Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Isolering av leukocyter från Murina vävnader på Maternal-Fetal Interface

Published: May 21, 2015 doi: 10.3791/52866
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1,3,4
1Department of Obstetrics & Gynecology, Wayne State University School of Medicine, 2School of Paediatrics and Reproductive Health, Research Centre for Reproductive Health, the Robinson Research Institute, The University of Adelaide, 3Department of Immunology & Microbiology, Wayne State University School of Medicine, 4Perinatology Research Branch, NICHD/NIH/DHHS

Abstract

Immun tolerans under graviditet kräver att immunsystemet hos modern genomgår distinkta förändringar för att acceptera och vårda det växande fostret. Denna tolerans initieras under samlag, etablerades under befruktning och implantation, och underhållas under hela graviditeten. Aktiva cellulära och molekylära mediatorer av moder till foster tolerans berikas på platsen för kontakt mellan foster och moderns vävnader, känd som moder till foster gränssnitt, som omfattar moderkakan och livmoder och decidual vävnader. Detta gränssnitt består av stromaceller och infiltrerande leukocyter och deras förekomst och fenotypiska egenskaper förändras under loppet av graviditeten. Infiltrerande leukocyter på moder och foster gränssnitt inkluderar neutrofiler, makrofager, dendritiska celler, mastceller, T-celler, B-celler, NK-celler och NKT-celler som tillsammans skapar den lokala mikromiljön som upprätthåller graviditet. En obalans mellan dessa celler eller någon inappropriate förändring i sina fenotyper betraktas som en mekanism av sjukdom under graviditet. Därför är nödvändig för att klarlägga de immunmekanismer som leder till graviditetsrelaterade komplikationer studiet av leukocyter som infiltrerar den moder och foster gränssnitt. Beskrivet häri är ett protokoll som använder en kombination av försiktig mekanisk dissociation följt av en robust enzymatisk uppdelning med ett proteolytiskt och kollagenolytisk enzymcocktail för att isolera de infiltrerande leukocyter från de murina vävnader vid moder och foster gränssnitt. Detta protokoll möjliggör för isolering av ett stort antal viabla leukocyter (> 70%) med tillräckligt konserverade antigeniska och funktionella egenskaper. Isolerade leukocyter kan sedan analyseras av flera tekniker, innefattande immunfenotypning, cellsortering, avbilda, immunoblotting, mRNA-uttryck, cellkultur och in vitro funktionella analyser såsom blandade leukocyt reaktioner, spridning eller cytotoxicitetsanalyser.

Introduction

Immun tolerans under graviditeten är en period då distinkta förändringar inom immunsystemet hos modern. Dessa förändringar gör det möjligt för mamman att tolerera fostret, en semi-allogent transplantat 1. Fostret uttrycker fader större histokompatibilitetskomplex (MHC) -antigener 2, och fetala celler har hittats i moderns cirkulation 3; dock fostret inte avvisas 4,5. Denna gåta är inte helt klarlagd.

Den senaste hypotesen säger att moder till foster tolerans skapas under samlag och betäckning 6,7 och underhållas för att upprätthålla en fullgången graviditet 8-10. En uppdelning av denna moder till foster tolerans betraktas som en mekanism av sjukdom under tidiga och sena stadier av graviditeten 10-16. Moder till foster tolerans omfattar deltagande av olika leukocytpopulationer delpopulationer, inklusive T-celler (reglerande T-celler, Th1-celler, Th2-celler och Th17-celler), macrophages, neutrofiler, mastceller, NK-celler, och NKT-celler, dendritiska celler och B-celler, som förändring i densitet och lokalisering under hela graviditeten 15,17-19. Moder till foster tolerans berikas på moder och foster gränssnitt 20 - den anatomiska plats där immunsystemet hos modern interagerar med de fetala antigener 20,21.

Den moder till foster gränssnitt skapas under placentation när foster extravillous trofoblastceller invaderar livmoderslemhinnan 22-24. På fostrets sidan av detta gränssnitt, de membran som omger fostret skapa en specialiserad epitelyta i moderkakan, och syncytiotrofoblast cellerna styr närings utbyte genom sin direktkontakt med moderns blod 22. På mödernet av gränssnittet, rekryterar decidua en heterogen grupp av leukocyter som i möss står för 30% till 50% av alla decidual celler. Förutom deras deltagande i Maternal immuntolerans, dessa celler är viktiga bidragsgivare till olika processer under graviditeten, t ex., skydd av reproduktionsorganen från infektioner, befruktning, embryoimplantation 7,25, decidual angiogenes 26, kärlremodellering 24,27, trofoblast invasion 28, placenta utveckling 24,25, och i slutändan, förlossning 15,17. Därför, är avgörande för att belysa patogenesen av graviditetsrelaterade komplikationer studiet av de leukocyter som är inblandade i moder till foster tolerans.

Även om användningen av immunohistokemi och immunofluorescens har genererat data för den direkt visualisering och lokalisering av livmoder, decidual eller moderkakan leukocyter 29,30, flödescytometrianalys har ytterligare avslöjat specifika undergrupper av leukocyter i vart och ett av dessa vävnader 31,32. Dessutom flödescytometri har använts för att bestämma densitet och andelen maternal-fetal gränssnitt leukocyter 33 och uttrycksnivåer av extracellulära och intracellulära proteiner 8-10,34. Flödescytometrisk analys av leukocyter vid moder och foster gränssnitt kräver en enkelcellsuspension. För att isolera infiltrerande leukocyter från decidual, livmoder och moderkakan vävnad, har två metoder för vävnadsdissociering använts: mekanisk och enzymatisk. Båda metoderna tillåter separation av infiltrerat leukocyter från den extracellulära matrisen (ECM) av dessa vävnader. Enzymatisk vävnadsdissociering är överlägsen mekanisk vävnadsdissociering eftersom det ger ett högre utbyte av leukocyter med mindre skärkraft associerade skada 35. Därför kräver mekanisk vävnadsdissociering sammanslagning vävnader 36, vilket kan öka variationen och heterogenitet av proverna. Ändå kan mekanisk dissociering vara valet när antigenet av intresse kan förändras genom enzymatisk dissociation eller när funktionaliteten hos cellens av intresse måste bevaras (till exempel., cytotoxiciteten hos NK-celler) 35.

Användningen av proteolys med specifika enzymer för att bryta ner ECM eliminerar de låga räntorna som observerats med mekanisk dissociation. Flera studier har rapporterat användning av trypsin 32, kollagenas 37, DNas 31 dispas 38, och kommersiella cocktails av olika enzymer 32,39. Dock måste arten och koncentrationen av olika enzymer och varaktigheten av matsmältningen vara noggrant definieras och valideras för att säkerställa upprätthållandet av integriteten hos cellytan antigenepitoper krävs för immunfenotypning. De olika ytstrukturer är differentiellt känsligt för nedbrytning av olika enzymer, med vissa enzymer, såsom trypsin, är ökända för stripp leukocyt Ytan epitoper som känns igen av många monoklonala antikroppar.

Infört häri är en metod som använder en proteolytic och kollagenolytisk enzymatisk cocktail, kallas Accutase. Denna enzymatisk lösning är skonsam nog samtidigt effektivt dissociera murina vävnader på moder och foster gränssnitt och kräver inte tillsats av andra dissocierande reagens eller serum för att avsluta dissociationsreaktionen. Dessutom är den klar att användas vid leverans och även om tidpunkten för dissociation måste valideras, det är mer robust än de ovan nämnda enzymer 40,41.

Utnyttjandet av en kombination av båda typerna av vävnad disaggregering förbättrar kvaliteten och mängden av celler som erhållits; alltså, har flera studier genomförts den kombinerade användningen av mekanisk och enzymatisk dissociation med tillfredsställande resultat 31,32,37. Protokollet som beskrivs häri bildades och validerats i vårt laboratorium; den använder en kombination av en mild mekanisk dissociation följt av en robust enzymatisk uppdelning. Detta protokoll möjliggör isolering och ytterligare studier avde infiltrerande leukocyter i murina vävnader på moder och foster gränssnitt (livmodern, decidua, och placenta). Följande protokoll har även integritet markörer och ger tillräckligt levande celler för tillämpningar efter cellytan, vilket framgår av flödescytometrisk analys. Slutligen vidhåller detta protokoll konsekvens av cellberedningen för analys och jämförelse av olika murina vävnader som bildar moder och foster gränssnitt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Innan du arbetar med de prover som nämns i detta protokoll, måste djur etiskt godkännande ges av den lokala forskningsetiska kommittén och institutionella prövningsnämnder. När du arbetar med djurblod, celler, eller farliga medel som nämns i detta protokoll, måste de rätta biosäkerhet och laboratorie säkerhetsåtgärder följas.

1. Mus Hantering och Tissue Collection

  1. Förbered en steril arbetsstation och få sterila verktyg för vävnadssamling. Dessa verktyg kommer att omfatta stora och små kirurgiska saxar, tänger och fin spets pincett. Innefatta små petriskålar märkta med lämpliga vävnadsnamnen, fylld med 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) lösning (3-5 ml) jämviktad till RT (20-22 ° C). Också innehålla en stor petriskål, omärkt, fylld med 1x PBS-lösning (10-15 ml).
  2. Euthanize en gravid mus (10,5-19,0 ​​dagar efter coitum (DPC) eller före leverans) med användning av koldioxid (CO 2). För att säkerställa att musen avlivas, använda halsdislokation tekniken.
    Obs: Före 10,5 DPC, är det svårt att manuellt separera decidual vävnader från livmodervävnad. Om isoleringen av decidual leukocyter inte krävs, leukocyter från livmoder vävnader icke-gravida möss eller de från möss vid <10,5 DPC kan också utföras genom att följa detta protokoll.
  3. Användning av ett par av sterila kirurgiska saxar, helt ta bort den nedre delen av buken del av huden och muskelvävnaden. Med pincett, flytta undan alla andra organ tills livmodern och äggstockarna är synliga. Med livmodern fortfarande sitter använder pincett för att flytta den utanför bukhålan (figur 1A).
  4. Leta reda på äggstockarna distala till äggledaren och uterotubal korsningen av varje livmoderhorn. Med hjälp av små kirurgiska saxar, gör ett snitt på uterotubal korsningen och separera livmoderhornen från tarmkäxet innehåller livmodern fartyg; sedan,punkt vid livmoderhalsen för att lösgöra livmoderhornen från peritonealhålan (Figur 1B).
  5. Med små kirurgiska saxar, göra ett snitt mellan livmoderhalsen och det undre segmentet av livmoderhornen. Lämna fäst en del av livmoderhalsen under denna process (Figur 1C) för att undvika att öppna livmoderhornet.
  6. Doppa livmoderhornen (inklusive cervix) i en stor petriskål fylld med 1x PBS-lösning (10-15 ml) för att hydratisera implantationsställen.
  7. Medan han fortfarande nedsänkt i 1x PBS-lösning, trimma något fett från livmoderhornen med små kirurgiska saxar. Håll vävnader nedsänkta i 1x PBS-lösning under hela dissekering.
  8. Håll i livmoderhornen på plats med pincett, ta bort en av de implantationsställen från livmodern med en tvären genom mellan implantation region med små kirurgiska sax (Figur 1D). Implantationsstället innehåller fostret, omgiven av denkorioallantoismembranet och livmoder, decidual och moderkakan vävnad.
  9. Med hjälp av pincett, hålla platsen på plats och gör ett litet snitt i livmoderväggen intill placenta och decidual vävnader (Figur 1E). Trimma i ytterkanten av moderkakan / decidua tills dessa blir skild från både livmoderväggen och korioallantoinmembranet som innehåller fostret (figur 1F).
  10. Ta bort moderkakan och bifogade decidual vävnader och plats i 1x PBS-lösning (3 - 5 ml, se steg 1,12).
  11. Placera fostret omgiven av korioallantoinmembranet fäst livmodervävnader i en petriskål fylld med 1x PBS-lösning (3-5 ml). Hydratiseringen av dessa vävnader kommer att underlätta separationen av korioallantoinmembranet från livmoderväggen (se steg 1,14).
  12. Med hjälp av ett par av fin spets pincett, dra försiktigt decidual vävnad (vit-grå skikt) från moderkakan ytan. Utför dennasteg noggrant för att upprätthålla integriteten i moderkakan och decidual vävnader (figur 1G).
  13. Placera moderkakan och decidual vävnader i två separat märkta petriskålar fyllda med 1x PBS-lösning (3 - 5 ml vardera).
  14. Ta försiktigt bort livmoderväggen från korioallantoinmembranet med fin spets pincett. Dessa är livmoderns vävnader.
  15. Placera livmodervävnader i en petriskål fylld med 1x PBS-lösning (3-5 ml).
  16. Upprepa steg 1,8 till 1,15 tills alla implantationsställen har behandlats.
  17. Samla flera livmoder, decidual och placenta-vävnader för att förbättra utbytet av celler under enzymatisk nedbrytning. Mängden vävnader beror på kullstorlek; kräver emellertid leukocyter isolering> 2 bitar av vävnad.
    Obs: För mer detaljerad information om dissektion av implantationsställen på olika graviditets dagar, se bilderna som finns i kapitel två av handboken till Investigatipå Mus Graviditet 42.

2. livmoder-, decidual och Placental vävnadsdissociering

  1. Etikett flera sterila 2 ml koniska rör med lämplig vävnad namn, och placera en flaska med 1.000 il enzymatisk lösningen på is.
  2. Från petriskål fylld med 1x PBS-lösning, överföra två bitar (100-150 mg) av livmoder, decidual eller placental vävnad till en märkt 2 ml koniskt rör.
  3. Tillsätt 500 l kall enzymatisk lösning i varje 2 ml koniska rör.
  4. Med fina steril sax, börjar att dissociera vävnaden nedsänkt i den enzymatiska lösningen tills det är fint malet. Med tiden kommer suspensionen utveckla ett mjölkaktigt utseende. Detta steg bör inte överskrida mer än 2 min för att förhindra över manipulering av provet.
  5. När vävnad har skiljas, extra till 500 pl kall enzymatisk lösning på 2 ml koniska rör.
  6. Placera 2 ml koniska rör på is.
  7. Upprepa steg 2.2 till 2.6 med varje enskild vävnad tills alla vävnader har behandlats.
  8. Överför alla 2 ml koniska rör med homogeniserad vävnad (malet vävnad + enzymatisk lösning) prover från isen i en inkubator vid 37 ° C och utföra en mild orbital omrörning (80 rpm). Inkubera under 30-35 min. Se till att temperaturen i inkubatorn stabiliseras innan inkubationstiden.
  9. Efter inkubation, ta bort de 2 ml koniska rör med dissocierade vävnader från inkubatorn och placera dem på is för att förhindra ytterligare nedbrytning.
  10. Märk sterila 50 ml koniska rör enligt vävnadstyp. Ta bort locken och ersätta dem med en steril cell sil (100 pm porstorlek).
  11. Häll dissocierade vävnader från 2 ml koniska rör genom cell sil med hjälp av ~ 20 ml 1x PBS-lösning. Fragmenten av vävnad stannar kvar i cellfilter och cellsuspensionen kommer att passera genom den.
  12. Tvätta dissociated vävnader i cellfilter 2-3 gånger med 20 ml 1 x PBS-lösning med användning av en överföringspipett.
  13. Skölj tomma 2 ml koniska rör med 1x PBS-lösning (1 ml) och häll innehållet genom cell silar.
  14. Ta bort cell silar från 50 ml koniska rör och ersätta locken. Centrifugera rören vid 1250 xg under 10 min vid 4 ° C.
  15. Försiktigt, aspirera supernatanten utan att störa cellpelleten. Cellpelleten innehåller de isolerade leukocyter och stromaceller.
  16. Återsuspendera cellpelleten i 1 ml RPMI-odlingsmedium utan fetalt bovint serum (FBS). Blanda försiktigt. Använd inte virvel.
  17. Tillsätt 500 l av fiffiga FBS till en 5 ml polystyren plaströr och långsamt överlagra cellsuspensionen.
  18. Centrifugera i 10 minuter vid 1100 x g utan bromsen vid RT för att pelle viabla celler medan cellrester kvarhålles vid PBS / FBS-gränssnittet.
  19. Aspirera supernatanten utan att röra cellpelleten. Den cell pelleten innehåller mest livskraftiga celler.
  20. Eventuellt: Att koncentrera mononukleära celler, använder en 20% mättad polysackaridlösning, som beskrivs nedan.
    1. Resuspendera cellpelleten i 1000 | il RPMI odlingsmedium utan FBS.
    2. Tillsätt 1 ml 20% mättad polysackarid lösning till en 5 ml polystyren plaströr och långsamt överlagra cellsuspensionen på toppen av denna lösning, i enlighet med tillverkarens instruktioner. Medan skiktning provet undvika att blanda 20% mättad polysackaridlösning med cellsuspensionen.
    3. Centrifugera med en swing-out-rotor vid 500 xg under 30 min vid RT utan broms. Det är mycket viktigt att stänga av bromsen för att undvika blandning av cellerna och förlora gradienten. Mononukleära celler kommer att finnas i gränsytan mellan 20% mättad polysackaridlösning och 1x PBS-lösning.
    4. Aspirera och kassera supernatanten. Cellpelleten innehåller mest mononukleära celler.
      Nejte: För att utföra viabilitetsfärgning och intracellulär färgning, se steg 3. Om du vill utföra immunfenotypning, se steg 4. För att utföra viabilitetsfärgning och endast extracellulära färgning, se steg 5. För att utföra en cellkultur av isolerade leukocyter, se steg 6. Om du vill utföra magnetisk cellsortering, se steg 7.

3. viabilitetsfärgning för fixerbart Celler

  1. Resuspendera cellpelleten i 1.100 il 1x PBS-lösning. Blanda försiktigt med en mikro-pipett.
  2. Överför 100 | j, l av cellsuspensionen i en 5 ml polystyren plaströr. Lägg 400 ^ il 1 x PBS-lösning till 5 ml polystyrenrör. Detta rör är en kontroll för vävnadsauto fluorescens. Förvara vid 4 ° C tills steg 3,5.
  3. Överför återstående 1.000 il av cellsuspensionen till en ny 5 ml polystyren plaströr. Tillsätt 1 pl av livskraft färgämne och försiktigt homogenisera. Inkubera i 30 minuter i mörker vid 4 ° C.
  4. Efter inkubation, tillsätt 1000 & #181; il av 1 x PBS-lösning. Blanda försiktigt för hand.
  5. Centrifugera båda 5 ml polystyren plaströr (steg 3,2 och 3,3) vid 1250 xg under 10 minuter vid 4 ° C. Aspirera och kassera supernatanten.
    Obs: Cellpelleten (steg 3,3) kommer att användas i steg 4. Cellpelleten (steg 3,2) kommer att tjäna som en kontroll för vävnadsauto fluorescens.

4. immunfenotypning

  1. Resuspendera cellpelleten i 50 | il anti-mus CD16 / CD32 (utspädd 1: 100 i FACS-buffert [0,1% BSA, 0,05% natriumazid, 1 x PBS, pH 7,4]). Blanda cellsuspensionen försiktigt. Använd inte virveln.
  2. Inkubera cellsuspensionen i 5 ml polystyrenrör i mörker vid 4 ° C under 10 minuter.
  3. Efter inkubation, tillsätt 50 pl av varje anti-leukocyter monoklonal antikropp som reagerar med extracellulära cellytmarkörer eller isotypmatchad kontrollantikropp (spädantikropps måste valideras). Till exempel, för att analysera leukocyt delpopulationer, använda anti-moanvända antikroppar som reagerar med följande leukocyt-cellytmarkörer: CD45, Ly6G, F4 / 80, CD11c, CD49b, B220, CD3, CD4, och CD8 (tabell 1).
  4. När antikroppar mot extracellulära markörer har lagts till i 5 ml polystyren plaströr, blanda försiktigt. Inkubera i mörker under 30 min vid 4 ° C.
  5. Under denna inkubation, förbereda och pre-värma fixeringsbuffertlösning (utspädd med avjoniserat vatten, ett: 5) till 37 ° C, om så erfordras. Håll buffert vid 37 ° C i mörker tills dess användning är nödvändig.
  6. Efter 30 minuters inkubation, tillsätt 500 pl FACS buffert i 5 ml polystyren plaströr och blanda försiktigt. Det behövs detta steg för att tvätta cellerna och ta bort eventuellt överskott av obunden antikropp.
  7. Centrifugera proverna vid 1250 xg vid 4 ° C under 10 minuter. Aspirera och kassera supernatanten.
    Obs! Om intracellulär färgning inte krävs, se steg 5. Om intracellulär färgning krävs, utföra permeabilisering och intracellular färgning här, och sedan fortsätta med fixering (steg 4,8).
  8. Lägg 500 | il av det förvärmda fixering buffertlösning till cellpelleten och inkubera i mörker i 10 minuter vid 37 ° C.
  9. Fördela 500 pl FACS buffert i 5 ml polystyren plaströr. Blanda försiktigt.
  10. Centrifugera proverna vid 1250 xg vid 4 ° C under 10 minuter. Aspirera och kassera supernatanten.
  11. Lägg 500 | il FACS-buffert till varje prov. Dessa prover kan nu analyseras med flödescytometri. Förvärva proverna omedelbart för bästa resultat.

5. viabilitetsfärgning för orättbara celler

  1. Efter extracellulära immunfenotypning, resuspendera cellpelleten i 500 pl FACS buffert.
  2. Tillsätt 1 pl 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol dihydroklorid (DAPI, 200 mikrogram / ml) strax innan förvärva provet.
  3. Visualisera proverna inom 1 - 2 min efter tillsats av DAPI med hjälp av en flödescytometer.

  1. Förbered en arbetsstation under en steril dragskåp. Pre-värma RPMI odlingsmedium till 37 ° C med användning av ett vattenbad.
  2. Resuspendera cellpelleten i 1000 | il FACS-buffert för cellräkning.
  3. Räkna antalet viabla celler med användning av en automatisk cellräknare eller hemocytometer och 0,4% lösning av trypanblått, enligt tillverkarens instruktioner. Spela det totala antalet levande cell.
  4. Centrifugera cellerna vid 1250 xg vid 4 ° C under 10 minuter för avlägsnande av FACS buffert.
  5. Resuspendera cellpelleten i 500 | il förvärmd RPMI odlingsmedium genom att försiktigt pipettera 2 till 3 gånger.
  6. Plate det önskade antalet celler i en steril 24-brunnars platta och inkubera vid 37 ° C. Inkubationstiden kommer att bestämmas av den forskningsfråga.

7. Magnetisk cellsortering

  1. Inrätta en ren arbetsplats med följande ämnen: MS kolonner, magnetisk cellseparator, 15ml koniska rör, 30 pm pre-separationsfilter, och en multi-stativ.
  2. Resuspendera cellpelleten i 500 | il MACS-buffert (0,5% BSA, 2 mM EDTA, 1 x PBS-lösning, pH 7,2).
  3. Använda en automatisk cellräknare eller hemocytometer och 0,4% trypanblått lösning, räkna och registrera det totala antalet levande cell.
  4. Centrifugera cellerna vid 1250 xg vid 4 ° C under 10 minuter. Aspirera och kassera supernatanten. Lägg till ytterligare 500 pl MACS-buffert.
  5. Fortsätt att utföra magnetisk separation enligt tillverkarens rekommendationer.
  6. Bestäm renhet genom flödescytometri eller mikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dissektion av murina vävnader från moder till foster gränssnittet visas i figur 1; Detta förfarande innefattar att öppna bukhålan (Figur 1A, B), livmoderhorn (Figur 1C) inklusive implantationsställen (Figur 1D), och insamling av livmodervävnad (Figur 1E), placenta (figur 1F), och decidual vävnader (Figur 1G) vid 16,5 DPC. Figur 2 visar morfologin av isolerade makrofager (F4 / 80 +) samlats in från decidual och livmoder vävnader vid 16,5 DPC använder magnetisk cellsortering. Isolerade makrofager bibehåller förmågan att frisätta cytokiner (data ej visade). Utbytet av livsdugliga celler isolerade från decidua, livmoder och moderkaka är visad i fig 3, och cellviabiliteten är större än 70% i alla vävnader. Figur 4 visar grindningsstrategi för analys polymorphonucle ar och mononukleära leukocyter inom sing och lönsamhets grindar, inklusive T-celler (CD45 + CD3 +), neutrofiler (CD45 + Ly6G +), makrofager (CD45 + F4 / 80 +), dendritiska celler (CD45 + CD11c +) och NK-celler (CD45 + CD49b +) på 16,5 DPC. En stor del av makrofager samuttrycker CD11c. Figur 5 visar neutrofiler, makrofager och T-celler i decidual, livmoder och placenta-vävnader vid 16,5 DPC. Figur 6 visar grindningsstrategi för analys lymfocyter inom singletter och viabilitet grindar, inklusive T-celler (CD45 + CD3 +) och B-celler (CD45 + B220 +) på 16,5 DPC. T-celler inkluderar CD4 + och CD8 + T-celler. Murina vävnader på moder och foster gränssnitt inkluderar CD3 ^ CD4-CD8- (gamma-delta-T-celler) i höga proportioner. Figur 7 visar T-celler och B-celler i decidual, livmoder och placenta-vävnader vid 16,5 dpc.

jpg "width =" 700 "/>
Figur 1. Vävnads dissektion. (A) livmoderhornen på 16,5 DPC i en B6 mus. Livmoderhornen är fästa tarmkäxet och dränerande fartyg. (B) livmoderhornen dissekerades från tarmkäxet och fortfarande sitter i livmoderhalsen. (C) livmoderhornen inklusive implantationsställen och livmoderhalsen. (D) Dissekering av ett implanteringsställe. (E) Dissekering av livmodervävnader från implantationsstället. (F) Separation av moderkakan och decidua från implanteringsstället. (G) avlossning av decidua (vit-grå skikt) från moderkakan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. makrofager isolerade från decidual och livmodervävnad. Makrofager (F4 / 80 + celler) isoleras från decidual och livmodervävnad på 16,5 DPC använder magnetisk cellsortering. 20X förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. livskraft isolerade celler. Livsdugliga celler (DAPI- celler representeras med pilar) som isolerats från decidual, livmoder och moderkakan vävnad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

"/>
Figur 4. gating strategi för polymorfonukleära och mononukleära leukocyter. Totalt leukocytpopulation var gated inom sing och lönsamhets grindar. T-celler (CD45 + CD3 +), makrofager (CD45 + F4 / 80 +), neutrofiler (CD45 + Ly6G +), dendritiska celler (CD45 + CD11c +) och NK-celler (CD45 + CD49b +) var gated inom den totala-leukocyter grind ( CD45 +). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5
Figur 5. neutrofiler, makrofager och T-celler i murina vävnader på moder och foster gränssnitt. Neutrofiler (CD45 + Ly6G +), makrofager (CD45 + F4 / 80 ^), och T-celler (CD45 + CD3 +) fram gated inom viabiliteten och total-leukocyter (CD45 +) portar i isolerade decidual, livmoder, och placentaceller.TPS: //www.jove.com/files/ftp_upload/52866/52866fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6
Figur 6. gating strategi för lymfocyter. Mononukleära celler gated inom sing och lönsamhets grindar. T-celler (CD3 +) och B-celler (B220 +) var gated inom lönsamheten porten. CD4 + och CD8 + T-celler gated inom T-cells grind (CD3 +). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7
Figur 7. lymfocytpopulationer delpopulationer i murina vävnader på moder och foster gränssnitt. T-celler (CD3 +)och B-celler (B220 +) var gated inom lönsamheten porten i isolerade decidual, livmoder, och placentaceller. CD4 + och CD8 + T-celler gated inom T-cells grind (CD3 +). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Cellmarkör Fluorokrom Klon Företaget Katalognummer
Live / Dead DAPI - Life Technologies L23105
CD45 V450 30-F11 BD Biosciences 560.501
CD3 FITC 145-2C11 BD Biosciences 553.062
CD4 APC RM4-5 BD Biosciences 553.051
CD8 PE-CF594 53-6,7 BD Biosciences 562.283
B220 APC-Cy7 RA3-6B2 BD Biosciences 552.094
F4 / 80 PE BM8 eBiosciences 12-4801-82
Ly6G APC-Cy7 1A8 BD Biosciences 560600
CD49b APC DX5 BD Biosciences 560.628
CD11c PE-Cy7 HL3 BD Biosciences 558.079

Tabell 1. Förteckning över antikroppar som används för leukocyter delmängd immunfenotypning

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Insamlingen av konsekventa data som registrerar överflöd och fenotypiska egenskaper hos infiltrerande leukocyter på moder och foster gränssnitt är nödvändig för att förstå patogenesen av graviditetsrelaterade komplikationer. Flera tekniker har beskrivits som underlättar isoleringen av infiltrerande leukocyter från de murina vävnader vid den moder och foster gränssnitt hela graviditeten 31,38,39,43-46. Men varje teknik är annorlunda, använder olika enzymer eller enzymkombinationer, kräver olika dissociation gånger, inte ange vilka kvantiteter av vävnad, och, viktigast av allt, inte alltid anger livskraft isolerade celler. Protokollet som beskrivs häri möjliggör isolering av infiltrerande leukocyter från de murina vävnader vid moder och foster gränssnitt med hög viabilitet, och ger detaljerad information om de kommersiella reagens, buffert beredning, vävnadskvantiteter, och inkubationstider valideras ilaboratorium.

En av de mest kritiska stegen i leukocyt isoleringsprocessen är vävnadsdissociering; detta steg innefattar mekanisk homogenisering och / eller enzymatiska reaktioner som kan förändra integriteten av extracellulära proteiner som används i fenotypisk karakterisering 47. Protokollet som beskrivs häri erbjuder ett nytt tillvägagångssätt som kombinerar användningen av milda mekaniska och enzymatiska vävnadsdissociering tekniker för att bevara integriteten av extracellulära markörer i de leukocyter isolerade från placenta och de decidual och livmoder vävnader hos möss.

Singel enzymer och kombinationer av olika enzymer har använts för att isolera infiltrerande leukocyter från de murina vävnader vid moder och foster gränssnitt 31,32,39,44. I många fall kan dessa enzymer som är beredda till specifika koncentrationer för hand i laboratoriet vara föremål för mänskliga fel. Här, i stället, en färdig att använda renat kollagenas / neutral protlindra cocktail, Accutase, har genomförts i laboratoriet; som ett kommersiellt tillgängligt enzympreparat, har det visat sig ge tillförlitliga resultat i cellodling 48. Denna enzymatiska lösning är känd för att effektivt lösgöra makrofager från odlingsplattorna utan skrapning och, viktigast av allt, utan att förlora ytantigener 48. Detta beredda enzym har också använts för att bearbeta rötning av människor och djur nervsystemet vävnader, vilket resulterar i livskraftiga isolerade celler som förblir hållbara under långa perioder, vilket gör att deras efterföljande kultur 47. Dessutom bevarar denna enzymatiska lösning CD24 antigenicitet i isolerade celler från centrala nervsystemet vävnader 47. Jämfört med Liberase-1, en annan blandning av kollagenas och neutralt proteas, varken Accutase eller Liberase-1 genererar fria DNA-aggregat; dock Accutase mildare än Liberase-1 under vävnadsdissociering 47. Den kollagenas / neutralt proteas cocktail används i detta protokoll har också visat överlägsenhet gentemot trypsin i bevarandet av CD44, en cancerstamcells ytmarkör 49. Detta laboratorium studier har genomgående noteras att denna enzymatiska lösning bevarar mus leukocyt ytantigener. I själva verket har informativa skillnader påträffats i uttrycket av extracellulära markörer i makrofager (CD11b + F4 / 80 + -celler), neutrofiler (CD11b + Ly6G + celler), NKT-celler (CD3 + CD49b + celler), T-celler (CD3 + celler) och B celler (B220 + CD19 + celler), inklusive CD4, CD8, CD69, CD25, CD40L, PD1, CD44, CD62L och CTLA4, och cytokinfrisättning. Därför är den metod som beskrivs häri optimalt för immunfenotypning av infiltrerande leukocyter vid moder och foster gränssnitt hos möss, såsom visas i de representativa resultat.

En viktig fördel med denna metod är samtidig bestämning av flera extracellulära och intracellulära antigener inom viabiliteten grind. Färgämnet som används mest för att fråntermine cellviabilitet är propidiumjodid (PI); Men, är dess användning begränsad eftersom den kan endast användas i kombination med FITC. Detta beror på att PI inte kan vara tillräckligt skiljer sig från de flesta andra fluorokromer exciteras av blå och röda laser 50. En lösning är att använda DAPI 50 eller något annat färgämne som exciteras av UV-lasrar men inte av blå och röda lasrar vanligen används för immunfenotypning. Detta protokoll tillåter immunfenotypning av levande celler eftersom det inkluderar användning av DAPI 50 för orättbara celler eller användning av livskraft färgämne för fastställbara celler.

En andra viktig fördel med det protokoll som beskrivs häri är att den medger isolering av leukocyter med ett högt utbyte av viabla celler. Det representativa data visar att 70% till 89% av de isolerade cellerna är livsdugliga. Detta är av stor betydelse, eftersom detta protokoll har tillåtit studien av de funktionella egenskaperna hos de isolerade cellerna från murina vävnader vid moder och foster gränssnitt. Feller exempel, har kulturer av decidual och livmodern makrofager och studiet av cytokinfrisättning enligt stimulering utförts med hjälp av den här metoden.

För att uppnå goda resultat, är tillämpningen av den beskrivna protokollet viktigt när man överväger följande faktorer: 1) vävnadsuppsamlings måste utföras inom 5 och 10 minuter efter att ha öppnat i bukhålan, och dessa vävnader måste placeras på is för att bevara livskraften hos de isolerade cellerna; 2) mekanisk vävnads homogenisering måste utföras med en fin spets sax och kan inte överstiga 2 minuter sedan längre perioder har visats minska utbytet av viabla celler; 3) hur länge inkubation med den enzymatiska lösningen måste vara mindre än 1 timme sedan dess aktivitet minskar efter denna tid; 4) temperaturen för inkubering med den enzymatiska lösningen måste hållas vid 37 ° C för att erhålla den optimala aktiviteten hos denna cocktail av enzymer; 5) cellpelleten maniplering måste göras försiktigt med mikropipetter, eftersom användning av virveln kan skada integriteten av cellerna (isolerade celler är differentierade och abrupt manipulation kan lätt minska deras livskraft); 6) buffert och centrifug temperaturer måste hållas vid samma temperatur som cellsuspensionen; 7) isolerade celler skall behandlas för immunfenotypning eller användas omedelbart eftersom deras livskraft minskar snabbt; och 8) när de utför immunfenotypning prover måste tas med en flödescytometer omedelbart för bästa resultat.

En begränsning av detta protokoll är kostnaden för den enzymatiska lösningen, vilket är dyrare än andra enzymer med liknande funktioner, t.ex., trypsin, dispas II och kollagenas. Emellertid de fördelar som denna enzymatiska lösning displayer utöver de beskrivna enzymerna är överlägsna.

Förutom immunfenotypning och cellodling och sortering, framtida tillämpningar av detta protokoll är numerous och varierad. Till exempel är det nu möjligt att fastställa DNA-metylering, uttryck av målgener, leukocyter vitro funktionalitet (t.ex., fagocytos, cytotoxicitet, T-cell proliferation och plasticitet analyser, etc.), och produktionen av reaktiva syreradikaler i leukocyter isolerade i från murina vävnader vid moderns foster gränssnittet. I själva verket kan beskrivning av nya och ovanliga leukocyter i murina vävnader på moder och foster gränssnitt också utföras.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna beskriver inga intressekonflikter.

Acknowledgments

NGL stöddes av Wayne State University Perinatal initiativet i Maternal, perinatal och barns hälsa. Vi tackar Maureen McGerty och Amy E. Furcron (Wayne State University) för deras kritiska läsning av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Magentic Cell Separation
MS Columns Militenyi Biotec 130-042-201
Cell Separator Militenyi Biotec 130-042-102
30 μm pre-separation filters Militenyi Biotec 130-041-407
Multistand Militenyi Biotec 130-042-303
15 ml conical tubes Thermo Fisher 339650
MACS Buffer Militenyi Biotec Laboratory preparation (0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1x PBS, pH 7.2)
Reagents
Accutase enzymatic solution Life Technologies A11105-01
Anti-mouse CD16/CD32 BD Biosciences 533142
Anti-mouse extracellular antibodies BD Bioscences/eBiosciences Table 1
Sodium azide Fisher S227-500
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7906-100G
LIVE/DEAD viability dye Life Technologies L23105
Fixation buffer solution BD Biosciences 558049
FACS Buffer BD Biosciences Laboratory preparation 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 1x PBS, pH 7.4
Trypan blue solution 0.4% BIO-RAD 145-0013
Fetal bovine serum (FBS) Life Technologies 16000-044
Additional Instruments
Incubator with shaker Thermo Scientific MaxQ 4450
Flow cytometer BD LSRFortessa
Centrifuge Thermo Scientific Legend LXTR
Vacuum system laboratory constructed
Incubator Thermo Scientific Incubator 3307
Water bath Precision 51221035
Cell counter BIO-RAD TC20 Automated Cell Counter
Optical and fluorescence microscopes Zeiss and Olympus Zeiss LSM780 and Olympus CKX41

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trowsdale, J., Betz, A. G. Mother's little helpers: mechanisms of maternal-fetal tolerance. Nat Immunol. 7 (3), 241-246 (2006).
  2. King, A., et al. Evidence for the expression of HLAA-C class I mRNA and protein by human first trimester trophoblast. J Immunol. 156 (6), 2068-2076 (1996).
  3. Bonney, E. A., Matzinger, P. The maternal immune system's interaction with circulating fetal cells. J Immunol. 158 (1), 40-47 (1997).
  4. Tafuri, A., Alferink, J., Moller, P., Hammerling, G. J., Arnold, B. T cell awareness of paternal alloantigens during pregnancy. Science. 270 (5236), 630-633 (1995).
  5. Chaouat, G., Petitbarat, M., Dubanchet, S., Rahmati, M., Ledee, N. Tolerance to the foetal allograft. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 624-636 (2010).
  6. Robertson, S. A., et al. Seminal fluid drives expansion of the CD4+CD25+ T regulatory cell pool and induces tolerance to paternal alloantigens in mice. Biol Reprod. 80 (5), 1036-1045 (2009).
  7. Robertson, S. A., Moldenhauer, L. M. Immunological determinants of implantation success. Int J Dev Biol. 58 (2-4), 205-217 (2014).
  8. Aluvihare, V. R., Kallikourdis, M., Betz, A. G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat Immunol. 5 (3), 266-271 (2004).
  9. Rowe, J. H., Ertelt, J. M., Xin, L., Way, S. S. Pregnancy imprints regulatory memory that sustains anergy to fetal antigen. Nature. 490 (7418), 102-106 (2012).
  10. Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict. Cell. 150 (1), 29-38 (2012).
  11. Saito, S., Sakai, M., Sasaki, Y., Nakashima, A., Shiozaki, A. Inadequate tolerance induction may induce pre-eclampsia. J Reprod Immunol. 76 (1-2), 30-39 (2007).
  12. Lee, J., et al. A signature of maternal anti-fetal rejection in spontaneous preterm birth: chronic chorioamnionitis, anti-human leukocyte antigen antibodies, and C4d. PLoS One. 6 (2), 0016806 (2011).
  13. Steinborn, A., et al. Pregnancy-associated diseases are characterized by the composition of the systemic regulatory T cell (Treg) pool with distinct subsets of Tregs. Clin Exp Immunol. 167 (1), 84-98 (2012).
  14. Gomez-Lopez, N., Laresgoiti-Servitje, E. T regulatory cells: regulating both term and preterm labor. Immunol Cell Biol. 90 (10), 919-920 (2012).
  15. Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. A., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol. 23 (10), 46 (2014).
  16. Romero, R., Dey, S. K., Fisher, S. J. Preterm labor: one syndrome, many causes. Science. 345 (6198), 760-765 (2014).
  17. Gomez-Lopez, N., Guilbert, L. J., Olson, D. M. Invasion of the leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy. J Leukoc Biol. 88 (4), 625-633 (2010).
  18. Timmons, B., Akins, M., Mahendroo, M. Cervical remodeling during pregnancy and parturition. Trends Endocrinol Metab. 21 (6), 353-361 (2010).
  19. Arck, P. C., Hecher, K. Fetomaternal immune cross-talk and its consequences for maternal and offspring's health. Nat Med. 19 (5), 548-556 (2013).
  20. Erlebacher, A. Immunology of the maternal-fetal interface. Annu Rev Immunol. 31, 387-411 (2013).
  21. Wambach, C. M., Patel, S. N., Kahn, D. A. Maternal and fetal factors that contribute to the localization of T regulatory cells during pregnancy. Am J Reprod Immunol. 71 (5), 391-400 (2014).
  22. Cross, J. C., Werb, Z., Fisher, S. J. Implantation and the placenta: key pieces of the development puzzle. Science. 266 (5190), 1508-1518 (1994).
  23. Georgiades, P., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Comparative developmental anatomy of the murine and human definitive placentae. Placenta. 23 (1), 3-19 (2002).
  24. Croy, B. A., et al. Imaging of vascular development in early mouse decidua and its association with leukocytes and trophoblasts. Biol Reprod. 87 (5), (2012).
  25. Hofmann, A. P., Gerber, S. A., Croy, B. A. Uterine natural killer cells pace early development of mouse decidua basalis. Mol Hum Reprod. 20 (1), 66-76 (2014).
  26. Lima, P. D., Zhang, J., Dunk, C., Lye, S. J., Anne Croy, B. Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy. Cell Mol Immunol. , (2014).
  27. Robson, A., et al. Uterine natural killer cells initiate spiral artery remodeling in human pregnancy. FASEB J. 26 (12), 4876-4885 (2012).
  28. Lash, G. E., et al. Regulation of extravillous trophoblast invasion by uterine natural killer cells is dependent on gestational age. Hum Reprod. 25 (5), 1137-1145 (2010).
  29. Kruse, A., Merchant, M. J., Hallmann, R., Butcher, E. C. Evidence of specialized leukocyte-vascular homing interactions at the maternal/fetal interface. Eur J Immunol. 29 (4), 1116-1126 (1999).
  30. Degaki, K. Y., Chen, Z., Yamada, A. T., Croy, B. A. Delta-like ligand (DLL)1 expression in early mouse decidua and its localization to uterine natural killer cells. PLoS One. 7 (12), 28 (2012).
  31. Habbeddine, M., Verbeke, P., Karaz, S., Bobe, P., Kanellopoulos-Langevin, C. Leukocyte Population Dynamics and Detection of IL-9 as a Major Cytokine at the Mouse Fetal-Maternal Interface. PLoS One. 9 (9), (2014).
  32. Blaisdell, A., Erlbacher, E. Ch. 53. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. Yamada, A. T., Croy, B. A., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. , Elsevier Academic Press. 619-635 (2014).
  33. Rinaldi, S. F., Catalano, R. D., Wade, J., Rossi, A. G., Norman, J. E. Decidual neutrophil infiltration is not required for preterm birth in a mouse model of infection-induced preterm labor. J Immunol. 192 (5), 2315-2325 (2014).
  34. Plaks, V., et al. Uterine DCs are crucial for decidua formation during embryo implantation in mice. J Clin Invest. 118 (12), 3954-3965 (2008).
  35. Parr, E. L., Szary, A., Parr, M. B. Measurement of natural killer activity and target cell binding by mouse metrial gland cells isolated by enzymic or mechanical methods. J Reprod Fertil. 88 (1), 283-294 (1990).
  36. Arck, P. C., et al. Murine T cell determination of pregnancy outcome. Cell Immunol. 196 (2), 71-79 (1999).
  37. Male, V., Gardner, L., Moffett, A. Isolation of cells from the feto-maternal interface. Curr Protoc Immunol. 7 (7), 1-11 (2012).
  38. Li, L. P., Fang, Y. C., Dong, G. F., Lin, Y., Saito, S. Depletion of invariant NKT cells reduces inflammation-induced preterm delivery in mice. J Immunol. 188 (9), 4681-4689 (2012).
  39. Collins, M. K., Tay, C. S., Erlebacher, A. Dendritic cell entrapment within the pregnant uterus inhibits immune surveillance of the maternal/fetal interface in mice. J Clin Invest. 119 (7), 2062-2073 (2009).
  40. Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Mol Reprod Dev. 75 (5), 818-827 (2008).
  41. Zhang, P., Wu, X., Hu, C., Wang, P., Li, X. Rho kinase inhibitor Y-27632 and Accutase dramatically increase mouse embryonic stem cell derivation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 48 (1), 30-36 (2012).
  42. Pang, S. C., Janzen-Pang, J., Tse, Y., Croy, B. A. Ch. 2. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. Yamada, A. T., Croy, B. A., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. , Elsevier Academic Press. 21-42 (2014).
  43. Zenclussen, A. C., et al. Murine abortion is associated with enhanced interleukin-6 levels at the feto-maternal interface. Cytokine. 24 (4), 150-160 (2003).
  44. Mallidi, T. V., Craig, L. E., Schloemann, S. R., Riley, J. K. Murine endometrial and decidual NK1.1+ natural killer cells display a B220+CD11c+ cell surface phenotype. Biol Reprod. 81 (2), 310-318 (2009).
  45. Addio, F., et al. The link between the PDL1 costimulatory pathway and Th17 in fetomaternal tolerance. J Immunol. 187 (9), 4530-4541 (2011).
  46. Shynlova, O., et al. Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling. J Cell Mol Med. 17 (2), 311-324 (2013).
  47. Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
  48. Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. , 670-672 (2014).
  49. Quan, Y., et al. Impact of cell dissociation on identification of breast cancer stem cells. Cancer Biomark. 12 (3), 125-133 (2012).
  50. Gordon, K. M., Duckett, L., Daul, B., Petrie, H. T. A simple method for detecting up to five immunofluorescent parameters together with DNA staining for cell cycle or viability on a benchtop flow cytometer. J Immunol Methods. 275 (1-2), 113-121 (2003).

Tags

Immunologi decidua Dissociation Isolation Leukocyter myometrium Placenta graviditet livmoder
Isolering av leukocyter från Murina vävnader på Maternal-Fetal Interface
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arenas-Hernandez, M.,… More

Arenas-Hernandez, M., Sanchez-Rodriguez, E. N., Mial, T. N., Robertson, S. A., Gomez-Lopez, N. Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface. J. Vis. Exp. (99), e52866, doi:10.3791/52866 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter