Abstract
임신에서 면역 관용은 어머니의 면역 체계가 현상 태아에 동의하고 육성하기 위해 특유의 변화를 겪는 것을 요구한다. 이 허용 오차는 성교시에 시작 Fecundation는과 주입 중 설립, 임신 동안 유지된다. 산모 - 태아 관용의 활성 세포 및 분자 매개은 태반과 자궁과 탈락 막 조직을 포함하는 산모 - 태아 인터페이스로 알려진 태아와 산모의 조직 사이의 접촉의 사이트에 충실. 이 인터페이스는, 기질 세포 및 백혈구 침윤으로 구성되고, 그 표현형 풍부하고 임신에 걸쳐 변화. 모체 - 태아의 계면에 침투 백혈구 함께 임신 지탱 로컬 미세 환경을 만들 호중구, 대 식세포, 수지상 세포, 비만 세포, T 세포, B 세포, NK 세포, 및 NKT 세포를 포함한다. 이 세포 또는 inapprop 간의 불균형자신의 표현형에 riate 변경은 임신 질병의 메커니즘을 고려된다. 따라서, 산모 - 태아 인터페이스를 침투 백혈구의 연구는 임신 관련 합병증으로 이어질 면역 메커니즘을 규명하기 위해 필수적이다. 본원에 기재된 단백질 분해 및 모체 - 태아의 계면에서 뮤린 조직으로부터 침윤 백혈구를 분리 collagenolytic 효소 칵테일 강력한 효소 세분화이어서 부드러운 기계적 해리의 조합을 사용하는 프로토콜이다. 이 프로토콜은 충분히 보존 항원 및 기능적 특성을 가진 가능한 백혈구 (> 70 %)의 높은 숫자의 분리 수 있습니다. 격리 백혈구이어서 면역 표현형, 세포 분류, 영상화, 면역, mRNA 발현, 세포 배양, 및 혼합 백혈구 반응, 증식 또는 세포 독성 분석 시험 관내 기능 분석 등을 포함한 몇 가지 기술에 의해 분석 될 수있다.
Introduction
특징적인 변화가 어머니의 면역 시스템 내에서 발생하는 경우 임신 면역 관용은 기간입니다. 이러한 변화는 어머니가 태아, 반 동종 이식 (1)을 허용 할 수 있습니다. 태아는 아버지의 주요 조직 적합성 복합체 (MHC)는 항원이, 태아 세포가 모체 순환 3에서 발견 된 표현; 그러나 태아는 4,5를 거부하지 않습니다. 이 수수께끼는 완전히 이해되지 않습니다.
가장 최근의 가설은 산모 - 태아의 허용 오차가 성교 중에 생성 및 6,7 Fecundation는과 만삭 임신 8 ~ 10을 유지하기 위해 유지되는 것을 말한다. 이 산모 - 태아 관용의 고장은 임신 10-16의 초기와 후기 단계에서 질병의 메커니즘을 고려된다. 모체 - 태아의 공차는 T 세포 (T 조절 세포, Th1 세포, TH2 세포와 Th17 세포), MAC 등 다양한 백혈구 하위 집단의 참여를 수반rophages, 호중구, 비만 세포, NK 세포, 및 NKT 세포, 수지상 세포 및 B 세포, 임신 15,17-19 걸쳐 밀도 및 위치 파악에 그 변화. 어머니의 면역 체계가 태아 항원 (20, 21)와 상호 작용하는 해부학 사이트 - 산모 - 태아의 허용 오차는 산모 - 태아 인터페이스 (20)에서 농축된다.
태아 extravillous 영양막 세포가 자궁 점막 22-24를 침공 할 때 산모 - 태아 인터페이스는 태반 중에 작성됩니다. 이 인터페이스의 태아 측면에서, 태아를 둘러싸고있는 막은 태반 내에서 전문 상피 표면을 생성하고, 융합 세포의 세포는 산모의 혈액 (22)과의 직접 접촉을 통해 영양 교환을 제어 할 수 있습니다. 인터페이스의 모체 측에서 탈락은 모든 마우스에서 탈락 막 세포의 50 %로 30 %를 차지하고 백혈구 이종 풀을 모집. matern에 참여하는 것 외에도알 면역 관용,이 세포는 임신 기간 동안 다른 프로세스, 예., 감염, Fecundation는에서 생식 기관의 보호, 배아 이식 7,25, 탈락 혈관 신생 (26), 혈관 재 24,27, 영양막 세포 침윤 (28), 태반의 핵심 기여자입니다 개발 24, 25, 및, 궁극적으로, 노동 및 배달 15,17. 따라서, 산모 - 태아 내성에 관여하는 백혈구의 연구는 임신 관련 합병증의 발병 기전을 해명하는 것이 필수적입니다.
면역 조직 화학 염색 및 면역 형광의 사용이 직접 시각화 및 자궁, 탈락, 또는 태반 백혈구 (29, 30)의 국산화에 대한 데이터를 생성하고 있지만, 더 이러한 조직 (31, 32)의 각각에 백혈구의 특정 부분 집합을 밝혔다 분석 유동 세포 계측법. 또한 계측법 밀도 메이터의 비율을 결정하기 위해 사용되어왔다 흐름NAL-태아 인터페이스는 세포와 세포 내 단백질 8-10,34 33과 표현 수준을 백혈구. 모체 - 태아의 계면에서 백혈구 세포 계측 분석 흐름은 단일 세포 현탁액을 필요로한다. 탈락, 자궁, 태반 조직으로부터 침윤 백혈구를 분리하기 위해, 티슈 해리의 두 가지 방법이 사용되고있다 : 기계적 및 효소. 두 가지 방법이 조직의 세포 외 기질 (ECM)에서 침투 백혈구의 분리를 할 수 있습니다. 덜 전단력 - 관련 손상 (35) 백혈구의 높은 수율을 허용하는 조직 분해 효소는 조직 기계적 해리 우수하다. 따라서, 기계적 해리 티슈 샘플의 가변성 및 이질성 조직을 증가시킬 수있다 (36)를 필요로 풀링. 그러나, 기계적 해리 관심 항원 또는 효소 분해에 의해 변경 될 때 때 선택이 세포의 기능관심의 필요의 보존되는 (예., NK 세포의 세포 독성) 35.
ECM을 저하 특정 단백질 분해 효소의 사용은 기계적 해리 관찰 저수율을 제거한다. 여러 연구 트립신 (32), 콜라게나 제 (37)의 DNase (31), (38) 디스 파제, 각종 효소 32,39의 상업 칵테일의 사용 신고되었습니다. 그러나, 자연 및 다른 효소의 농도 및 분해 기간 꼼꼼하게 정의 면역 표현형에 필요한 세포 표면 항원 성 에피토프의 무결성의 유지를 보장하기 위해 검증되어야한다. 다양한 표면 구조는 다수의 단일 클론 항체에 의해 인식 백혈구 표면 에피토프 스트리핑 악명되고, 트립신과 같은 일부 효소와 다른 효소에 의해 파괴 차분 쉽다.
본원에 도입 proteolyt를 사용하는 방법이다Accutase라고 IC와 collagenolytic 효소 칵테일. 이 효소 용액을 충분히 모체 - 태아의 계면에서 해리 뮤린 조직 내 여전히 효율적으로 완만하고, 해리 반응을 정지 해리 다른 시약 또는 혈청의 첨가를 필요로하지 않는다. 해리 시간을 검증 할 필요가 있지만, 또한, 그것은 전술 한 효소 40,41보다 더 강력, 공급로 사용할 준비하고.
조직 세분화 두 유형의 조합의 이용은 얻어지는 전지의 품질과 양을 향상시킨다; 따라서, 여러 연구 결과는 만족할 31,32,37와 기계적 및 효소 적 분해의 병용을 시행하고있다. 여기에 설명 된 프로토콜은 설립 우리의 실험실에서 검증되었다 이것은 강력한 효소 세분화이어서 부드러운 기계적 해리의 조합을 사용한다. 이 프로토콜은의 고립과 더 많은 연구를 할 수 있습니다산모 - 태아 인터페이스에서 쥐의 조직에 침투 백혈구 (자궁, 탈락 및 태반). 유세포 분석에 의해 입증 된 바와 같이 다음과 같은 프로토콜은 세포 표면 마커 및 하류 어플리케이션에 충분한 수율을 생세포의 무결성을 유지한다. 마지막으로,이 프로토콜은 분석 모체 - 태아의 인터페이스를 구성하는 다른 뮤린 조직의 비교 세포 제제의 일관성을 유지한다.
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Protocol
이 프로토콜에 언급 된 샘플 작업을 시작하기 전에, 동물의 윤리적 인 승인은 지역 연구 윤리위원회와 윤리 심의 보드에 의해 제공되어야합니다. 동물의 혈액, 세포, 또는이 프로토콜에 언급 된 유해 에이전트와 작업 할 때, 적절한 바이오 안전성 및 실험실 안전 조치가 따라야합니다.
1. 마우스의 취급 및 조직 컬렉션
- 멸균 워크 스테이션을 준비하고 조직 수집을 위해 멸균 도구를 얻을 수 있습니다. 이러한 도구는 크고 작은 수술 가위, 집게, 미세 팁 핀셋 포함됩니다. (- 22 ° C (20))을 실온으로 평형 - (5 ㎖ 3) 1X 인산염 완충 식염수 (PBS) 용액으로 채워져 적절한 조직 이름으로 표시된 작은 페트리 접시를 포함합니다. (- 15 ml의 10) 또한 1X PBS 용액으로 가득 레이블이없는 큰 페트리 접시를 포함한다.
- 임신 한 마우스를 안락사 (10.5-19.0 일 후 교미 (DPC) 또는 인도하기 전에) 이산화탄소를 사용하여 (CO 2). 마우스를 안락사되는 것을 보장하기 위해, 자궁 경부 전위 기술을 사용합니다.
주 : 10.5 DPC에 앞서 수동 자궁 조직으로부터 탈락 조직을 분리하는 것이 곤란하다. 탈락 백혈구의 분리가 필요하지 않은 경우, 자궁 비 임신 한 쥐의 조직 또는 마우스의 것과 백혈구 <10.5 DPC는이 프로토콜에 따라 수행 될 수있다. - 멸균 된 수술 용 가위를 이용하여 완전히 피부 조직과 근육의 하복부 부분을 제거한다. 집게로, 자궁까지 따로 다른 모든 장기를 이동하고 난소 볼 수 있습니다. 자궁이 여전히 부착으로, 복강 (그림 1A)의 외부로 이동하는 집게를 사용합니다.
- 각 자궁의 난관과 - 자궁 접합에 말단 난소를 찾습니다. 작은 수술 가위를 사용하면, - 자궁 접합에 절개를하고 자궁 혈관을 포함하는 장간막에서 자궁 뿔을 분리; 다음,자궁 경부에서 소비세는 복강 (그림 1B)에서 자궁 뿔을 분리합니다.
- 작은 수술 가위, 자궁 경부와 자궁 뿔의 낮은 세그먼트 사이에 절개를합니다. 휴가는 자궁 경적을 열지 않도록이 프로세스 (그림 1C) 중 자궁 경부의 일부를 부착.
- 주입 사이트를 수화 - (15 ml의 10) 1X PBS 용액으로 채워진 큰 페트리 접시에 (자궁 경부 포함) 자궁 뿔을 담가.
- 여전히 1X PBS 용액에 침지하는 동안, 작은 수술 가위로 자궁 뿔에서 모든 지방을 손질. 해부를 통해 1X PBS 용액에 침지 조직을 유지합니다.
- 집게와 장소에 자궁 뿔을 잡고 작은 수술 가위 (그림 1D)를 사용하여, 간 이식 영역을 통해 잘라 가로와 자궁에서 착상 사이트 중 하나를 제거합니다. 이식 장소는 둘러싸인 태아를 포함융모 막과 자궁, 탈락, 태반 조직.
- 집게를 사용하여, 장소에 사이트를 누른 상태에서 태반과 탈락 막 조직 (그림 1E)에 인접한 자궁 벽에 작은 절개를합니다. 이러한 자궁 벽과 태아를 포함 융모 막 (그림 1 층)에서 모두 분리 될 때까지 태반 / 탈락의 둘레 낸다.
- 1X PBS 용액에 태반과 연결된 탈락 조직과 장소를 제거합니다 (3-5 ml의 단계 1.12 참조).
- (- 5 ml의 3) 1X PBS 용액으로 가득 페트리 접시에 자궁 조직에 부착 된 융모 막으로 둘러싸인 태아를 놓습니다. 이들 조직의 수화 자궁벽에서 융모의 막 분리를 용이하게한다 (단계 1.14 참조).
- 미세 팁 핀셋을 사용하여 부드럽게 태반 표면에서 탈락 조직 (흰색 - 회색 층) 껍질. 이 작업을 수행태반과 탈락 막 조직 (그림 1G)의 무결성을 유지하기 위해 신중하게 단계.
- (- 5 mL 씩 3) 1X PBS 용액으로 가득이 별도로 표시 페트리 접시에서 태반과 탈락 막 조직을 놓습니다.
- 부드럽게 잘 팁 핀셋 융모 막에서 자궁 벽을 제거합니다. 이러한 자궁 조직이다.
- (- 5 ml의 3) 1X PBS 용액으로 가득 페트리 접시에 자궁 조직을 놓습니다.
- 모든 주입 사이트가 처리 될 때까지 반복 1.15 통해 1.8 단계를 반복합니다.
- 효소 소화시 세포의 수율을 향상시키기 위해 여러 자궁, 탈락, 및 태반 조직을 수집. 조직의 양은 쓰레기 크기에 따라 달라집니다; 그러나, 백혈구 분리는 조직의> 2 개를 필요로한다.
참고 : 다른 임신 일에 주입 사이트의 해부에 대한 자세한 내용은 Investigati에 안내서의 제 2 장에서 볼 수있는 사진을 볼마우스 임신 42에.
2. 자궁, 탈락 및 태반 조직 해리
- 해당 조직의 이름으로 여러 멸균 2 ml의에게 원뿔 튜브 레이블 및 얼음에 효소 솔루션의 1000 μL와 유리 병을 배치합니다.
- 레이블이 2 ML 원뿔 튜브에 자궁, 탈락, 또는 태반 조직의 - (150 mg을 100) 1X PBS 용액으로 가득 페트리 접시에서 두 가지를 전송합니다.
- 각 2 ML 원뿔 관에 찬 효소 용액 500 μl를 추가합니다.
- 미세 멸균 가위, 잘게 다진이 될 때까지의 효소 용액에 침지하여 직물을 해리하기 시작한다. 시간이 지남에 따라 서스펜션은 우유 모양을 개발할 것입니다. 이 단계는 샘플의 오버 조작을 방지하기 위해 2 개 이상의 분을 초과하지 않아야한다.
- 조직이 분해되면, 2 ML 원뿔 튜브에 감기 효소 솔루션의 추가 500 μl를 추가합니다.
- 얼음에 2 ML 원뿔 튜브를 놓습니다.
- 모든 조직이 처리 될 때까지 반복하여 각각의 조직과 2.6을 통해 2.2 단계를 반복합니다.
- 37 ºC에서 인큐베이터에 얼음에서 균질 조직 (다진 조직 + 효소 용액) 샘플 모든 2 ml의에게 원뿔 튜브를 전송하고 부드러운 궤도 교반 (80 RPM)을 수행합니다. 35 분 - 30 품어. 인큐베이터의 온도가 배양 시간을 시작하기 전에 안정되어 있는지 확인합니다.
- 배양 후, 인큐베이터에서 해리 조직에 2 ml의에게 원뿔 튜브를 제거하고 더 소화를 방지하기 위해 얼음에 배치합니다.
- 조직의 종류에 따라 멸균 50 ML 원뿔 튜브 레이블. 뚜껑을 제거하고 살균 셀 스트레이너 (100 μm의 기공 크기)로 교체.
- ~ 1X PBS 용액 20 ㎖를 셀 스트레이너 원추형 튜브를 통해 사용이 용액에서 해리 된 조직을 붓는다. 조직 단편을 세포 여과기에 남아 및 세포 현탁액을 통과한다.
- 디 워시셀 스트레이너에 지을 조직 2 - 전달 피펫을 사용하여 1X PBS 용액 20 ㎖로 3 회.
- 2ml의 빈을 1X PBS 용액 (1 mL)로 원추형 튜브 헹구고 셀 스트레이너를 통해 내용을 붓는다.
- 50 ML 원뿔 튜브에서 셀 스트레이너를 제거하고 덮개를 교체합니다. 4 ºC에서 10 분 동안 1,250 XG에서 튜브를 원심 분리기.
- 조심스럽게 세포 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 대기음. 세포 펠렛은 고립 된 백혈구와 기질 세포가 포함되어 있습니다.
- 소 태아 혈청 (FBS)없이 RPMI 배지 1 ㎖의 세포 펠렛을 다시 일시. 부드럽게 섞는다. 소용돌이를 사용하지 마십시오.
- 5 ml의 폴리스티렌 플라스틱 튜브에 깔끔한 FBS 500 μl를 추가하고 천천히 세포 현탁액을 오버레이.
- 세포 파편이 PBS / FBS 인터페이스에서 유지되는 동안 실온에서 브레이크없이 1,100 XG에 10 분 동안 원심 분리기가 가능한 세포 펠렛합니다.
- 세포 펠렛을 건드리지 않고 뜨는을 대기음. CELL 펠릿은 대부분 가능한 세포가 포함되어 있습니다.
- 선택적으로, 아래에 기술 된 바와 같이 단핵 세포를 농축하기 위해, 20 % 포화 폴리 사카 라이드 용액을 사용한다.
- FBS없이 RPMI 배지 1000 μL에서 세포 펠렛을 재현 탁.
- 제조업체의 지시에 따라, 5 ml의 폴리스티렌 플라스틱 튜브에 20 % 포화 된 다당류 용액 1 ㎖를 천천히 첨가하고,이 용액의 상부에 세포 현탁액을 오버레이. 시료를 적층하는 동안, 세포 현탁액으로 20 % 포화 폴리 사카 라이드 용액을 혼합 피한다.
- 브레이크없이 실온에서 30 분 동안 500 XG에 스윙 아웃 로터와 원심 분리기. 그것은 세포를 혼합 그라데이션 손실을 방지하기 위해 브레이크를 해제하는 것이 매우 중요합니다. 단핵 세포를 20 % 포화 용액 및 다당류 1X PBS 용액 사이의 계면에서 발견 될 것이다.
- 기음과 상층 액을 버린다. 세포 펠렛은 주로 단핵 세포가 포함되어 있습니다.
아니테가 : 수행하려면 6 단계를 참조 고립 된 백혈구의 세포 배양을 수행하려면 5 단계를 참조 생존 염색 단지 세포 염색을 수행하려면 4 단계를 참조하십시오, 모두 면역을 수행하려면 3 단계를 참조 생존 염색 및 세포 내 염색을 수행하려면 자기 세포 분류는 7 단계를 참조하십시오.
고칠 수 세포 3. 생존 염색
- 1X PBS 용액 1100 μL에서 세포 펠렛을 재현 탁. 부드럽게 마이크로 피펫을 사용하여 섞는다.
- 5 ㎖ 폴리스틸렌 플라스틱 튜브에 세포 현탁액 100 ㎕를 옮긴다. 5 ML의 폴리스티렌 튜브에 1X PBS 용액 400 μl를 추가합니다. 이 튜브는 티슈 자동 형광위한 제어이다. 단계 3.5까지 4 ºC에 저장합니다.
- 새로운 5 ㎖ 폴리스틸렌 플라스틱 튜브에 세포 현탁액의 나머지 1000 μL를 옮긴다. 생존 염료 1 μl를 추가하고 부드럽게 균질화. 4 ºC에서 어둠 속에서 30 분 동안 품어.
- 배양 후, 1000 & # 추가181; 1X PBS 용액 L. 손으로 가볍게 섞는다.
- 원심 분리기 모두 5 ml의 폴리스티렌 플라스틱 튜브는 4 ºC에서 10 분 동안 1,250 XG에 (3.2 및 3.3 단계). 기음과 상층 액을 버린다.
주 : 세포 펠렛 (단계 3.3)를 티슈 자동 형광 용 제어 될 것 단계 4. 세포 펠렛 (단계 3.2)에서 사용될 것이다.
4. 면역 표현형
- 항 - 마우스 CD16 / CD32 50 μL에서 세포 펠렛을 재현 탁 (1 희석 : FACS 완충액 100 [0.1 % BSA, 0.05 % 아 지드 화 나트륨, 1X PBS 용액의 pH 7.4]). 부드럽게 세포 현탁액을 섞는다. 소용돌이를 사용하지 마십시오.
- 10 분 동안 4 ℃에서 어둠 속에서 5 ml의 폴리스티렌 튜브에 세포 현탁액을 부화.
- 인큐베이션 후, 세포 외 세포 표면 마커 또는 이소 타입 - 매치 대조군 항체와 반응하는 항 각 백혈구 모노클로 날 항체 50 μL (희석액 항체가 확인해야 함) 추가한다. 예를 들어, 백혈구 하위 집단을 분석 안티 모 사용CD45, Ly6G, F4 / 80, 중 CD11c, CD49b, B220, CD3, CD4, CD8과 (표 1) 다음 백혈구 세포 표면 마커와 반응하는 항체를 사용합니다.
- 세포 마커에 대한 항체가 5 ml의 폴리스티렌 플라스틱 튜브에 추가되면, 부드럽게 섞는다. 4 ℃에서 30 분 동안 어둠 속에서 품어.
- 이 인큐베이션 동안, 준비 (탈 이온수로 희석하고, 1 : 5) 정착 완충액 미리 가온 필요한 경우 37 ºC를. 그것의 사용이 필요한 때까지 어둠 속에서 37 ºC에서 버퍼를 유지합니다.
- 30 분간 인큐베이션 한 후, 5 ml의 폴리스티렌 플라스틱 튜브 FACS 완충액 500 μL를 추가하고 부드럽게 혼합한다. 이 단계는 세포를 세척하고 결합되지 않은 항체의 과잉을 제거하기 위해 필요하다.
- 10 분 동안 4 ° C에서 1,250 XG에서 샘플을 원심 분리기. 기음과 상층 액을 버린다.
주 : 세포 염색이 필요하지 않은 경우, 세포 염색이 필요한 경우, 단계 5를 참조 투과성으로 수행하고 인트라울라 염색 여기에, 다음 고정 (4.8 단계)를 진행합니다. - 세포 펠렛을 예열 고정 완충 용액 500 μl를 첨가하고 37 ºC에서 10 분 동안 어둠 속에서 배양한다.
- 5 ㎖ 폴리스틸렌 플라스틱 튜브로 FACS 완충액 500 μL 디스펜스. 부드럽게 섞는다.
- 10 분 동안 4 ° C에서 1,250 XG에서 샘플을 원심 분리기. 기음과 상층 액을 버린다.
- 각 샘플에 외과 버퍼의 500 μl를 추가합니다. 이들 샘플은 현재 유동 세포 계측법에 의해 분석 될 수있다. 최상의 결과를 즉시 샘플을 수집.
수정할 수없는 세포 5. 생존 염색
- 세포 외 면역 표현형 후 FACS 완충액 500 μL에서 세포 펠렛을 재현 탁.
- 단지 샘플을 취득하기 전에 4 ', 6 diamidino -2- 페닐 인돌 디 히드로 클로라이드 (DAPI, 200 μg의 / ㎖)의 1 μl를 추가합니다.
- 플로우 사이토 미터를 사용 DAPI를 추가 한 후 2 분 - 1 내의 샘플을 시각화.
- 멸균 흄 후드에서 워크 스테이션을 준비합니다. 수조를 사용하여 37 ° C로 RPMI 배지를 미리 가온.
- 셀 카운팅 FACS 완충액 1000 ㎕의 세포 펠렛을 resuspend.
- 제조자의 지시에 따라, 자동 세포 계수기 또는 혈구 및 0.4 % 트리 판 블루 용액을 이용하여 생존 세포의 수를 카운트. 총 생균 수를 기록한다.
- 원심 분리기는 4 ° C에서 1,250 XG에 세포를 10 분은 외과 버퍼를 제거하십시오.
- 부드럽게 2 ~ 3 회 피펫 팅하여 예열 된 RPMI 배지 500 μL에서 세포 펠렛을 재현 탁.
- 멸균 된 24- 웰 플레이트에있는 세포의 수를 플레이트 및 37 ° C에서 배양한다. 배양 시간은 연구 문제에 의해 결정될 것이다.
7. 자기 셀 정렬
- MS 열, 자기 세포 분리, 15 : 다음 물질과 깨끗한 워크 스테이션을 설정ML 원뿔 튜브, 30 μm의 사전 분리 필터, 멀티 스탠드.
- MACS 완충액 (0.5 % BSA, 2mM의 EDTA, 1X PBS 용액의 pH 7.2) 500 μL에서 세포 펠렛을 재현 탁.
- 자동 세포 계수기 또는 혈구 및 0.4 % 트리 판 블루 용액을 사용하여, 카운트 및 총 생균 수를 기록한다.
- 10 분 동안 4 ℃에서 1,250 XG에서 세포를 원심 분리기. 기음과 상층 액을 버린다. 맥 버퍼의 또 다른 500 μl를 추가합니다.
- 제조업체의 권장 사항은 다음 자기 분리를 수행하기 위해 진행합니다.
- 유동 세포 계측법 또는 현미경으로 순도를 결정합니다.
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Representative Results
모체 - 태아의 인터페이스에서 뮤린 조직의 절개는도 1에 도시되어있다; 이 절차는 복강 (도 1A, B), 주입 부위 (도 1d)를 포함한 자궁 뿔 (도 1C), 및 자궁 조직의 컬렉션 (도 1E), 태반 (도 1F), 및 탈락 조직을 개방 포함 16.5에서 (그림 1G)는 DPC. 그림 2는 고립 된 대 식세포의 형태를 보여줍니다 (F4 / 80 +) 자기 세포 정렬을 사용하여 16.5 DPC의 탈락과 자궁 조직에서 수집. 격리 식세포 (데이타 미기재) 사이토 카인을 방출 할 수있는 기능을 유지한다. 탈락, 자궁, 태반에서 분리 된 생존 세포의 수율이도 3에 도시하고, 세포 생존율이 모든 조직에서 70 % 이상이다.도 4는 polymorphonucle 분석을위한 게이팅 전략을 보여준다 T 세포 (CD45 + CD3 +), 호중구 (CD45 + Ly6G +), 대식 세포 (CD45 + F4 / 80 +), 수지상 세포 (CD45 +의 CD11c의 +)와 NK 세포를 포함 단봉과 생존 게이트 내에서 AR과 단핵 백혈구 (CD45 + 16.5 DPC에서 CD49b +). 공동 명시하는 CD11c 대 식세포의 높은 비율. 그림 5는 16.5 DPC에서 호중구, 대 식세포와 T 세포 탈락, 자궁, 그리고 태반 조직을 보여줍니다. 그림 6은 단봉과 생존 게이트 내에서 림프구를 분석 포함한 게이팅 전략을 보여줍니다 T 세포 (CD45 + CD3 +) 및 16.5 DPC에서 B 세포 (B220 + CD45 +). T 세포는 CD4 + 및 CD8 + T 세포를 포함한다. 모체 - 태아의 계면에서 뮤린 조직에도 높은 비율로 CD3 + CD4-CD8- (감마 - 델타 T 세포)를 포함한다. (7)가 탈락, 자궁에서 T 세포와 B 세포를 보여주고, 16.5 DPC에서 태반 조직.
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그림 1. 조직의 해부. B6 마우스의 16.5 DPC에서 (A) 자궁 뿔. 자궁 뿔은 장간막 및 배출 용기에 부착된다. (B) 자궁 뿔은 장간막에서 해부 아직도 자궁 경부에 연결합니다. 주입 사이트 및 자궁 경부 포함 (C) 자궁 뿔. 주입 사이트 (D)를 해부. 이식 장소에서 자궁 조직 (E)의 해부. 이식 장소에서 태반과 탈락의 (F)의 분리. (사) 박리는 태반에서 탈락 (흰색 - 회색 층)의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 대 식세포는 탈락과 자궁 조직에서 분리. 대 식세포 (F4 / 80 + 세포) 자기 세포 정렬을 사용하여 16.5 DPC의 탈락과 자궁 조직에서 분리. 20X 배율. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 격리 된 세포의 3. 생존. 탈락, 자궁 및 태반 조직에서 분리 가능한 세포 (화살표로 표시 DAPI- 세포). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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다형과 단핵 백혈구 그림 4. 게이팅 전략은. 총 백혈구 인구는 단봉과 생존 게이트 내에서 문이되었다. T 세포 (CD45 + CD3 +), 대식 세포 (CD45 + F4 / 80 +), 호중구 (CD45 + Ly6G +), 수지상 세포 (CD45 +의 CD11c의 +)와 NK 세포 (CD45 + CD49b +)는 (총-백혈구 게이트 내에서 문이되었다 CD45 +). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
산모 - 태아 인터페이스에서 쥐의 조직에서 그림 5. 호중구, 대 식세포와 T 세포. 호중구 (CD45 + Ly6G +), 대식 세포 (CD45 + F4 / 80 +)와 T 세포 (CD45 + CD3 +)는 생존 능력 내에서 문이되었다 총 - 백혈구 (CD45의 +) 절연 탈락, 자궁, 태반 세포에서 게이트.TPS : //www.jove.com/files/ftp_upload/52866/52866fig5highres.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. 림프구에 대한 게이팅 전략. 단핵 세포는 단봉과 생존 게이트 내에서 문이되었다. T 세포 (CD3 +) 및 B 세포 (B220 +의)은 생존 게이트 내에 게이팅 하였다. CD4 +와 CD8 + T 세포가 T 세포 게이트 (CD3 +) 내에서 문이되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
산모 - 태아 인터페이스에서 쥐의 조직에서 그림 7. 림프구 하위 집단. T 세포 (CD3 +)및 B 세포 (B220 +를) 격리 탈락, 자궁, 태반 세포의 생존 게이트 내에서 문이되었다. CD4 +와 CD8 + T 세포가 T 세포 게이트 (CD3 +) 내에서 문이되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 세포 마커 | 형광 색소 | 복제 | 회사 | 카탈로그 번호 |
| 라이브 / 죽은 | DAPI | - | Life 기술 | L23105 |
| CD45 | V450 | 30-F11 | BD 바이오 사이언스 | 560501 |
| CD3 | FITC | 145-2C11 | BD 바이오 사이언스 | 553062 |
| CD4 | APC | RM4-5 | BD 바이오 사이언스 | 553051 |
| CD8 | PE-CF594 | 53-6.7 | BD 바이오 사이언스 | 562283 |
| B220 | APC-Cy7 | RA3-6B2 | BD 바이오 사이언스 | 552094 |
| F4 / 80 | PE | BM8 | eBiosciences | 12-4801-82 |
| Ly6G | APC-Cy7 | 1A8 | BD 바이오 사이언스 | 560600 |
| CD49b | APC | DX5 | BD 바이오 사이언스 | 560628 |
| 중 CD11c | PE-Cy7 | HL3 | BD 바이오 사이언스 | 558079 |
항체의 표 1. 목록은 백혈구의 부분 집합 모두 면역에 활용
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Discussion
산모 - 태아 인터페이스에 침투 백혈구의 풍요 로움과 표현형 특성을 기록하고 일관된 데이터의 수집은 임신 관련 합병증의 발병 기전을 이해하는 데 필수적이다. 몇 가지 기술은 임신 31,38,39,43-46 걸쳐 모체 - 태아의 계면에서 뮤린 조직으로부터 백혈구 침투의 분리를 용이하게하는 기술되었다. 그러나, 각각의 기술은 다르고, 항상 분리 된 세포의 생존 능력을 지정하지 않고, 가장 중요한 것은, 효소 또는 효소의 조합을 사용하여 상이한 요구 상이한 해리 시간을, 조직의 수량을 지정하지 않고. 본원에 기술 된 프로토콜은 높은 생존력과 모체 - 태아의 계면에서 뮤린 조직으로부터 백혈구 침투의 분리를 허용하고, 밸리데이션 상세한 상업적 시약에 대한 정보, 버퍼 준비, 조직 수량과 배양 시간을 제공한다실험실.
백혈구 분리 공정의 가장 중요한 단계 중 하나는 티슈 해리이고; 이 단계는 표현형 특성 (47)에 사용되는 세포 외 단백질의 무결성을 변경할 수 기계적 균질화 및 / 또는 효소 적 반응을 수반한다. 본원에 기술 된 프로토콜은 태반과 마우스의 탈락 및 자궁 조직으로부터 격리 백혈구 세포 마커의 무결성을 유지하기 위해 온화한 기계적 및 효소 조직 분리 기술의 사용을 결합한 새로운 접근법을 제공한다.
단일 효소와 다른 효소의 조합이 모체 - 태아 인터페이스 31,32,39,44에서 쥐의 조직에서 침투 백혈구를 분리하기 위해 사용되어왔다. 많은 경우에, 실험실에서 손으로 특정 농도에 준비가되어이 효소는 인간의 오류를받을 수 있습니다. 여기서, 대신, 바로 사용 가능한 정제 된 콜라게나 제 / 중립 PROT칵테일, Accutase, 실험실에서 구현되었습니다 완화; 시판 효소 제제로서,이를 세포 배양 물 (48) 신뢰할 수있는 결과를 제공하는 것으로 나타났다. 이 효소 용액은 표면을 잃고 48 항원없이 효율적으로, 가장 중요한 긁어 및없이 문화 판에서 대 식세포를 분리하는 것으로 알려져있다. 이렇게 제조 된 효소는 또한 후속 배양 (47)을 허용하는, 장기간 지속 유지 가능한 분리 된 세포의 결과, 인간과 동물의 신경계 조직의 분해 처리에 사용되어왔다. 또한,이 효소 솔루션은 중추 신경계 조직 47에서 분리 된 세포에서 CD24의 항원 성을 유지합니다. Liberase-1, 콜라게나 중성 프로테아제의 또 다른 칵테일도 Accutase도 Liberase-1 무료 DNA 집계를 생성 비교했을 때, 그러나 Accutase는 조직 (47) 중에 분리 Liberase-1보다 완만하다. 콜라게나 제 / 중립 프로테아제 공동이 프로토콜에서 사용 cktail 또한 CD44, 암 줄기 세포 표면 마커 (49)의 보존에 트립신에 우수성을 보여 주었다. 이 연구소의 연구는 지속적으로이 효소 솔루션은 마우스 백혈구 표면 항원을 보존 주목했다. 실제로, 정보 차이 식세포에서 세포 마커의 발현에서 발견되었다 (는 CD11b + F4 / 80 + 세포), 호중구 (는 CD11b + Ly6G + 세포), NKT 세포 (CD3 + CD49b + 세포), T 세포 (CD3 + 세포) 및 B CD4, CD8, CD69, CD25, CD40L, PD1, CD44, CD62L, 및 CTLA4, 및 사이토 카인 릴리스에 포함 세포 (B220 CD19 + 세포 +). 따라서, 본원에 기재된 방법은 대표적인 결과에 나타낸 바와 같이, 마우스에서의 모체 - 태아의 계면에서 백혈구 침투의 면역 표현형에 최적이다.
이 방법의 한가지 중요한 이점은 생존력 게이트 내에서 여러 가지 세포 외 및 세포 내 항원의 동시 분석이다. 염료가 가장 디 데 사용termine 세포 생존력은 요오드화 프로피 듐 (PI)이다; 그것만 FITC와 병용 할 수 있기 때문에 그러나, 그 사용이 제한된다. PI 적절히 블루, 레드 레이저 (50)에 의해 여기 된 대부분의 다른 형광 색소와 구별 될 수 없기 때문이다. DAPI 용액은 50 또는 UV 레이저가 아닌 일반적으로 사용되는 면역 표현형 청색과 적색 레이저에 의해 여기되어 다른 염료를 사용하는 것이다. 그것을 수정할 수없는 세포 또는 세포 생존력 정착 염료의 사용을 위해 DAPI (50)의 사용을 포함으로서이 프로토콜은 생존 세포의 면역 표현형을 허용한다.
본원에 기술 된 프로토콜의 두번째 중요한 장점은 생세포의 고 수율로 백혈구의 분리를 허용한다는 것이다. 대표 데이터는 분리 된 세포의 70 % 내지 89 %가 가능한 것을 나타낸다. 이 프로토콜은 산모 - 태아 인터페이스에서 쥐의 조직에서 분리 된 세포의 기능적 특성의 연구를 허용 한 이것은 매우 중요하다. F또는 예, 탈락 및 자궁 식세포 자극에서 사이토 카인의 방출의 연구 문화는이 방법을 사용하여 수행되었다.
의 생존을 유지하기 위해 1) 조직 수집은 복강을 연 후에 5 내지 10 분 이내에 수행해야하고, 이러한 조직을 얼음 상에 배치되어야한다 : 다음과 같은 요인을 고려하면 성공적인 결과를 달성하기 위해, 기술 된 프로토콜의 적용이 중요 분리 된 세포; 2) 조직 균질화 기계적 미세 팁 가위를 사용하여 수행되어야하고 긴 기간은 생세포의 수율을 감소하는 것으로 입증 되었기 때문에 2 분을 초과 할 수 없다; 그 활성 시간이 지나면 감소 이후 3) 효소 용액과 함께 항온 배양 기간은 1 시간 미만이어야; 4) 효소 용액으로 배양 온도는 효소의 칵테일의 최적 활성을 얻기 위하여 37 ℃로 유지되어야한다; 5) 세포 펠렛의 manip소용돌이의 사용은 세포의 무결성을 (분리 된 세포는 쉽게 자신의 가능성을 줄일 수있는 차별화 된 갑작스러운 조작이다)에 손상을 줄 수 있기 때문에 위험률은 마이크로 피펫으로 조심스럽게 수행해야합니다; 6) 버퍼와 원심 온도는 세포 현탁액과 동일한 온도로 유지되어야한다; 그들의 생존 능력이 빠르게 감소로 7) 분리 된 세포는 모두 면역을 위해 처리 즉시 사용되어야한다; 모두 면역을 수행 할 때, 8), 샘플은 최상의 결과를 사이토 즉시 흐름을 사용하여 취득해야합니다.
이 프로토콜의 제한은 유사한 기능, 예를 들어, 트립신, 디스 파제 II, 및 콜라게나 제와 다른 효소보다 더 비싼 효소 용액의 비용이다. 그러나,이 효소 용액은 위에 설명 된 상기 효소 위에 표시하는 우수한 장점이있다.
모두 면역과 세포 배양 및 정렬 외에도,이 프로토콜의 미래 응용 프로그램은 뉴하다merous 다양. 예를 들어, 절연 백혈구 관내 백혈구 기능 (예를 들어, 식균 작용, 세포 독성 T 세포 증식과 가소성 분석 등), 반응성 산소 종의 생산에 DNA 메틸화, 표적 유전자의 발현을 결정하는 것이 가능해 산모의 태아 인터페이스에서 쥐의 조직에서. 실제로, 산모 - 태아 인터페이스에서 쥐의 조직에서 새로운 희귀 백혈구의 설명도 수행 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 관심의 충돌을 공개하지 않습니다.
Acknowledgments
NGL은 모자, 주 산기 모자 건강에 웨인 주립 대학 주 산기 이니셔티브에 의해 지원되었다. 우리는 기꺼이 원고의 비판적인 읽기 모린 McGerty 에이미 E. Furcron (웨인 주립 대학)을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Magentic Cell Separation | |||
| MS Columns | Militenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Cell Separator | Militenyi Biotec | 130-042-102 | |
| 30 μm pre-separation filters | Militenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Multistand | Militenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 15 ml conical tubes | Thermo Fisher | 339650 | |
| MACS Buffer | Militenyi Biotec | Laboratory preparation | (0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1x PBS, pH 7.2) |
| Reagents | |||
| Accutase enzymatic solution | Life Technologies | A11105-01 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 533142 | |
| Anti-mouse extracellular antibodies | BD Bioscences/eBiosciences | Table 1 | |
| Sodium azide | Fisher | S227-500 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| LIVE/DEAD viability dye | Life Technologies | L23105 | |
| Fixation buffer solution | BD Biosciences | 558049 | |
| FACS Buffer | BD Biosciences | Laboratory preparation | 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 1x PBS, pH 7.4 |
| Trypan blue solution 0.4% | BIO-RAD | 145-0013 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| Additional Instruments | |||
| Incubator with shaker | Thermo Scientific | MaxQ 4450 | |
| Flow cytometer | BD LSRFortessa | ||
| Centrifuge | Thermo Scientific | Legend LXTR | |
| Vacuum system | laboratory constructed | ||
| Incubator | Thermo Scientific | Incubator 3307 | |
| Water bath | Precision | 51221035 | |
| Cell counter | BIO-RAD | TC20 Automated Cell Counter | |
| Optical and fluorescence microscopes | Zeiss and Olympus | Zeiss LSM780 and Olympus CKX41 | |
References
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