Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Isolering av leukocyttene fra Murine Vev på Maternal Fetal Interface

Published: May 21, 2015 doi: 10.3791/52866
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1,3,4
1Department of Obstetrics & Gynecology, Wayne State University School of Medicine, 2School of Paediatrics and Reproductive Health, Research Centre for Reproductive Health, the Robinson Research Institute, The University of Adelaide, 3Department of Immunology & Microbiology, Wayne State University School of Medicine, 4Perinatology Research Branch, NICHD/NIH/DHHS

Abstract

Immuntoleranse i svangerskapet krever at immunforsvaret til mor gjennomgår karakteristiske endringer for å akseptere og gi næring til fosteret. Denne toleransen er initiert under samleie, etablert under fecundation og implantasjon, og vedlikeholdes gjennom hele svangerskapet. Aktive cellulære og molekylære formidlere av maternal-føtal toleranse er beriket på kontaktstedet mellom foster eller mor vev, kjent som mor til foster grensesnitt, som inkluderer morkaken og livmor og Deciduale vev. Dette grensesnittet består av stromale celler og infiltrere leukocytter, og deres overflod og fenotypiske egenskaper endre seg i løpet av svangerskapet. Infiltrere leukocytter ved maternal-føtal grensesnittet inkluderer nøytrofile, makrofager, dendrittiske celler, mastceller, T-celler, B-celler, NK-celler, og NKT celler som til sammen skaper den lokale mikro-miljøet som opprettholder svangerskapet. En ubalanse mellom disse celler eller ethvert inappropmessig endring i deres fenotyper er ansett som en mekanisme for sykdom i svangerskapet. Derfor er studiet av leukocytter at infiltrere maternal-føtal grensesnitt viktig for å belyse immunmekanismer som fører til svangerskapsrelaterte komplikasjoner. Beskrevet her er en protokoll som bruker en kombinasjon av milde mekanisk dissosiasjon etterfulgt av en robust enzymatisk disaggregering med et proteolytisk og kollagenolytisk enzymatisk cocktail å isolere infiltrere leukocytter fra murine vev ved maternal-føtal grensesnitt. Denne protokollen tillater isolering av et høyt antall levedyktige leukocytter (> 70%) med tilstrekkelig konserverte antigene og funksjonelle egenskaper. Isolerte leukocytter kan deretter bli analysert ved hjelp av flere teknikker, inkludert immunfenotyping, cellesortering, bildebehandling, immunoblotting, mRNA-ekspresjon, cellekultur, og in vitro funksjonelle forsøk slik som blandede leukocyttkultur-reaksjon, proliferasjon eller cytotoksisitetsanalyser.

Introduction

Immuntoleranse i svangerskapet er en periode da karakteristiske endringer forekommer i immunforsvaret til mor. Disse endringene gjør at moren til å tolerere fosteret, en semi-allogen pode en. Fosteret uttrykker fars hovedhistokompatibilitetskompleks (MHC) antigener to, og føtale celler er funnet i morens sirkulasjon 3; imidlertid er fosteret ikke avvises 4,5. Dette gåte er ikke fullt ut forstått.

Den siste hypotesen sier at maternal-føtal toleranse er opprettet under samleie og fecundation 6,7 og vedlikeholdes for å opprettholde en full-term graviditet 8-10. En oppsplitting av denne maternal-føtal toleranse er ansett som en mekanisme for sykdom i tidlige og sene stadier av svangerskapet 10-16. Mor til foster toleranse innebærer deltakelse av ulike leukocytter sub-populasjoner, inkludert T-celler (regulatoriske T-celler, Th1-celler, Th2-celler og Th17 celler), macrophages, nøytrofile, mast celler, NK-celler, og NKT celler, dendrittiske celler og B-celler, som endring i tetthet og lokalisering gjennom hele svangerskapet 15,17-19. Mor til foster toleranse er beriket ved maternal-føtal grensesnitt 20 - den anatomiske området der immunforsvaret til mor samhandler med føtale antigener 20,21.

Den maternal-føtal grensesnittet er opprettet under placentation når fosterets extravillous trophoblast celler invadere livmorslimhinnen 22-24. På fosterets side av dette grensesnittet, membraner som omgir fosteret lage en spesialisert epiteloverflaten i morkaken, og syncytiotrophoblast celler styre næringsstoff utveksling gjennom sin direkte kontakt med mors blod 22. På mors side av grenseflaten, decidua rekrutterer en heterogen pool av leukocytter som i mus utgjør 30% til 50% av alle uterusslimhinneceller. I tillegg til sin deltakelse i Maternal immuntoleranse, disse cellene er viktige bidragsytere til ulike prosesser i løpet av svangerskapet, f.eks., beskyttelse av skjede fra infeksjoner, fecundation, embryoimplantasjonen 7,25, decidual angiogenese 26, vaskulær remodelle 24,27, trophoblast invasjonen 28, morkake utvikling 24,25, og, til slutt, arbeid og levering 15,17. Derfor er studiet av leukocytter involvert i maternal-føtal toleranse viktig å belyse patogenesen av svangerskapsrelaterte komplikasjoner.

Mens bruken av immunhistokjemi og immunfluorescens har generert data for direkte visualisering og lokalisering av livmor, decidual, eller placenta leukocytter 29,30, flow cytometri analyse har videre avslørt spesifikke undergrupper av leukocytter i hver av disse vev 31,32. I tillegg flow cytometri er blitt brukt til å bestemme tetthet og andelen av maternal-føtal grensesnitt leukocytter 33 og uttrykk nivåer av ekstracellulære og intracellulære proteiner 8-10,34. Strømningscytometrisk analyse av leukocytter ved maternal-føtal grensesnittet krever en encellet suspensjon. For å isolere infiltrere leukocytter fra decidual, livmor, og morkakevev, har to fremgangsmåter for vev dissosiasjon blitt anvendt: mekanisk og enzymatisk. Begge metodene tillater separasjon av infiltrerte leukosytter fra den ekstracellulære matriks (ECM) av disse vev. Enzymatisk vev dissosiasjon er overlegen mekanisk vev dissosiasjon som det tillater et høyere utbytte av leukocytter med mindre skjærkraft assosierte skader 35. Følgelig krever mekanisk vev dissosiasjon pooling vev 36, som kan øke variabilitet og heterogenitet av prøvene. Likevel kan mekanisk dissosiasjon være valg når antigenet av interesse kan bli endret ved enzymatisk dissosiasjon, eller når funksjonaliteten av cellens av interesse behov for å bli bevart (f.eks., cytotoksisitet av NK-celler) 35.

Bruken av proteolyse med spesifikke enzymer for å degradere ECM eliminerer de lave rentene observert med mekanisk dissosiasjon. Flere studier har rapportert bruk av trypsin 32, kollagenase 37, DNase 31, dispase 38, og kommersielle cocktails av ulike enzymer 32,39. Imidlertid må arten og konsentrasjonen av forskjellige enzymer og varigheten av fordøyelsen være omhyggelig definert og valideres for å sikre opprettholdelse av integriteten av celleoverflate-antigene epitoper som er nødvendige for immunfenotyping. De forskjellige overflatestrukturer er differensielt utsatt for ødeleggelse av forskjellige enzymer, med noen enzymer, såsom trypsin, som er beryktet for stripping av leukocytt-overflate epitoper gjenkjent av flere monoklonale antistoffer.

Introdusert her er en metode som bruker en proteolytic og kollagenolytisk enzymatisk cocktail, kalt Accutase. Denne enzymatiske løsningen er skånsom nok samtidig effektiv i dissociating murine vev ved maternal-føtal grensesnitt, og krever ikke tillegg av andre dissociating reagenser eller serum for å avslutte dissosiasjon reaksjon. Videre, er den klar til bruk som levert, og selv om tiden for dissosiasjon må valideres, det er mer robust enn de ovennevnte enzymer 40,41.

Anvendelsen av en kombinasjon av begge typer av vev dekomponering forbedrer kvaliteten og mengden av celler oppnådd; dermed har flere studier gjennomført kombinert bruk av mekanisk og enzymatisk dissosiasjon med tilfredsstillende resultater 31,32,37. Protokollen er beskrevet her ble etablert og validert i vårt laboratorium; Den benytter en kombinasjon av en mild mekanisk dissosiasjon etterfulgt av en robust enzymatisk dekomponering. Denne protokollen tillater isolering og videre studier avde infiltrere leukocytter i murine vev ved maternal-føtal grensesnitt (livmor, decidua, og placenta). Følgende protokoll også opprettholder integriteten av celleoverflatemarkører og gir tilstrekkelig levedyktige celler til nedstrøms applikasjoner som demonstrert ved strømningscytometrisk analyse. Til slutt, opprettholder denne protokollen konsistensen av cellepreparat for analyse og sammenligning av ulike murine vev som utgjør maternal-føtal grensesnitt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Før arbeider med prøvene nevnt i denne protokollen, må dyret etisk godkjenning gis av den lokale forskningsetiske komité og Institutional Review Boards. Når du arbeider med dyreblod, celler, eller farlige stoffer som er nevnt i denne protokollen, må de riktige biologisk og laboratorie sikkerhetstiltak følges.

1. Mouse Håndtering og Tissue Collection

  1. Forbered en steril arbeidsstasjon og få sterile verktøy for vev samling. Disse verktøyene vil omfatte store og små kirurgiske saks, pinsett, og fine-tip pinsett. Inkluderer små petriskåler merket med de aktuelle vev navn, fylt med 1 x fosfatbufret saltløsning (PBS) oppløsning (3-5 ml) ekvilibrert til romtemperatur (20 - 22 ° C). Inkluderer også en stor petriskål, umerket, fylt med 1x PBS-løsning (10 - 15 ml).
  2. Avlive en gravid mus (10,5 til 19,0 dager etter samleie (DPC) eller før levering) ved hjelp av karbondioksid (CO 2). For å sikre at musen avlives, bruker halsdislokasjon teknikk.
    Merk: Før 10.5 DPC, er det vanskelig å skille de Deciduale vev manuelt fra livmorsvev. Ved isolering av Deciduale leukocytter ikke er nødvendig, leukocytter fra livmor vev av ikke-gravide mus eller de fra mus ved <10,5 DPC kan også utføres ved å følge denne protokoll.
  3. Ved hjelp av et par av sterile kirurgiske sakser, fjerne det nedre mageparti av huden og muskelvevet. Med pinsett, flytte til side alle andre organer til livmoren og eggstokkene er synlige. Med livmoren fortsatt festet, bruker tang for å flytte den utsiden av bukhulen (figur 1A).
  4. Finn eggstokkene distale til egglederen og uterotubal krysset hver livmor horn. Ved hjelp av de små kirurgiske saks, gjør et snitt på uterotubal krysset og skille livmor hornene fra mesentery inneholder livmor fartøyer; deretter,avgiftsdirektoratet på livmorhalsen for å løsne livmor horn fra bukhulen (figur 1B).
  5. Med små kirurgiske sakser, gjør et snitt mellom cervix og den nedre delen av de uterine horn. La festet en del av livmorhalsen under denne prosessen (figur 1C) for å unngå åpning av livmorhorn.
  6. Fordype livmor horn (inkludert livmorhalsen) i en stor petriskål fylt med 1x PBS-løsning (10 - 15 ml) til hydrat implantasjoner.
  7. Mens han fortsatt nedsenket i 1x PBS løsning, trimme noe fett fra livmor horn med de små kirurgiske saks. Hold vev nedsenket i 1x PBS løsning gjennom disseksjon.
  8. Holder livmor horn på plass med pinsett, fjerner du en av de implantasjoner fra livmoren med en tverrgående skjære gjennom inter-implantasjon regionen, ved hjelp av små kirurgiske saks (Figur 1D). Implantasjonsstedet inneholder fosteret, omgitt avchorioallantoic membran, og livmor, decidual, og placentale vev.
  9. Ved hjelp av pinsett, hold nettstedet på plass og gjør et lite snitt i livmorveggen ved siden av placenta og Deciduale vev (Figur 1E). Trim rundt omkretsen av placenta / decidua inntil disse blir skilt fra både livmorveggen og chorioallantoic membran som omfatter fosteret (figur 1F).
  10. Fjern morkaken og festet Deciduale vev og plasser i 1x PBS løsning (3-5 ml, se trinn 1.12).
  11. Plasser fosteret omgitt av chorioallantoic membran festet til livmorvevet i en petriskål fylt med 1 x PBS-oppløsning (3-5 ml). Hydratiseringen av disse vev vil lette separeringen av chorioallantoic membranen fra livmorveggen (se trinn 1.14).
  12. Ved hjelp av et par fine tips pinsett, skrelle forsiktig decidual vev (hvit-grå lag) fra morkake overflaten. Utfør dennetrå forsiktig for å opprettholde integriteten av placenta og Deciduale vev (Figur 1G).
  13. Plasser placenta og Deciduale vev i to hver for seg merkede Petri-skåler fylt med 1 x PBS-oppløsning (3-5 ml hver).
  14. Fjern forsiktig livmorveggen fra chorioallantoic membran med fin-tip pinsett. Disse er de uterusvev.
  15. Plasser uterusvev i en petriskål fylt med 1 x PBS-oppløsning (3-5 ml).
  16. Gjenta trinn 1.8 gjennom 1,15 til alle implantasjoner har blitt behandlet.
  17. Samle flere livmor, decidual, og morkakevev å forbedre utbyttet av celler i løpet av enzymatisk oppslutning. Mengden av vev er avhengig av kullstørrelsen; krever imidlertid leukocytter isolasjon> to biter av vev.
    Merk: For mer detaljert informasjon om disseksjon av implantasjoner på ulike svangerskaps dager, vise bildene som finnes i kapittel to av The Guide til Investigatipå av mus Graviditet 42.

2. Livmor, decidual, og Morkake Tissue Dissosiasjon

  1. Merke flere sterile 2 ml koniske rør med riktig vev navn, og plassere en ampulle med 1000 mL av enzymatisk løsning på is.
  2. Fra petriskål fylt med 1 x PBS-oppløsning, overfører to stykker (100 - 150 mg) i livmor, decidual, eller morkakevev til en merket 2 ml konisk rør.
  3. Legg 500 ul kald enzymatisk løsning i hver 2 ml konisk tube.
  4. Med fine steril saks, begynner å distansere vevet nedsenket i enzymatisk løsning før det er fint hakket. Over tid vil suspensjonen utvikle et melkeaktig utseende. Dette trinnet bør ikke overstige mer enn 2 minutter for å forhindre over-manipulering av prøven.
  5. Når vevet er blitt dissosiert, legge til en ekstra 500 ul kald enzymatisk løsning på 2 ml konisk rør.
  6. Plasser 2 ml konisk rør på is.
  7. Gjenta trinn 2.2 gjennom 2.6 med hver enkelt vev til alle vev har blitt behandlet.
  8. Overfør alle 2 ml koniske rør med homogenisert vev (hakket vev + enzymatiske løsning) prøver fra is i en inkubator ved 37 ° C og utføre en skånsom orbital omrøring (80 rpm). Inkuber i 30 - 35 min. Sørge for at temperaturen i inkubatoren er stabilisert før inkubasjonstiden.
  9. Etter inkubasjon, fjern de to ml koniske rør med dissosierte vev fra inkubatoren og plassere dem på is for å hindre ytterligere fordøyelsen.
  10. Merke sterile 50 ml koniske rør i henhold til vevstype. Fjern lokkene og erstatte dem med en steril celle sil (100 mikrometer pore størrelse).
  11. Hell dissosiert vev fra de 2 ml koniske rør gjennom cellen ved hjelp av silen ~ 20 ml av 1 x PBS-oppløsning. Fragmentene av vev vil forbli i cellen sil og cellesuspensjonen vil passere gjennom den.
  12. Vask dissociated vev i cellefilter 2 - 3 ganger med 20 ml 1 x PBS-oppløsning ved hjelp av en overføring pipette.
  13. Skyll de tomme 2 ml koniske rør med 1 x PBS-oppløsning (1 ml), og helle innholdet gjennom celle silene.
  14. Fjern celle siler fra 50 ml koniske rør og erstatte lokkene. Sentrifuger rørene ved 1250 xg i 10 min ved 4 ° C.
  15. Nøye, aspirer supernatanten uten å forstyrre cellepelleten. Cellepelleten inneholder de isolerte leukocytter og stromale celler.
  16. Re-suspen cellepelleten i 1 ml RPMI kulturmedium uten føtalt bovint serum (FBS). Bland forsiktig. Ikke bruk vortex.
  17. Legg 500 mL av pene FBS til en 5 ml polystyren plastrør og sakte overlappe cellesuspensjonen.
  18. Sentrifuger i 10 minutter ved 1100 xg uten bremsen ved RT for å pelletisere levedyktige celler, mens cellerester bibeholdes ved PBS / FBS-grensesnitt.
  19. Aspirer supernatanten uten å berøre cellepelleten. Cell pellet inneholder mest levedyktige celler.
  20. Eventuelt: å konsentrere mononukleære celler ved å bruke en 20% polysakkarid mettet oppløsning, som beskrevet nedenfor.
    1. Resuspender cellepelleten i 1000 pl av RPMI kulturmedium uten FBS.
    2. Tilsett 1 ml 20% mettet polysakkarid-løsning til en 5 ml polystyren plastrør og langsomt overlappe cellesuspensjonen på toppen av denne løsningen, i henhold til produsentens instruksjoner. Mens lagdeling prøven, å unngå blanding av den 20% mettet oppløsning polysakkarid med cellesuspensjonen.
    3. Sentrifuger med en swing-out rotor på 500 xg i 30 minutter ved romtemperatur uten brems. Det er veldig viktig å slå av bremsen for å unngå å blande cellene og mister graderingen. Mononukleære celler vil bli funnet i grenseflaten mellom 20% mettet polysakkarid-løsning og 1 x PBS-oppløsning.
    4. Aspirer og kast supernatanten. Cellepelleten inneholder hovedsakelig mononukleære celler.
      Neite: Hvis du vil utføre levedyktighet farging og intracellulær flekker, se trinn 3. For å utføre immunfenotyping, se trinn 4. For å utføre levedyktighet farging og ekstracellulære flekker bare, se trinn 5. Hvis du vil utføre en cellekultur av isolerte leukocytter, se trinn 6. For å utføre magnetisk cellesortering, se trinn 7.

3. Livskraftig Farging for fikses Cells

  1. Resuspender cellepelleten i 1100 pl av 1 x PBS-løsning. Bland forsiktig ved anvendelse av en mikro-pipette.
  2. Overfør 100 ul av cellesuspensjonen inn i en 5 ml polystyren plastrør. Tilsett 400 ul av 1 x PBS løsning på 5 ml polystyrenrør. Dette rør er en kontroll for vev auto-fluorescens. Oppbevar ved 4 ºC til trinn 3.5.
  3. Overfør de resterende 1000 mL av cellesuspensjonen til en ny 5 ml polystyren plastrør. Legg 1 mL av levedyktighet fargestoff og forsiktig homogenisere. Inkuber i 30 minutter i mørke ved 4 ° C.
  4. Etter inkubasjon, legge 1000 & #181; l 1x PBS løsning. Bland forsiktig for hånd.
  5. Sentrifuger begge 5 ml polystyren plastrør (trinn 3.2 og 3.3) ved 1250 xg i 10 minutter ved 4 ºC. Aspirer og kast supernatanten.
    Merk: Cellepelleten (trinn 3.3) vil bli brukt i trinn 4. Cellepelleten (trinn 3.2) vil tjene som en kontroll for vev auto-fluorescens.

4. Immunfenotyping

  1. Resuspender cellepelleten i 50 ul av anti-mus CD16 / CD32 (fortynnet 1: 100 i FACS-buffer [0,1% BSA, 0,05% natriumazid, 1 x PBS-oppløsning, pH 7,4]). Bland cellesuspensjonen forsiktig. Ikke bruk vortex.
  2. Inkuber cellesuspensjonen i 5 ml polystyrenrør i mørke ved 4 ° C i 10 min.
  3. Etter inkubasjon, tilsett 50 mL av hver anti-leukocytt monoklonalt antistoff som reagerer med ekstracellulære markører celleoverflate eller isotype-matchet kontroll antistoff (antistoff fortynninger må valideres). For eksempel, for å analysere leukocyttpopulasjoner sub-populasjoner, bruke anti-mobruke antistoffer som reagerte med følgende leukocytt-celleoverflatemarkører: CD45, Ly6G, F4 / 80, CD11c, CD49b, B220, CD3, CD4, CD8 og (tabell 1).
  4. Når antistoffer mot ekstracellulære markører har blitt lagt til 5 ml polystyren plastrør, bland forsiktig. Inkuber i mørke i 30 min ved 4 ° C.
  5. I løpet av denne inkubasjonen forberede og forvarme festebufferoppløsning (fortynnet med deionisert vann, 1: 5) til 37 ° C, om nødvendig. Hold buffer ved 37 ºC i mørket inntil bruken er nødvendig.
  6. Etter 30 min inkubering, tilsett 500 ul FACS-buffer i 5 ml polystyren plastrør og forsiktig blanding. Dette trinnet er nødvendig for å vaske cellene og fjerne ethvert overskudd av ubundet antistoff.
  7. Sentrifuger prøvene ved 1250 xg ved 4 ° C i 10 min. Aspirer og kast supernatanten.
    Merk: Hvis intracellulær flekker ikke er nødvendig, se trinn 5. Hvis intracellulær farging er nødvendig, utføre permeabilization og intraular flekker her og deretter fortsette med fiksering (trinn 4.8).
  8. Legg 500 ul av den forvarmede fiksering bufferoppløsning til cellepelleten og inkuberes i mørket i 10 minutter ved 37 ° C.
  9. Dispenser 500 ul FACS-buffer inn i 5 ml polystyren plastrør. Bland forsiktig.
  10. Sentrifuger prøvene ved 1250 xg ved 4 ° C i 10 min. Aspirer og kast supernatanten.
  11. Legg 500 ul FACS-buffer til hver prøve. Disse prøvene kan nå bli analysert ved flow-cytometri. Tilegne prøvene umiddelbart for best resultat.

5. Livskraftig Farging for unfixable Cells

  1. Etter ekstracellulære immunfenotyping, cellepelleten suspenderes i 500 mL av FACS buffer.
  2. Legg 1 ul 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol-dihydroklorid (DAPI, 200 ug / ml) like før anskaffe prøven.
  3. Visual prøvene innen 1 - 2 minutter etter tilsetting DAPI bruker en strømningscytometer.

  1. Forbered en arbeidsstasjon med en steril avtrekkshette. Pre-varme RPMI kulturmedium til 37 ° C ved hjelp av et vannbad.
  2. Resuspender cellepelleten i 1000 pl FACS buffer for celletelling.
  3. Telle antall levedyktige celler ved hjelp av en automatisk celleteller eller hemocytometer og 0,4% trypanblått løsning, etter produsentens anvisninger. Spill den totale levende celletall.
  4. Sentrifuger cellene ved 1250 xg ved 4 ° C i 10 minutter for å fjerne FACS-buffer.
  5. Resuspender cellepelleten i 500 ul av forvarmet RPMI dyrkningsmedium ved forsiktig pipettering av 2 til 3 ganger.
  6. Plate det ønskede antall celler i en steril 24-brønns plate og inkuberes ved 37 ° C. Inkubasjonstiden vil bli bestemt av problemstillingen.

7. Magnetic Cell Sorting

  1. Sett opp en ren arbeidsstasjon med følgende stoffer: MS søyler, magnetiske cellen separator, 15ml koniske rør, 30 um pre-separasjonsfiltre, og en multi-stativ.
  2. Resuspender cellepelleten i 500 ul MACS-buffer (0,5% BSA, 2 mM EDTA, 1 x PBS-oppløsning, pH 7,2).
  3. Ved hjelp av en automatisk celleteller eller hemocytometer og 0,4% trypanblått løsning, telle og registrere den totale levende celletall.
  4. Sentrifuger cellene ved 1250 xg ved 4 ° C i 10 min. Aspirer og kast supernatanten. Legg en annen 500 mL av MACS buffer.
  5. Fortsett å utføre magnetisk separasjon følge produsentens anbefalinger.
  6. Bestemme renhet ved strømningscytometri eller mikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Disseksjon av murine vev fra mor til foster grensesnittet er vist i figur 1; denne fremgangsmåten omfatter å åpne bukhulen (figur 1 A, B), uterine horn (figur 1C), inkludert implantasjoner (figur 1D), og innsamling av uterusvev (figur 1E), placenta (figur 1F), og Deciduale vev (figur 1G) ved 16,5 DPC. Figur 2 viser morfologi av isolerte makrofager (F4 / 80 +) samlet inn fra Deciduale og uterusvev på 16,5 DPC ved hjelp av magnetisk cellesortering. Isolerte makrofager opprettholde evnen til å frigi cytokiner (data ikke vist). Utbyttet av levedyktige celler isolert fra decidua, uterus, placenta og er vist i figur 3, og celle-levedyktigheten er større enn 70% i alle vev. Figur 4 viser portstyringsstrategi for å analysere polymorphonucle Ar og mononukleære leukocytter innenfor sing og levedyktighet porter, inkludert T-celler (CD45 + CD3 +), nøytrofile celler (CD45 + Ly6G +), makrofager (CD45 + F4 / 80 +), dendrittiske celler (CD45 + CD11c +), og NK-celler (CD45 + CD49b +) på 16.5 DPC. En høy andel av makrofager co-uttrykte CD11c. Figur 5 viser neutrofiler, makrofager og T-celler i decidual, livmor, og morkakevev på 16,5 DPC. Figur 6 viser portstyringsstrategi for å analysere lymfocytter innenfor sing og levedyktighet porter, inkludert T-celler (CD45 + CD3 +) og B-celler (CD45 + B220 +) på 16,5 DPC. T-celler inkluderer CD4 + og CD8 + T-celler. Murine vev ved maternal-føtal grensesnitt omfatter også CD3 + CD4-CD8- (gamma-delta T-celler) i høye andeler. Figur 7 viser T-celler og B-celler i decidual, livmor, og morkakevev på 16,5 DPC.

jpg "width =" 700 "/>
Figur 1. Tissue disseksjon. (A) Livmor horn på 16,5 DPC i en B6 mus. Uterine horn er festet til mesenteriet og drenering fartøy. (B) Livmor horn dissekert fra mesenteriet og fremdeles er festet til livmorhalsen. (C) Livmor horn inkludert implantasjoner og livmorhalsen. (D) Disseksjon av et implantasjonsstedet. (E) Disseksjon av uterusvev fra implantasjonsstedet. (F) separasjon av placenta og decidua fra implantasjonsstedet. (G) Detachment of decidua (hvit-grå lag) fra morkaken. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Makrofager isolert fra Deciduale og livmor vev. Makrofager (F4 / 80 + celler) isolert fra Deciduale og livmor vev på 16,5 DPC bruker magnetisk cellesortering. 20X forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Livskraftig av isolerte celler. Levedyktige celler (DAPI- celler representert med piler) isolert fra decidual, livmor, og morkakevev. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

"/>
Figur 4. gating strategi for polymorfnukleære og mononukleære leukocytter. Total leukocytter befolkningen ble gated innenfor singleter og levedyktighet porter. T-celler (CD45 + CD3 +), makrofager (CD45 + F4 / 80 +), nøytrofile celler (CD45 + Ly6G +), dendrittiske celler (CD45 + CD11c +), og NK-celler (CD45 + CD49b +) ble gated innen det totale-leukocytt-port ( CD45 +). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. nøytrofile, makrofager og T-celler i murine vev ved maternal-føtal grensesnitt. Nøytrofiler (CD45 + Ly6G +), makrofager (CD45 + F4 / 80 +), og T-celler (CD45 + CD3 +) ble gated innenfor levedyktighet og total-leukocytter (CD45 +) portene i isolerte decidual, livmor, og placenta celler.tps: //www.jove.com/files/ftp_upload/52866/52866fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. gating strategi for lymfocytter. Mononukleære celler ble gated innenfor singleter og levedyktighet porter. T-celler (CD3 +) og B-celler (B220 +) ble gated innenfor levedyktighet porten. CD4 + og CD8 + T-celler ble inngjerdet i T-celle gate (CD3 +). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7
Figur 7. Lymfocytt sub-populasjoner i murine vev ved maternal-føtal grensesnitt. T-celler (CD3 +)og B-celler (B220 +) ble gated i levedyktighet porten i isolert decidual, livmor, og placenta-celler. CD4 + og CD8 + T-celler ble inngjerdet i T-celle gate (CD3 +). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Cellemarkør Fluorochrome Clone Selskap Katalognummer
LIVE / DEAD DAPI - Life Technologies L23105
CD45 V450 30-F11 BD Biosciences 560501
CD3 FITC 145-2C11 BD Biosciences 553062
CD4 APC RM4-5 BD Biosciences 553051
CD8 PE-CF594 53 til 6,7 BD Biosciences 562283
B220 APC-Cy7 RA3-6B2 BD Biosciences 552094
F4 / 80 PE BM8 eBiosciences 12-4801-82
Ly6G APC-Cy7 1A8 BD Biosciences 560600
CD49b APC DX5 BD Biosciences 560628
CD11c PE-Cy7 HL3 BD Biosciences 558079

Tabell 1. Liste over antistoffer benyttes for leukocytter undergruppe immunfenotyping

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Samlingen av konsistente data som registrerer overflod og fenotypiske egenskaper ved infiltrere leukocytter ved maternal-føtal grensesnittet er avgjørende for å forstå patogenesen av svangerskapsrelaterte komplikasjoner. Flere teknikker har blitt beskrevet som lette isolering av infiltrerende leukocytter fra murine vev ved maternal-føtal grensesnitt gjennom hele svangerskapet 31,38,39,43-46. Men hver teknikk er forskjellig, bruker ulike enzymer eller enzym kombinasjoner, krever forskjellige dissosiasjon ganger, spesifiserer ikke mengder av vev, og viktigst av alt, ikke alltid angi levedyktighet av isolerte celler. Protokollen er beskrevet her gjør at isolering av infiltrerende leukocytter fra murine vev ved maternal-føtal grensesnitt med høy levedyktighet, og gir detaljert informasjon om de kommersielle reagenser, buffer forberedelse, vev mengder, og inkubasjonstider validert ilaboratorium.

En av de mest kritiske trinn av leukocytt isolasjonsprosess er vevet dissosiasjon; Dette trinn innebærer mekanisk homogenisering og / eller enzymatiske reaksjoner som kan forandre integriteten av ekstracellulære proteiner som brukes i fenotypisk karakteriser 47. Protokollen er beskrevet her gir en ny fremgangsmåte som kombinerer bruk av milde mekaniske og enzymatiske vev dissosiasjon teknikker for å bevare integriteten til ekstracellulære markører i leukocytter isolert fra placenta og Deciduale og uterusvev fra mus.

Enkelt enzymer og kombinasjoner av ulike enzymer har blitt brukt til å isolere infiltrere leukocytter fra murine vev ved maternal-føtal grensesnitt 31,32,39,44. I mange tilfeller kan disse enzymene som er forberedt til bestemte konsentrasjoner for hånd i laboratoriet være gjenstand for menneskelige feil. Her, i stedet en klar-til-bruk renset collagenase / nøytral-protlette cocktail, Accutase, har blitt gjennomført i laboratoriet; som et kommersielt tilgjengelig enzympreparat, har det vist seg å gi pålitelige resultater i cellekultur 48. Denne enzymatiske løsning er kjent for effektivt å løsne makrofager fra kulturplatene uten skraping og, viktigst, uten å miste overflateantigener 48. Denne klare for enzymet har også blitt brukt til å behandle fordøyelse av humane og animalske vev fra nervesystemet, noe som resulterer i levedyktige isolerte celler som forblir bærekraftig i lange perioder, noe som tillater deres etterfølgende kultur 47. Dessuten bevarer denne enzymatisk løsning CD24 antigenevne i isolerte celler fra sentralnervesystemet vev 47. Sammenlignet med Liberase-1, en annen cocktail av kollagenase og nøytral protease, verken Accutase heller Liberase-en generere frie DNA-aggregater; men er Accutase mildere enn Liberase-en under vev dissosiasjon 47. Den collage / nøytral protease cocktail brukt i denne protokollen har også vist overlegenhet til trypsin i bevaringen av CD44, en kreftstamcelle overflate markør 49. Denne laboratoriestudier har konsekvent bemerket at dette enzymatisk løsning bevarer muse leukocyttpopulasjoner overflateantigener. Faktisk har informative forskjeller ble funnet i uttrykket av ekstracellulære markører i makrofager (CD11b + F4 / 80 + -celler), neutrofiler (CD11b + Ly6G + -celler), NKT-celler (CD3 + CD49b + celler), T-celler (CD3 + -celler) og B celler (B220 + CD19 + celler), inkludert CD4, CD8, CD69, CD25, CD40L, PD1, CD44, CD62L, og CTLA4, og i cytokinfrigjøring. Derfor er metoden som er beskrevet heri er optimal for immunfenotyping av infiltrerende leukocytter ved mor til foster grensesnitt i mus, som vist i de representative resultater.

En viktig fordel med denne metoden er samtidig bestemmelse av flere ekstracellulære og intracellulære antigener innenfor levedyktighet porten. Fargestoffet mest brukt til å deTermine celleviabilitet er propidiumjodid (PI); Imidlertid er dets bruk begrenset, siden det kan brukes i kombinasjon med FITC. Dette er fordi PI ikke kan være tilstrekkelig skilles fra de fleste andre fluorokromer opphisset av blå og røde lasere 50. En løsning er å bruke DAPI 50 eller hvilken som helst annen farge som er eksitert ved hjelp av UV-lasere, men ikke av blå og røde lasere som vanligvis anvendes for immunfenotyping. Denne protokollen tillater immunfenotyping av levedyktige celler som den omfatter bruk av DAPI 50 for unfixable celler eller bruk av levedyktighet fargestoff for låses celler.

En annen viktig fordel ved den protokoll som er beskrevet heri, er at det tillater isolering av leukocytter med et høyt utbytte av levedyktige celler. Den representative data viser at 70% til 89% av de isolerte cellene er levedyktige. Dette er av stor betydning da denne protokollen har tillatt studiet av de funksjonelle egenskaper av de isolerte celler fra murine vev på fra mor til foster grensesnitt. Feller f.eks kulturer av Deciduale og livmor makrofager og studiet av cytokin versjonen under stimulering er utført ved hjelp av denne metoden.

For å oppnå et godt resultat, er anvendelsen av den beskrevne protokoll viktig ved vurdering av følgende faktorer: 1) vevssamling må utføres i løpet av 5 til 10 minutter etter åpning av bukhulen, og disse vev må plasseres på is for å opprettholde levedyktigheten de isolerte celler; 2) mekaniske vev homogenisering må utføres ved hjelp av fin-spiss saks og kan ikke overstige 2 min siden lengre perioder har vist seg å redusere utbyttet av levedyktige celler; 3) varigheten av inkubasjon med enzymløsningen må være mindre enn 1 time, siden dens aktivitet avtar etter denne tidsperiode; 4) temperaturen av inkubasjon med den enzymatiske oppløsningen må holdes ved 37 ° C for å oppnå optimal aktivitet av denne blanding av enzymer; 5) cellepellet manipgler må gjøres forsiktig med mikropipetter grunn bruk av virvelen kan ødelegge integriteten av cellene (isolerte celler er differensiert og brå manipulering kan lett redusere deres levedyktighet); 6) buffer og sentrifugeres temperatur må holdes på samme temperatur som den cellesuspensjon; 7) isolerte celler må behandles for immunfenotyping eller brukes umiddelbart som sin levedyktighet reduserer raskt; og 8) når du utfører immunfenotyping, prøvene må anskaffes ved hjelp av et strømningscytometer umiddelbart for best resultat.

En begrensning av denne protokollen er kostnaden for den enzymatiske løsning, som er mer kostbare enn andre enzymer med lignende funksjoner, for eksempel trypsin, dispase II og kollagenase. Men fordelene som dette enzymatisk løsning viser utover de beskrevne enzymer er overlegen.

Foruten immunfenotyping og cellekultur og sortering, de fremtidige anvendelser av denne protokollen er numerous og variert. For eksempel er det nå mulig å bestemme DNA-metylering, ekspresjon av målgener, in vitro leukocytt-funksjonalitet (f.eks, fagocytose, cytotoksisitet T-celleproliferasjon og plastisitet analyser, etc.), og produksjon av reaktive oksygenarter i isolerte leukocytter fra murine vev på mors fetal grensesnittet. Faktisk kan beskrivelse av nye og sjeldne leukocytter i murine vev ved maternal-føtal grensesnittet skal også utføres.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne avslører ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

NGL ble støttet av Wayne State University Perinatal Initiative i Maternal, Perinatal and Child Health. Vi ønsker å takke for Maureen McGerty og Amy E. Furcron (Wayne State University) for deres kritisk lesing av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Magentic Cell Separation
MS Columns Militenyi Biotec 130-042-201
Cell Separator Militenyi Biotec 130-042-102
30 μm pre-separation filters Militenyi Biotec 130-041-407
Multistand Militenyi Biotec 130-042-303
15 ml conical tubes Thermo Fisher 339650
MACS Buffer Militenyi Biotec Laboratory preparation (0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1x PBS, pH 7.2)
Reagents
Accutase enzymatic solution Life Technologies A11105-01
Anti-mouse CD16/CD32 BD Biosciences 533142
Anti-mouse extracellular antibodies BD Bioscences/eBiosciences Table 1
Sodium azide Fisher S227-500
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7906-100G
LIVE/DEAD viability dye Life Technologies L23105
Fixation buffer solution BD Biosciences 558049
FACS Buffer BD Biosciences Laboratory preparation 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 1x PBS, pH 7.4
Trypan blue solution 0.4% BIO-RAD 145-0013
Fetal bovine serum (FBS) Life Technologies 16000-044
Additional Instruments
Incubator with shaker Thermo Scientific MaxQ 4450
Flow cytometer BD LSRFortessa
Centrifuge Thermo Scientific Legend LXTR
Vacuum system laboratory constructed
Incubator Thermo Scientific Incubator 3307
Water bath Precision 51221035
Cell counter BIO-RAD TC20 Automated Cell Counter
Optical and fluorescence microscopes Zeiss and Olympus Zeiss LSM780 and Olympus CKX41

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trowsdale, J., Betz, A. G. Mother's little helpers: mechanisms of maternal-fetal tolerance. Nat Immunol. 7 (3), 241-246 (2006).
  2. King, A., et al. Evidence for the expression of HLAA-C class I mRNA and protein by human first trimester trophoblast. J Immunol. 156 (6), 2068-2076 (1996).
  3. Bonney, E. A., Matzinger, P. The maternal immune system's interaction with circulating fetal cells. J Immunol. 158 (1), 40-47 (1997).
  4. Tafuri, A., Alferink, J., Moller, P., Hammerling, G. J., Arnold, B. T cell awareness of paternal alloantigens during pregnancy. Science. 270 (5236), 630-633 (1995).
  5. Chaouat, G., Petitbarat, M., Dubanchet, S., Rahmati, M., Ledee, N. Tolerance to the foetal allograft. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 624-636 (2010).
  6. Robertson, S. A., et al. Seminal fluid drives expansion of the CD4+CD25+ T regulatory cell pool and induces tolerance to paternal alloantigens in mice. Biol Reprod. 80 (5), 1036-1045 (2009).
  7. Robertson, S. A., Moldenhauer, L. M. Immunological determinants of implantation success. Int J Dev Biol. 58 (2-4), 205-217 (2014).
  8. Aluvihare, V. R., Kallikourdis, M., Betz, A. G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat Immunol. 5 (3), 266-271 (2004).
  9. Rowe, J. H., Ertelt, J. M., Xin, L., Way, S. S. Pregnancy imprints regulatory memory that sustains anergy to fetal antigen. Nature. 490 (7418), 102-106 (2012).
  10. Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict. Cell. 150 (1), 29-38 (2012).
  11. Saito, S., Sakai, M., Sasaki, Y., Nakashima, A., Shiozaki, A. Inadequate tolerance induction may induce pre-eclampsia. J Reprod Immunol. 76 (1-2), 30-39 (2007).
  12. Lee, J., et al. A signature of maternal anti-fetal rejection in spontaneous preterm birth: chronic chorioamnionitis, anti-human leukocyte antigen antibodies, and C4d. PLoS One. 6 (2), 0016806 (2011).
  13. Steinborn, A., et al. Pregnancy-associated diseases are characterized by the composition of the systemic regulatory T cell (Treg) pool with distinct subsets of Tregs. Clin Exp Immunol. 167 (1), 84-98 (2012).
  14. Gomez-Lopez, N., Laresgoiti-Servitje, E. T regulatory cells: regulating both term and preterm labor. Immunol Cell Biol. 90 (10), 919-920 (2012).
  15. Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. A., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol. 23 (10), 46 (2014).
  16. Romero, R., Dey, S. K., Fisher, S. J. Preterm labor: one syndrome, many causes. Science. 345 (6198), 760-765 (2014).
  17. Gomez-Lopez, N., Guilbert, L. J., Olson, D. M. Invasion of the leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy. J Leukoc Biol. 88 (4), 625-633 (2010).
  18. Timmons, B., Akins, M., Mahendroo, M. Cervical remodeling during pregnancy and parturition. Trends Endocrinol Metab. 21 (6), 353-361 (2010).
  19. Arck, P. C., Hecher, K. Fetomaternal immune cross-talk and its consequences for maternal and offspring's health. Nat Med. 19 (5), 548-556 (2013).
  20. Erlebacher, A. Immunology of the maternal-fetal interface. Annu Rev Immunol. 31, 387-411 (2013).
  21. Wambach, C. M., Patel, S. N., Kahn, D. A. Maternal and fetal factors that contribute to the localization of T regulatory cells during pregnancy. Am J Reprod Immunol. 71 (5), 391-400 (2014).
  22. Cross, J. C., Werb, Z., Fisher, S. J. Implantation and the placenta: key pieces of the development puzzle. Science. 266 (5190), 1508-1518 (1994).
  23. Georgiades, P., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Comparative developmental anatomy of the murine and human definitive placentae. Placenta. 23 (1), 3-19 (2002).
  24. Croy, B. A., et al. Imaging of vascular development in early mouse decidua and its association with leukocytes and trophoblasts. Biol Reprod. 87 (5), (2012).
  25. Hofmann, A. P., Gerber, S. A., Croy, B. A. Uterine natural killer cells pace early development of mouse decidua basalis. Mol Hum Reprod. 20 (1), 66-76 (2014).
  26. Lima, P. D., Zhang, J., Dunk, C., Lye, S. J., Anne Croy, B. Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy. Cell Mol Immunol. , (2014).
  27. Robson, A., et al. Uterine natural killer cells initiate spiral artery remodeling in human pregnancy. FASEB J. 26 (12), 4876-4885 (2012).
  28. Lash, G. E., et al. Regulation of extravillous trophoblast invasion by uterine natural killer cells is dependent on gestational age. Hum Reprod. 25 (5), 1137-1145 (2010).
  29. Kruse, A., Merchant, M. J., Hallmann, R., Butcher, E. C. Evidence of specialized leukocyte-vascular homing interactions at the maternal/fetal interface. Eur J Immunol. 29 (4), 1116-1126 (1999).
  30. Degaki, K. Y., Chen, Z., Yamada, A. T., Croy, B. A. Delta-like ligand (DLL)1 expression in early mouse decidua and its localization to uterine natural killer cells. PLoS One. 7 (12), 28 (2012).
  31. Habbeddine, M., Verbeke, P., Karaz, S., Bobe, P., Kanellopoulos-Langevin, C. Leukocyte Population Dynamics and Detection of IL-9 as a Major Cytokine at the Mouse Fetal-Maternal Interface. PLoS One. 9 (9), (2014).
  32. Blaisdell, A., Erlbacher, E. Ch. 53. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. Yamada, A. T., Croy, B. A., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. , Elsevier Academic Press. 619-635 (2014).
  33. Rinaldi, S. F., Catalano, R. D., Wade, J., Rossi, A. G., Norman, J. E. Decidual neutrophil infiltration is not required for preterm birth in a mouse model of infection-induced preterm labor. J Immunol. 192 (5), 2315-2325 (2014).
  34. Plaks, V., et al. Uterine DCs are crucial for decidua formation during embryo implantation in mice. J Clin Invest. 118 (12), 3954-3965 (2008).
  35. Parr, E. L., Szary, A., Parr, M. B. Measurement of natural killer activity and target cell binding by mouse metrial gland cells isolated by enzymic or mechanical methods. J Reprod Fertil. 88 (1), 283-294 (1990).
  36. Arck, P. C., et al. Murine T cell determination of pregnancy outcome. Cell Immunol. 196 (2), 71-79 (1999).
  37. Male, V., Gardner, L., Moffett, A. Isolation of cells from the feto-maternal interface. Curr Protoc Immunol. 7 (7), 1-11 (2012).
  38. Li, L. P., Fang, Y. C., Dong, G. F., Lin, Y., Saito, S. Depletion of invariant NKT cells reduces inflammation-induced preterm delivery in mice. J Immunol. 188 (9), 4681-4689 (2012).
  39. Collins, M. K., Tay, C. S., Erlebacher, A. Dendritic cell entrapment within the pregnant uterus inhibits immune surveillance of the maternal/fetal interface in mice. J Clin Invest. 119 (7), 2062-2073 (2009).
  40. Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Mol Reprod Dev. 75 (5), 818-827 (2008).
  41. Zhang, P., Wu, X., Hu, C., Wang, P., Li, X. Rho kinase inhibitor Y-27632 and Accutase dramatically increase mouse embryonic stem cell derivation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 48 (1), 30-36 (2012).
  42. Pang, S. C., Janzen-Pang, J., Tse, Y., Croy, B. A. Ch. 2. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. Yamada, A. T., Croy, B. A., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. , Elsevier Academic Press. 21-42 (2014).
  43. Zenclussen, A. C., et al. Murine abortion is associated with enhanced interleukin-6 levels at the feto-maternal interface. Cytokine. 24 (4), 150-160 (2003).
  44. Mallidi, T. V., Craig, L. E., Schloemann, S. R., Riley, J. K. Murine endometrial and decidual NK1.1+ natural killer cells display a B220+CD11c+ cell surface phenotype. Biol Reprod. 81 (2), 310-318 (2009).
  45. Addio, F., et al. The link between the PDL1 costimulatory pathway and Th17 in fetomaternal tolerance. J Immunol. 187 (9), 4530-4541 (2011).
  46. Shynlova, O., et al. Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling. J Cell Mol Med. 17 (2), 311-324 (2013).
  47. Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
  48. Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. , 670-672 (2014).
  49. Quan, Y., et al. Impact of cell dissociation on identification of breast cancer stem cells. Cancer Biomark. 12 (3), 125-133 (2012).
  50. Gordon, K. M., Duckett, L., Daul, B., Petrie, H. T. A simple method for detecting up to five immunofluorescent parameters together with DNA staining for cell cycle or viability on a benchtop flow cytometer. J Immunol Methods. 275 (1-2), 113-121 (2003).

Tags

Immunologi decidua dissosiasjon Isolation leukocytter myometriet Placenta Graviditet Livmor
Isolering av leukocyttene fra Murine Vev på Maternal Fetal Interface
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arenas-Hernandez, M.,… More

Arenas-Hernandez, M., Sanchez-Rodriguez, E. N., Mial, T. N., Robertson, S. A., Gomez-Lopez, N. Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface. J. Vis. Exp. (99), e52866, doi:10.3791/52866 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter