweben an der mütterlich-fötalen Grenzfläche zu isolieren, verwendet. Dieses Protokoll ermöglicht die Isolierung der hohen Zahl von lebensfähigen Leukozyten (> 70%) mit einer ausreichend konservierten antigenen und funktionellen Eigenschaften. Isolierten Leukozyten können dann durch verschiedene Techniken, einschließlich Immunphänotypisierung Zellsortierung, Imaging, Immunoblotting-mRNA-Expression, Zellkultur und in vitro funktionelle Assays wie gemischte Leukozytenreaktionen, Proliferation oder Zytotoxizität Assays analysiert werden.

Introduction

Immuntoleranz bei Schwangerschaft ist eine Periode, in Scheidungs ​​Veränderungen im Immunsystem der Mutter erfolgen. Diese Änderungen ermöglichen die Mutter auf den Fötus, eine semi-allogenen Transplantats 1 zu tolerieren. Der Fötus drückt väterlichen Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) -Antigene 2 und fötalen Zellen im mütterlichen Kreislauf 3 gefunden worden ist; jedoch ist der Fötus nicht abgelehnt 4,5. Dieses Rätsel ist nicht vollständig geklärt.

Die jüngste Hypothese besagt, dass Mutter und Fötus Toleranz während des Koitus erstellt und Befruchtung und 6,7 gehalten, um eine volle Laufzeit der Schwangerschaft 8-10 erhalten. Eine Aufschlüsselung dieser Mutter und Fötus Toleranz wird in der frühen und späten Stadien der Schwangerschaft 10-16 als einen Mechanismus der Krankheit. Mutter und Fötus Toleranz beinhaltet die Mitwirkung der verschiedenen Leukozyten-Subpopulationen, einschließlich T-Zellen (regulatorische T-Zellen, Th1-Zellen, Th2-Zellen, und Th17-Zellen), macrophages, Neutrophilen, Mastzellen, NK-Zellen, NKT-Zellen, dendritische Zellen und B-Zellen, die Änderung in der Dichte und Lokalisierung während der Schwangerschaft 15,17-19. Der anatomischen Stelle, wo das Immunsystem der Mutter mit den fetalen Antigene 20,21 interagiert - Mutter und Fötus Toleranz wird am Mutter und Fötus-Schnittstelle 20 angereichert.

Die Mutter und Fötus-Schnittstelle wird während des Plazenta erstellt, wenn die fetalen extravillösen Trophoblastenzellen dringen in die Uterusschleimhaut 22-24. Auf der fetalen Seite dieser Schnittstelle, die Membranen den Fötus umgibt, schaffen eine spezialisierte Epitheloberfläche innerhalb der Plazenta und die Synzytiotrophoblasten Zellen steuern den Stoffaustausch durch ihre direkten Kontakt mit Blut der Mutter 22. Auf der mütterlichen Seite der Schnittstelle, rekrutiert die decidua einen heterogenen Pool von Leukozyten, die bei Mäusen verantwortlich für 30% bis 50% aller Deciduazellen. Zusätzlich zu ihrer Beteiligung an Maternal Immuntoleranz, diese Zellen sind wichtige Mitwirkende zu verschiedenen Prozessen während der Schwangerschaft, z. B. der Schutz der reproduktiven Fläche von Infektionen, Befruchtung, Embryoimplantation 7,25, dezidualen Angiogenese 26, vaskuläre Remodeling 24,27, Trophoblastinvasion 28, Plazenta Entwicklungs 24,25, und schließlich Arbeit und Lieferung 15,17. Daher ist die Untersuchung der Leukozyten in Mutter und Fötus Toleranz beteiligt wichtig, die Aufklärung der Pathogenese von Schwangerschaftskomplikationen.

Während die Verwendung von Immunhistochemie und Immunfluoreszenz wurden Daten für die direkte Visualisierung und Lokalisierung von Gebärmutter-, decidual oder Plazenta Leukozyten 29,30 erzeugt, Durchflusszytometrie-Analyse wurde weiterhin offenbart spezifische Untergruppen von Leukozyten, die in jedem dieser Gewebe 31,32. Zusätzlich Durchflusszytometrie verwendet worden, um die Dichte und den Anteil von mater bestimmennal-fetalen Schnittstelle Leukozyten 33 und Expression von extrazellulären und intrazellulären Proteinen 8-10,34. Durchflusszytometrische Analyse von Leukozyten an der Mutter und Fötus-Schnittstelle benötigt eine Einzelzellsuspension. Um infiltrieren Leukozyten aus dem dezidualen, Gebärmutter und Plazenta-Gewebe zu isolieren, zwei Methoden der Gewebedissoziation verwendet: mechanische und enzymatische. Beide Verfahren ermöglichen die Trennung von infiltrierten Leukocyten aus der extrazellulären Matrix (ECM) dieser Gewebe. Enzymatische Gewebedissoziation überlegen ist mechanischen Gewebedissoziation, da es eine höhere Ausbeute an Leukozyten mit geringer Scherkraft-verbundenen Schäden 35. Folglich mechanische Gewebedissoziation erfordert die Bündelung Gewebe 36, das die Variabilität und Heterogenität der Proben erhöhen kann. Dennoch können mechanische Dissoziation der Wahl sein, wenn das Antigen von Interesse kann durch enzymatische Spaltung oder geändert werden, wenn die Funktionalität der Zelles von Interesse bewahrt werden müssen (z. B. Cytotoxizität von NK-Zellen) 35.

Die Verwendung von Proteolyse mit spezifischen Enzymen, die ECM abbauen beseitigt die mechanische Dissoziation beobachtet geringe Ausbeuten. Mehrere Studien haben die Verwendung von Trypsin 32, Collagenase 37, DNase 31, Dispase 38 und kommerzielle Cocktails verschiedener Enzyme 32,39 gemeldet. Jedoch muß die Art und Konzentration der verschiedenen Enzyme und die Dauer der Verdauung genau definiert und um zur Aufrechterhaltung der Integrität der Zelloberfläche antigene Epitope zur Immunphänotypisierung erforderlich sicherzustellen, validiert werden. Die verschiedenen Oberflächenstrukturen sind unterschiedlich anfällig für Zerstörung durch verschiedene Enzyme, mit einigen Enzymen, wie Trypsin, wobei berüchtigt Strippen von vielen monoklonalen Antikörpern erkannt Leukozyten Oberflächenepitope.

Hierin eingeführt ist ein Verfahren unter Verwendung eines proteolytic und kollagenolytische Enzymcocktail, genannt Accutase. Diese enzymatische Lösung ist sanft genug, während immer noch effizienter in distanziert Mausgeweben an der Mutter und Fötus-Schnittstelle und erfordert nicht die Zugabe von anderen distanziert Reagenzien oder Serum, die Dissoziation Reaktion zu beenden. Darüber hinaus ist es gebrauchsfertig geliefert zu bedienen und, obwohl die Zeit der Dissoziation Annahmen validiert werden soll, ist robuster als die oben erwähnten Enzyme, 40,41.

Die Verwendung einer Kombination beider Arten von Gewebe-Disaggregation verbessert die Qualität und die Menge der Zellen erhalten wird; Daher haben mehrere Studien die kombinierte Verwendung von mechanischen und enzymatischen Spaltung mit befriedigenden Ergebnissen 31,32,37 implementiert. Das hier beschriebene Protokoll wurde eingerichtet und in unserem Labor validiert; Es verwendet eine Kombination eines leichten mechanischen Dissoziation gefolgt von einem robusten enzymatische Zerlegung. Dieses Protokoll ermöglicht die Isolierung und die weitere Untersuchung vondie Infiltration von Leukozyten in Mausgeweben an der Mutter und Fötus-Schnittstelle (Uterus, Dezidua und Plazenta). Das folgende Protokoll unterhält auch die Integrität der Zelloberflächenmarker und Ausbeuten genügend lebensfähige Zellen für nachfolgende Anwendungen wie durch durchflusszytometrische Analyse demonstriert. Schließlich dieses Protokoll erhält die Konsistenz der Zellpräparation für die Analyse und den Vergleich von verschiedenen Mausgeweben zu komponieren die Mutter und Fötus-Schnittstelle.

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Protocol

Vor der Arbeit mit den in diesem Protokoll genannten Proben müssen Tier ethische Genehmigung durch die lokalen Forschungsethikkommission und der Institutional Review Boards gegeben. Bei der Arbeit mit Tierblut, Zellen oder gefährliche Mittel, wie in diesem Protokoll erwähnt, müssen die richtige biologische Sicherheit und Laborsicherheitsmaßnahmen eingehalten werden.

1. Maus Handhabung und Gewebeentnahme

  1. Bereiten Sie eine sterile Arbeitsstation und erhalten sterile Werkzeuge für Gewebesammlung. Diese Werkzeuge sind große und kleine chirurgische Scheren, Pinzetten, und Feinspitze Pinzette. Umfassen kleine Petrischalen mit dem entsprechenden Gewebe-Namen versehen, mit 1 x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gefüllt (3-5 ml) auf Raumtemperatur äquilibriert (20-22 ° C). Auch eine große Petrischale, unbeschriftet, mit 1x PBS-Lösung gefüllt (10-15 ml).
  2. Euthanize einer schwangeren Maus (10,5 bis 19,0 Tage nach coitum (dpc) oder vor der Abgabe) unter Verwendung von Kohlendioxid (CO 2). Um sicherzustellen, dass die Maus getötet, verwenden Sie den Genickbruch-Technik.
    Hinweis: Vor 10,5 dpc, ist es schwierig, die Dezidua-Gewebe aus der Uterusgewebe von Hand zu trennen. Wenn die Isolierung der Dezidua-Leukozyten nicht erforderlich ist, Leukozyten aus den Uterusgewebe von nicht-schwangeren Mäusen oder von Mäusen, denen in <10,5 dpc kann auch über diesen Protokoll durchgeführt werden.
  3. Verwendung eines Paares von sterilen OP-Schere, die unteren Bauchteil der Haut und Muskelgewebe vollständig zu entfernen. Mit einer Pinzette, bewegen beiseite alle anderen Organe, bis die Gebärmutter und Eierstöcke sichtbar sind. Mit der Uterus noch angebracht, verwenden Sie die Zange, um sie außerhalb der Bauchhöhle (Abbildung 1A) zu bewegen.
  4. Suchen Sie die Eierstöcke distal der Eileiter und uterotubalen Verbindungs ​​jedes Uterushorn. Mit den kleinen chirurgischen Schere, einen Einschnitt an der uterotubalen Verbindungs ​​und trennen Sie die Gebärmutterhörner aus dem Mesenterium, die die Gebärmuttergefäße; dann,Verbrauch an der Cervix, die Gebärmutterhörner von der Peritonealhöhle (1B) zu lösen.
  5. Mit kleinen chirurgischen Schere, einen Einschnitt zwischen dem Gebärmutterhals und dem unteren Segment der Uterushörner. Leave befestigt einen Teil des Gebärmutterhalses während dieses Prozesses (1C), um zu vermeiden Öffnen des Uterushorns.
  6. Einzutauchen Uterushörner (einschließlich dem Gebärmutterhals) in einer großen Petrischale mit 1x PBS-Lösung gefüllt (10-15 ml), um die Implantationsstellen hydratisieren.
  7. Während noch in 1x PBS-Lösung eingetaucht, schneiden Sie Fett aus den Uterushörner mit den kleinen chirurgische Scheren. Halten Sie die in 1x PBS-Lösung in der gesamten Präparation eingetaucht Gewebe.
  8. Halten Sie die Gebärmutterhörner an Ort und Stelle mit der Zange, entfernen Sie eine der Implantationsstellen aus der Gebärmutter mit einem quer durch die inter-Implantationsbereich schneiden, mit den kleinen chirurgische Scheren (1D). Die Implantationsstelle enthält den Fötus durch die umgebenChorioallantoismembran und die uterine, Dezidua und Plazenta-Gewebe.
  9. Unter Verwendung der Zange, halten Sie die Website vorhanden und machen einen kleinen Schnitt in der Gebärmutterwand neben der Plazenta und Dezidua-Gewebe (1E). Ordnung um den Umfang der Plazenta / Dezidua bis diese sowohl von der Uteruswand und der Chorioallantoismembran dass der Fötus umfasst (1F) getrennt werden.
  10. Entfernen Sie die Plazenta und die angeschlossenen dezidualen Gewebe und in 1x PBS-Lösung (3-5 ml; siehe Schritt 1.12).
  11. Platzieren Sie den Fötus durch die Chorioallantoismembran den Uterusgeweben in einer Petrischale mit 1x PBS-Lösung gefüllt befestigt umgeben (3-5 ml). Die Hydratisierung von diesen Geweben wird die Trennung der Chorioallantoismembran von der Gebärmutterwand zu erleichtern (siehe Schritt 1.14).
  12. Verwendung eines Paares von Fein Spitze Pinzette, ziehen Sie vorsichtig die Decidua (weiß-grau-Schicht) aus der Plazenta Oberfläche. Führen Sie dieseSchritt sorgfältig, um die Integrität der Plazenta und Dezidua-Gewebe (1G) zu halten.
  13. Legen Sie die Plazenta und Dezidua-Gewebe in zwei separat markierten Gerichte Petri mit 1x PBS-Lösung gefüllt (3-5 ml jeweils).
  14. Entfernen Sie vorsichtig die Gebärmutterwand vom Chorioallantoismembran mit feinen Spitze Pinzette. Dies sind die Uterusgeweben.
  15. Legen Sie die uterine Gewebe in einer Petrischale mit 1x PBS-Lösung gefüllt (3-5 ml).
  16. Wiederholen Sie die Schritte 1.8 bis 1.15, bis alle Implantationsstellen verarbeitet worden sind.
  17. Sammeln Sie mehrere uterine, Dezidua und Plazenta-Gewebe, die Ausbeute an Zellen während enzymatische Verdauung zu verbessern. Die Menge an Gewebe ist abhängig von der Wurfgröße; aber Leukozyten Isolierung erfordert> 2 Stück Gewebe.
    Hinweis: Weitere detaillierte Informationen über die Präparation der Implantationsstellen auf verschiedenen Schwangerschafts Tage, sehen die Bilder in Kapitel zwei der Guide to Investigati gefundenauf der Maus 42 Schwangerschaft.

2. Uterine, Deziduale und Plazentagewebe Dissoziation

  1. Beschriften Sie mehrere sterile 2 ml konische Röhrchen mit dem entsprechenden Gewebe Namen, und legen Sie ein Fläschchen mit 1000 ul der Enzymlösung auf Eis.
  2. Aus der Petrischale mit 1x PBS-Lösung gefüllt ist, übertragen zwei Stücke (100 bis 150 mg) der Uterus, decidual oder Plazentageweben an eine markierte 2 ml konischen Röhrchen.
  3. Fügen Sie 500 ul kalten Enzymlösung in jedes 2 ml konischen Röhrchen.
  4. Mit feinen sterilen Schere, beginnen, um das Gewebe in der enzymatischen Lösung eingetaucht distanzieren, bis es fein zerkleinert wird. Mit der Zeit wird die Suspension ein milchiges Aussehen zu entwickeln. Dieser Schritt sollte mehr als 2 min nicht übersteigt, um Über Manipulation der Probe zu verhindern.
  5. Sobald das Gewebe wurde gespalten, fügen Sie eine zusätzliche 500 ul kalten enzymatische Lösung für das 2 ml konischen Röhrchen.
  6. Legen Sie die 2 ml konischen Röhrchen auf Eis.
  7. Die Schritte 2.2 bis 2.6 wobei jede einzelne Gewebe bis alle Gewebe verarbeitet worden sind.
  8. Übertragen Sie alle 2 ml konische Röhrchen mit homogenisierten Gewebe (zerkleinerte Gewebe + Enzymlösung) Proben aus dem Eis in einem Brutschrank bei 37 ° C und führen Sie eine sanfte orbitalen Schütteln (80 rpm). Inkubieren für 30 bis 35 min. Sicherzustellen, dass die Temperatur des Inkubators vor Beginn der Inkubationszeit wird stabilisiert.
  9. Nach der Inkubation, entfernen Sie die 2 ml konische Röhrchen mit dissoziierten Gewebe aus dem Inkubator und legen Sie sie auf Eis, um eine weitere Verdauung zu verhindern.
  10. Beschriften Sie sterile 50 ml konische Röhrchen nach Gewebetyp. Entfernen Sie den Deckel und ersetzen Sie sie mit einer sterilen Zellsieb (100 & mgr; m Porengröße).
  11. Gießen Sie die dissoziierten Gewebe aus den 2 ml konische Röhrchen durch die Zelle Sieb mit ~ 20 ml 1x PBS-Lösung. Die Gewebefragmente werden in der Zelle Sieb verbleiben und die Zellsuspension wird durch sie hindurch.
  12. Waschen Sie die dibestimungsbahnhof Gewebe im Zellsieb 2-3 Mal mit 20 ml 1x PBS-Lösung unter Verwendung einer Übertragungspipette.
  13. Spülen Sie die leeren 2 ml konische Röhrchen mit 1x PBS-Lösung (1 ml) und den Inhalt durch die Zellsiebe.
  14. Entfernen Sie die Zelle Siebe aus den 50 ml konische Röhrchen, und ersetzen Sie die Abdeckungen. Zentrifugieren der Röhrchen bei 1.250 × g für 10 min bei 4 ºC.
  15. Vorsichtig den Überstand aspirieren, ohne das Zellpellet zu stören. Das Zellpellet enthält die isolierten Leukozyten und Stromazellen.
  16. Resuspendieren das Zellpellet in 1 ml RPMI-Kulturmedium ohne fötales Rinderserum (FBS). Vorsichtig mischen. Verwenden Sie keine Wirbel.
  17. Fügen Sie 500 ul ordentlich FBS auf eine 5 ml Polystyrol-Kunststoffrohr und langsam überlagern die Zellsuspension.
  18. Zentrifuge für 10 min bei 1.100 × g ohne Bremse bei RT pelletiert lebensfähigen Zellen während Zelltrümmer im PBS / FBS-Schnittstelle erhalten bleiben.
  19. Den Überstand aspirieren, ohne den Zellpellet. Die cell Pellet enthält meist lebensfähigen Zellen.
  20. Optional: Um die mononuklearen Zellen zu konzentrieren, mit einem 20% igem gesättigtem Polysaccharidlösung, wie unten beschrieben.
    1. Zellpellet in 1000 ul RPMI Kulturmedium ohne FBS.
    2. 1 ml 20% gesättigte Polysaccharidlösung in ein 5 ml Polystyrolkunststoffrohr und langsam lagern die Zellsuspension auf die Oberseite dieser Lösung, entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Während Schichtung der Probe sollte das Mischen der 20% gesättigten Polysaccharidlösung mit der Zellsuspension.
    3. Zentrifuge mit einem Ausschwingrotor bei 500 xg für 30 min bei RT ohne Bremse. Es ist sehr wichtig, schalten Sie die Bremse, um zu vermeiden, indem die Zellen und verlieren den Gradienten. Mononuklearen Zellen werden in der Grenzfläche zwischen dem 20% gesättigte Polysaccharidlösung und 1x PBS-Lösung ermittelt werden.
    4. Absaugen und den Überstand verwerfen. Das Zellpellet enthält meist mononuklearen Zellen.
      Neinte: Um die Lebensfähigkeit Färbung und intrazelluläre Färbung durchzuführen, siehe Schritt 3. Um Immunphänotypisierung durchführen, finden Sie in Schritt 4. Um die Lebensfähigkeit Färbung und nur extrazelluläre Färbung durchzuführen, siehe Schritt 5. Um eine Zellkultur von isolierten Leukozyten durchführen, siehe Schritt 6. So führen magnetische Zellsortierung, siehe Schritt 7.

3. Viability Staining für Fixable Cells

  1. Zellpellet in 1100 ul 1x PBS-Lösung. Vorsichtig mischen unter Verwendung einer Mikropipette.
  2. Dann 100 ul der Zellsuspension in ein 5 ml Polystyrolkunststoffrohr. Fügen Sie 400 ul 1x PBS-Lösung in die 5 ml Polystyrolröhrchen. Dieses Rohr wird eine Steuerung zur Gewebeautofluoreszenz. Lagerung bei 4 ° C bis 3,5 Schritt.
  3. Übertragen Sie die restlichen 1.000 & mgr; l der Zellsuspension auf eine neue 5 ml Polystyrol-Kunststoffrohr. 1 ul der Lebensfähigkeit Farbstoff und schonend homogenisieren. Inkubation 30 min im Dunkeln bei 4 ° C.
  4. Nach der Inkubation hinzufügen 1000 & #181; l 1x PBS-Lösung. Vorsichtig mischen von Hand.
  5. Zentrifuge jeweils 5 ml Polystyrolkunststoffrohre (Schritte 3.2 und 3.3) bei 1250 × g für 10 min bei 4 ºC. Absaugen und den Überstand verwerfen.
    Hinweis: Das Zellpellet (Schritt 3.3), wird in Schritt 4 Das Zellpellet (Schritt 3.2) wird als eine Kontrolle für die Gewebeautofluoreszenz zu dienen.

4. Immunphänotypisierung

  1. Zellpellet in 50 ul Anti-Maus-CD16 / CD32 (verdünnt 1: 100 in FACS-Puffer [0,1% BSA, 0,05% Natriumazid, 1x PBS-Lösung, pH 7,4]). Mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig. Verwenden Sie nicht den Wirbel.
  2. Inkubieren der Zellsuspension in 5 ml Polystyrolröhrchen in der Dunkelheit bei 4 ° C für 10 min.
  3. Nach der Inkubation werden 50 ul jeder Anti-Leukozyten monoklonalen Antikörper reagieren mit extrazellulären Zelloberflächenmarker oder Isotyp-Kontroll-Antikörper (Antikörperverdünnungen müssen validiert werden). Zum Beispiel, um Leukozyten-Subpopulationen zu analysieren, verwenden Sie Anti-moverwenden Antikörper, die mit den folgenden Leukozyten Zelloberflächenmarker: CD45, Ly6G, F4 / 80, CD11c, CD49b, B220, CD3, CD4 und CD8 (Tabelle 1).
  4. Sobald Antikörper gegen extrazelluläre Marker auf die 5 ml Polystyrol-Kunststoffröhrchen hinzugefügt, vorsichtig mischen. Inkubieren in der Dunkelheit für 30 min bei 4 ° C.
  5. Während dieser Inkubation vorbereiten und pre-warm die Fixierung Pufferlösung (mit entionisiertem Wasser verdünnt, 1: 5) auf 37 ° C, falls erforderlich. Halten Sie den Puffer bei 37 ºC in der Finsternis, bis ihre Verwendung notwendig ist.
  6. Nach 30 min Inkubation, fügen 500 ul FACS Puffer in der 5 ml Polystyrol-Kunststoffrohr und vorsichtig mischen. Dieser Schritt ist notwendig, um die Zellen zu waschen und zu entfernen überschüssiges ungebundenes Antikörper.
  7. Zentrifugieren Sie die Probe bei 1250 × g bei 4 ° C für 10 min. Absaugen und den Überstand verwerfen.
    Hinweis: Wenn die intrazelluläre Färbung nicht erforderlich ist, siehe Schritt 5. Wenn die intrazelluläre Färbung erforderlich ist, führen Permeabilisierung und Intrazelldere Färbung hier, und dann mit der Fixierung (Schritt 4.8) fortfahren.
  8. Fügen Sie 500 ul der vorgewärmten Fixierung Pufferlösung zu dem Zellpellet und Inkubation im Dunkeln für 10 min bei 37 ºC.
  9. Dispense 500 ul FACS-Puffer in die 5 ml Polystyrol-Kunststoffrohr. Vorsichtig mischen.
  10. Zentrifugieren Sie die Probe bei 1250 × g bei 4 ° C für 10 min. Absaugen und den Überstand verwerfen.
  11. Gib 500 & mgr; l FACS-Puffer zu jeder Probe. Diese Proben können nun mittels Durchflusszytometrie analysiert werden. Erwerben Sie die Proben sofort für beste Ergebnisse.

5. Viability Staining für Nicht behebbarer Cells

  1. Nach dem extrazellulären Immunphänotypisierung, Zellpellet in 500 ul FACS Puffer.
  2. 1 & mgr; l 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid (DAPI, 200 ug / ml) kurz vor dem Erwerb der Probe.
  3. Visualisieren Sie die Proben in 1 - 2 min nach DAPI mit einem Durchflusszytometer.

  1. Bereiten Sie eine Workstation unter einem sterilen Abzug. Pre-warm das RPMI-Kulturmedium auf 37 ° C mit einem Wasserbad.
  2. Zellpellet in 1000 & mgr; l FACS-Puffer für die Zellzählung.
  3. Zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen unter Verwendung eines automatischen Zellzähler oder Hämozytometer und 0,4% Trypanblau-Lösung, nach den Anweisungen des Herstellers. Notieren Sie die Gesamtlebendzellzahl.
  4. Zentrifugation der Zellen bei 1250 × g bei 4 ° C für 10 min, um die FACS-Puffer zu entfernen.
  5. Zellpellet in 500 ul vorgewärmtem RPMI Kulturmedium durch vorsichtiges Pipettieren 2 bis 3 Mal.
  6. Platte die gewünschte Anzahl von Zellen in einer sterilen 24-Well-Platte und bei 37 ° C. Die Inkubationszeit wird von der Fragestellung bestimmt werden.

7. Magnetische Zellsortierung

  1. Richten Sie eine saubere Arbeitsstation mit den folgenden Stoffen: MS-Säulen, Magnet Zellseparator, 15ml konische Röhrchen 30 um Vortrennung Filtern und einem mehrgerüstigen.
  2. Zellpellet in 500 & mgr; l MACS-Puffer (0,5% BSA, 2 mM EDTA, 1 × PBS-Lösung, pH 7,2).
  3. Unter Verwendung eines automatischen Zellzähler oder Hämozytometer und 0,4% Trypanblau-Lösung, zu zählen und notieren Sie die Gesamtlebendzellzahl.
  4. Zentrifugieren der Zellen bei 1.250 × g bei 4 ° C für 10 min. Absaugen und den Überstand verwerfen. Fügen Sie eine weitere 500 ul MACS-Puffer.
  5. Fortfahren, die magnetische Trennung folgenden Empfehlungen des Herstellers durchzuführen.
  6. Bestimmen Sie die Reinheit mittels Durchflusszytometrie oder Mikroskopie.

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Representative Results

Die Präparation von Maus-Geweben von der mütterlich-fötalen Grenzfläche ist in Abbildung 1 gezeigt ist; Dieses Verfahren umfasst das Öffnen der Bauchhöhle (1A, B), Gebärmutterhörner (1C), die die Implantationsstellen (1D) und die Sammlung der Uterusgeweben (1E), Plazenta (1F) und Dezidua-Gewebe (1G) bei 16,5 dpc. 2 zeigt die Morphologie von isolierten Makrophagen (F4 / 80 +) aus Dezidua-und Uterusgeweben bei 16,5 dpc mittels magnetischer Zellsortierung gesammelt. Isolierten Makrophagen Aufrechterhaltung der Fähigkeit, Cytokine freisetzen (Daten nicht gezeigt). Die Ausbeute an lebensfähigen Zellen von der Decidua Uterus und Plazenta isoliert wird in Figur 3 gezeigt, und die Lebensfähigkeit der Zellen größer als 70% in allen Geweben. 4 zeigt die Gating-Strategie zur Analyse polymorphonucle ar und mononukleären Leukozyten in den Slips und Lebensfähigkeit Tore, einschließlich T-Zellen (CD45 + CD3 +), Neutrophile (CD45 + Ly6G +), Makrophagen (CD45 + F4 / 80 +), dendritische Zellen (CD45 + CD11c +) und NK-Zellen (CD45 + CD49b +) bei 16,5 dpc. Ein hoher Anteil an Makrophagen coexprimieren CD11c. 5 zeigt Neutrophile, Makrophagen und T-Zellen im decidual, Gebärmutter- und Plazentageweben bei 16,5 dpc. 6 zeigt die Gating-Strategie zur Analyse von Lymphozyten in den Singuletts und Lebensfähigkeit Tore, einschließlich T-Zellen (CD45 + CD3 +) und B-Zellen (CD45 + B220 +) bei 16,5 dpc. T-Zellen umfassen CD4 + und CD8 + T-Zellen. Mäusegewebe am mütterlich-fötalen Grenzfläche umfassen auch CD3 + CD4-CD8 (gamma-delta T-Zellen) in hohen Anteilen. 7 zeigt T-Zellen und B-Zellen im decidual, Gebärmutter- und Plazentageweben bei 16,5 dpc.

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Abbildung 1. Gewebedissektion. (A) Uterushörner bei 16,5 dpc in einer B6-Maus. Die Uterushörner sind mit dem Mesenterium und Entleeren Gefäße befestigt. (B) Uterushörner aus dem Mesenterium seziert und immer noch auf den Gebärmutterhals angebracht. (C) Uterushörner einschließlich der Implantationsstellen und des Gebärmutterhalses. (D) Präparation einer Implantationsstelle. (E) Präparation des Uterusgeweben von der Implantationsstelle. (F) Die Trennung der Plazenta und Dezidua von der Implantationsstelle. (G) Detachment der Decidua (weiß-grau-Schicht) aus der Plazenta. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Makrophagen isoliert von dezidualen und Gebärmuttergewebe. Makrophagen (F4 / 80 + Zellen) von den dezidualen und Gebärmuttergewebe mit 16,5 dpc mit magnetischen Zellsortierung isoliert. 20-facher Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Die Lebensfähigkeit der isolierten Zellen. Lebensfähige Zellen (Zellen mit DAPI- Pfeile dargestellt) aus dezidualen, Gebärmutter und Plazenta-Gewebe isoliert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 4. Gating-Strategie für polymorphkernige und mononukleären Leukozyten. Insgesamt Leukozytenpopulation wurde in den Slips und Lebensfähigkeit Tore gated. T-Zellen (CD45 + CD3 +), Makrophagen (CD45 + F4 / 80 +), Neutrophile (CD45 + Ly6G +), dendritische Zellen (CD45 + CD11c +) und NK-Zellen (CD45 + CD49b +) wurden in der gesamten Leukozyten-Gate torge ( CD45 +). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 5
Abbildung 5 Neutrophile, Makrophagen und T-Zellen in Mäusegeweben am maternofetalen Schnittstelle. Neutrophilen (CD45 + Ly6G +), Makrophagen (CD45 + F4 / 80 +) und T-Zellen (CD45 + CD3 +) wurden im Lebensfähigkeit gated und Gesamt-Leukozyten (CD45 +) Tore in isolierten dezidualen, Gebärmutter und Plazenta-Zellen.tps: //www.jove.com/files/ftp_upload/52866/52866fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6. Gating-Strategie für Lymphozyten. Mononukleäre Zellen wurden in den Slips und Lebensfähigkeit Tore gated. T-Zellen (CD3 +) und B-Zellen (B220 +) wurden innerhalb der Lebensfähigkeit Gate torge. CD4 + und CD8 + T-Zellen wurden in der T-Zell-Gate (CD3 +) gated. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 7
Abbildung 7. Lymphozyten-Subpopulationen in Mausgeweben an der Mutter und Fötus-Schnittstelle. T-Zellen (CD3 +)und B-Zellen (B220 +) wurden innerhalb der Lebensfähigkeit Tor in isolierten dezidualen, Gebärmutter und Plazentazellen gated. CD4 + und CD8 + T-Zellen wurden in der T-Zell-Gate (CD3 +) gated. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Zellmarker Fluorochrom Klon Unternehmen Katalog-Zahl
LIVE / DEAD DAPI - Life Technologies L23105
CD45 V450 30-F11 BD Biosciences 560.501
CD3 FITC 145-2C11 BD Biosciences 553.062
CD4 APC RM4-5 BD Biosciences 553.051
CD8 PE-CF594 53-6,7 BD Biosciences 562.283
B220 APC-Cy7 RA3-6B2 BD Biosciences 552.094
F4 / 80 PE BM8 eBiosciences 12-4801-82
Ly6G APC-Cy7 1A8 BD Biosciences 560.600
CD49b APC DX5 BD Biosciences 560.628
CD11c PE-Cy7 HL3 BD Biosciences 558.079

Tabelle 1. Liste der Antikörper für Leukozyten-Untermenge verwendet Immunphänotypisierung

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Discussion

Die einheitliche Datenerhebung, die die Fülle und phänotypischen Eigenschaften der infiltrierenden Leukozyten an der Mutter und Fötus-Schnittstelle zeichnet ist wesentlich für das Verständnis der Pathogenese von Schwangerschaftskomplikationen. Verschiedene Techniken wurden beschrieben, dass die Isolierung der infiltrierenden Leukozyten aus den Mäusegeweben am mütterlich-fötalen Grenzfläche während der gesamten Schwangerschaft 31,38,39,43-46 erleichtern. Aber jede Technik unterschiedlich ist, verwendet verschiedene Enzyme oder Enzymkombinationen, erfordert unterschiedliche Dissoziation Zeiten nicht Gewebemengen angeben, und, was am wichtigsten ist, ist nicht immer die Lebensfähigkeit der isolierten Zellen angeben. Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Isolierung von infiltrierenden Leukozyten aus den Mausgeweben an der Mutter und Fötus-Schnittstelle mit hoher Tragfähigkeit und bietet detaillierte Informationen über die kommerziellen Reagenzien, Pufferherstellung, Gewebe Mengen und Inkubationszeiten in das validierteLabor.

Einer der wichtigsten Schritte des Leukocyten Isolierungsverfahren ist die Gewebedissoziation; dieser Schritt das mechanische Homogenisierung und / oder enzymatische Reaktionen, die die Integrität der extrazellulären Proteine ​​in phänotypische Charakterisierung 47 verwendet verändern kann. Das hierin beschriebene Protokoll bietet einen neuen Ansatz, der die Verwendung von sanften mechanischen und enzymatischen Gewebedissoziation Techniken kombiniert, um die Integrität der extrazellulären Marker in den Leukozyten aus der Plazenta und dezidualen und Uterusgewebe von Mäusen isoliert bewahren.

Einzel Enzymen und Kombinationen von verschiedenen Enzymen verwendet worden, der auf die Infiltration von Leukozyten aus den Mäusegeweben an der mütterlich-fötalen Grenzfläche 31,32,39,44 isolieren. In vielen Fällen können diese Enzyme, die an bestimmte Konzentrationen von Hand im Labor hergestellt werden, unterliegt menschlichen Fehlern sein. Hier stattdessen eine ready-to-use gereinigte Collagenase / neutral protLeichtigkeit-Cocktail, Accutase hat im Labor durchgeführt wurden; Als im Handel erhältliche Enzymzubereitung wurde gezeigt, um zuverlässige Ergebnisse in der Zellkultur 48 bereitzustellen. Diese Enzymlösung ist bekannt, Makrophagen aus den Kulturplatten effektiv abzulösen ohne Kratzen und, am wichtigsten, ohne dabei Oberflächenantigene 48. Diese vorbereitete Enzym wurde auch verwendet, um die Verdauung des menschlichen und tierischen Geweben des Nervensystems zu verarbeiten, was zu einem lebensfähigen isolierten Zellen, die eine nachhaltige bleiben für längere Zeit, was die anschließende Kultur 47 ermöglicht. Darüber hinaus diese Enzymlösung bewahrt CD24 Antigenität in isolierten Zellen aus Geweben des zentralen Nervensystems 47. Wann Liberase-1, einem anderen Cocktail aus Kollagenase und neutraler Protease, weder Accutase noch Liberase-1 zu generieren freien DNA-Aggregate im Vergleich; jedoch Accutase sanfter als Liberase-1 während Gewebedissoziation 47. Die Collagenase / neutrale Protease Cocktail in diesem Protokoll verwendet wurde ebenfalls gezeigt Überlegenheit Trypsin bei der Konservierung von CD44, einem Krebsstammzelloberflächenmarker 49. Studien dieses Labor haben konsequent darauf hingewiesen, dass diese Enzymlösung bewahrt Maus Leukozyten-Oberflächenantigene. Tatsächlich haben informative Unterschiede in der Expression von extrazellulärer Marker in Makrophagen gefunden (CD11b + F4 / 80 + -Zellen), Neutrophile (CD11b + Ly6G + Zellen), NKT-Zellen (CD3 + CD49b + Zellen), T-Zellen (CD3 + -Zellen) und B Zellen (B220 + CD19 + Zellen), einschließlich CD4, CD8, CD69, CD25, CD40L, PD1, CD44, CD62L und CTLA4 und in Zytokin-Freisetzung. Daher ist das hier beschriebene Verfahren optimal für Immunphänotypisierung der infiltrierenden Leukozyten an der mütterlich-fötalen Grenzfläche in Mäusen, wie in den repräsentativen Ergebnissen gezeigt.

Ein wichtiger Vorteil dieses Verfahrens ist die simultane Bestimmung von mehreren extrazellulären und intrazellulären Antigenen im Lebensfähigkeit Gate. Der Farbstoff meisten pflegte,termine Zelllebensfähigkeit ist Propidiumiodid (PI); Jedoch ist ihre Verwendung begrenzt, da sie nur in Verbindung mit FITC verwendet werden. Dies liegt daran, PI nicht ausreichend von den meisten anderen Fluorochromen von blauen und roten Laser 50 angeregt unterscheiden. Eine Lösung ist es, DAPI 50 oder jede andere Farbstoff, der durch UV-Laser, aber nicht von blauen und roten Laser verwendet, die üblicherweise für Immunphänotypisierung angeregt wird verwenden. Dieses Protokoll ermöglicht Immunphänotypisierung von lebensfähigen Zellen, wie es die Verwendung von DAPI 50 zum unfixable Zellen oder die Verwendung der Lebensfähigkeit Farbstoff zur fixierbaren Zellen.

Ein zweiter wichtiger Vorteil des hierin beschriebenen Protokolls ist, dass es die Isolierung von Leukozyten mit einer hohen Ausbeute an lebensfähigen Zellen. Der repräsentative Daten zeigen, dass 70% bis 89% der isolierten Zellen lebensfähig sind. Dies ist von großer Bedeutung, da dieses Protokoll hat das Studium der funktionellen Eigenschaften der isolierten Zellen aus Mausgeweben an der Mutter und Fötus-Schnittstelle erlaubt. Foder beispielsweise Kulturen der Dezidua und Gebärmutter Makrophagen und das Studium der Zytokin-Freisetzung unter Stimulation durchgeführt wurden mit dieser Methode.

Um erfolgreiche Ergebnisse zu erzielen, ist die Anwendung des beschriebenen Protokolls wichtig, wenn man die folgenden Faktoren: 1) Gewebe Sammlung muss innerhalb von 5 bis 10 Minuten nach dem Öffnen der Bauchhöhle durchgeführt werden und diese Gewebe muss auf Eis gelegt werden, um die Lebensfähigkeit zu erhalten Die isolierten Zellen; 2) mechanische Gewebehomogenisierung muss mit Feinspitze Schere durchgeführt werden und ist für 2 min seit längere Zeit wurde gezeigt, dass die Ausbeute an lebensfähigen Zellen zu reduzieren nicht übersteigt; 3) die Dauer der Inkubation mit dem Enzymlösung muß weniger als 1 Stunde, da seine Aktivität vermindert nach dieser Zeitperiode; 4) die Temperatur der Inkubation mit der enzymatischen Lösung ist bei 37 ° C gehalten, um die optimale Aktivität dieser Cocktail von Enzymen zu erhalten; 5) Zellpellet manipulation muss vorsichtig mit Mikropipetten durchgeführt, da die Verwendung des Wirbels können die Integrität der Zellen (isolierte Zellen differenziert und abrupten Manipulation kann ihre Lebensfähigkeit leicht zu reduzieren) zu beschädigen; 6) Puffer und Zentrifuge Temperaturen müssen die gleiche Temperatur wie die Zellsuspension gehalten werden; 7) isolierten Zellen müssen für Immunphänotypisierung verarbeitet oder sofort verwendet werden, wie ihre Lebensfähigkeit reduziert rasch; und 8) bei der Durchführung Immunphänotypisierung Proben müssen unter Verwendung eines Durchflusszytometers sofort für die besten Ergebnisse erhalten werden.

Eine Einschränkung dieses Protokolls ist die Kosten der Enzymlösung, die teurer als andere Enzyme mit ähnlichen Funktionen, beispielsweise Trypsin, Dispase II und Kollagenase. Jedoch sind die Vorteile, die diese enzymatische Lösung die über die beschriebenen Enzyme zeigt überlegen.

Neben Immunphänotypisierung und Zellkultur und das Sortieren, die zukünftige Anwendungen dieses Protokolls sind numerous und abwechslungsreich. Beispielsweise ist es nun möglich, die DNA-Methylierung, die Expression von Zielgenen, in vitro Leukozyten Funktionalität (zB Phagozytose, Zytotoxizität, T-Zell-Proliferation und Plastizität Assays, etc.), und die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies in den Leukozyten isoliert wurden aus Mausgeweben bei den mütterlichen fetalen Schnittstelle. In der Tat kann Beschreibung der neuen und seltenen Leukozyten in Mausgeweben an der Mutter und Fötus-Schnittstelle auch durchgeführt werden.

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Disclosures

Die Autoren offenbaren keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

NGL wurde von der Wayne State University in Perinatal Initiative von Müttern, Perinatal and Child Health. Wir danken Maureen McGerty und Amy E. Furcron (Wayne State University) für die kritische Durchsicht des Manuskripts.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Magentic Cell Separation
MS Columns Militenyi Biotec 130-042-201
Cell Separator Militenyi Biotec 130-042-102
30 μm pre-separation filters Militenyi Biotec 130-041-407
Multistand Militenyi Biotec 130-042-303
15 ml conical tubes Thermo Fisher 339650
MACS Buffer Militenyi Biotec Laboratory preparation (0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1x PBS, pH 7.2)
Reagents
Accutase enzymatic solution Life Technologies A11105-01
Anti-mouse CD16/CD32 BD Biosciences 533142
Anti-mouse extracellular antibodies BD Bioscences/eBiosciences Table 1
Sodium azide Fisher S227-500
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7906-100G
LIVE/DEAD viability dye Life Technologies L23105
Fixation buffer solution BD Biosciences 558049
FACS Buffer BD Biosciences Laboratory preparation 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 1x PBS, pH 7.4
Trypan blue solution 0.4% BIO-RAD 145-0013
Fetal bovine serum (FBS) Life Technologies 16000-044
Additional Instruments
Incubator with shaker Thermo Scientific MaxQ 4450
Flow cytometer BD LSRFortessa
Centrifuge Thermo Scientific Legend LXTR
Vacuum system laboratory constructed
Incubator Thermo Scientific Incubator 3307
Water bath Precision 51221035
Cell counter BIO-RAD TC20 Automated Cell Counter
Optical and fluorescence microscopes Zeiss and Olympus Zeiss LSM780 and Olympus CKX41

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Isolierung von Leukozyten aus dem Mausgeweben an der Maternal-Fetal-Schnittstelle
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Arenas-Hernandez, M., Sanchez-Rodriguez, E. N., Mial, T. N., Robertson, S. A., Gomez-Lopez, N. Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface. J. Vis. Exp. (99), e52866, doi:10.3791/52866 (2015).

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