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Immunology and Infection

मातृ-भ्रूण इंटरफेस पर Murine ऊतकों से leukocytes की अलगाव

Published: May 21, 2015 doi: 10.3791/52866
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1,3,4
1Department of Obstetrics & Gynecology, Wayne State University School of Medicine, 2School of Paediatrics and Reproductive Health, Research Centre for Reproductive Health, the Robinson Research Institute, The University of Adelaide, 3Department of Immunology & Microbiology, Wayne State University School of Medicine, 4Perinatology Research Branch, NICHD/NIH/DHHS

Abstract

गर्भावस्था में प्रतिरक्षा सहिष्णुता माँ की प्रतिरक्षा प्रणाली को विकसित भ्रूण को स्वीकार करने और पोषण करने के क्रम में विशिष्ट परिवर्तन की प्रक्रिया की आवश्यकता है। यह सहिष्णुता, सहवास के दौरान शुरू की गर्भाधान और आरोपण के दौरान स्थापित किया गया है, और गर्भावस्था के दौरान बनाए रखा है। मातृ-भ्रूण सहिष्णुता की सक्रिय सेलुलर और आणविक मध्यस्थों नाल और गर्भाशय और decidual ऊतकों भी शामिल है जो मातृ-भ्रूण इंटरफेस है, के रूप में जाना भ्रूण और मातृ ऊतकों के बीच संपर्क के स्थल पर समृद्ध कर रहे हैं। इस इंटरफ़ेस stromal कोशिकाओं और घुसपैठ leukocytes के शामिल है, और उनके बहुतायत और प्ररूपी विशेषताओं गर्भावस्था के दौरान अधिक से बदल जाते हैं। मातृ-भ्रूण इंटरफेस में घुसपैठ ल्यूकोसाइट्स एक साथ गर्भावस्था को बनाए कि स्थानीय माइक्रो माहौल बनाने कि न्यूट्रोफिल, मैक्रोफेज, वृक्ष के समान कोशिकाओं, मस्तूल कोशिकाओं, टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, एन.के. कोशिकाओं, और NKT कोशिकाओं में शामिल हैं। इन कोशिकाओं को या किसी भी inapprop के बीच एक असंतुलनउनके phenotypes में riate परिवर्तन गर्भावस्था में इस रोग का एक तंत्र माना जाता है। इसलिए, मातृ-भ्रूण इंटरफ़ेस घुसपैठ कि leukocytes के अध्ययन गर्भावस्था संबंधी जटिलताओं को जन्म दे कि प्रतिरक्षा तंत्र को स्पष्ट करने के क्रम में आवश्यक है। इस के साथ साथ वर्णित प्रोटियोलिटिक और मातृ-भ्रूण इंटरफेस में murine ऊतकों से घुसपैठ ल्यूकोसाइट्स अलग करने के लिए collagenolytic एंजाइमी कॉकटेल के साथ एक मजबूत एंजाइमी disaggregation द्वारा पीछा कोमल यांत्रिक हदबंदी का एक संयोजन का उपयोग करता है कि एक प्रोटोकॉल है। इस प्रोटोकॉल पर्याप्त संरक्षित प्रतिजनी और कार्यात्मक गुणों के साथ व्यवहार्य ल्यूकोसाइट्स (> 70%) की उच्च संख्या के अलगाव के लिए अनुमति देता है। पृथक ल्यूकोसाइट्स तो immunophenotyping, सेल छँटाई, इमेजिंग, immunoblotting, mRNA अभिव्यक्ति, सेल संस्कृति, और इस तरह के मिश्रित ल्युकोसैट प्रतिक्रियाओं, प्रसार, या cytotoxicity assays के रूप में इन विट्रो कार्यात्मक assays में सहित कई तकनीकों, द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है।

Introduction

विशिष्ट परिवर्तन मां की प्रतिरक्षा प्रणाली के भीतर होते हैं जब गर्भावस्था में प्रतिरक्षा सहिष्णुता एक अवधि है। ये परिवर्तन मां भ्रूण, एक अर्द्ध allogenic भ्रष्टाचार 1 को सहन करने की अनुमति देते हैं। भ्रूण पैतृक प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल (MHC) 2 एंटीजन, और भ्रूण कोशिकाओं मातृ परिसंचरण 3 में पाया गया है व्यक्त करता है; हालांकि, भ्रूण 4,5 अस्वीकार नहीं है। इस पहेली को पूरी तरह से समझ नहीं है।

सबसे हाल ही में परिकल्पना मातृ-भ्रूण सहिष्णुता सहवास के दौरान बनाया और 6,7 गर्भाधान और एक पूर्ण अवधि गर्भावस्था 8-10 बनाए रखने के लिए बनाए रखा है जो बताता है। इस मातृ-भ्रूण सहिष्णुता के टूटने गर्भावस्था 10-16 की जल्दी और देर चरणों के दौरान इस बीमारी का एक तंत्र माना जाता है। मातृ-भ्रूण सहिष्णुता टी कोशिकाओं (विनियामक टी कोशिकाओं, Th1 कोशिकाओं, Th2 कोशिकाओं, और Th17 कोशिकाओं), मैक सहित विभिन्न ल्युकोसैट उप आबादी की भागीदारी शामिलrophages, न्यूट्रोफिल, मस्तूल कोशिकाओं, एन.के. कोशिकाओं, और NKT कोशिकाओं, वृक्ष के समान कोशिकाओं, और बी कोशिकाओं, गर्भावस्था 15,17-19 भर घनत्व और स्थानीयकरण में है कि परिवर्तन। मां की प्रतिरक्षा प्रणाली को भ्रूण एंटीजन 20,21 के साथ सूचना का आदान प्रदान, जहां शारीरिक साइट - मातृ-भ्रूण सहिष्णुता मातृ-भ्रूण इंटरफ़ेस 20 में समृद्ध है।

भ्रूण extravillous ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं गर्भाशय म्यूकोसा 22-24 आक्रमण जब मातृ-भ्रूण इंटरफ़ेस गर्भनाल के दौरान बनाई गई है। इस इंटरफेस का भ्रूण तरफ, भ्रूण झिल्ली नाल के भीतर एक विशेष उपकला सतह बनाने के लिए, और syncytiotrophoblast कोशिकाओं मातृ रक्त 22 के साथ अपने सीधे संपर्क के माध्यम से पोषक तत्व विदेशी मुद्रा नियंत्रण। इंटरफ़ेस की मातृ पक्ष पर, पत्या चूहों में सभी decidual कोशिकाओं के 50% से 30% के लिए खाते है कि leukocytes के एक विषम पूल भर्ती करता है। Matern में उनकी भागीदारी के अलावाअल प्रतिरक्षा सहिष्णुता, इन कोशिकाओं को गर्भावस्था के दौरान विभिन्न प्रक्रियाओं, उदा।, संक्रमण, गर्भाधान से प्रजनन पथ के संरक्षण, भ्रूण आरोपण 7,25, decidual एंजियोजिनेसिस 26, संवहनी remodeling के 24,27, ट्रोफोब्लास्ट आक्रमण 28, अपरा के लिए महत्वपूर्ण योगदान कर रहे हैं विकास 24,25, और, अंततः, श्रम और प्रसव 15,17। इसलिए, मातृ-भ्रूण सहिष्णुता में शामिल leukocytes के अध्ययन गर्भावस्था संबंधी जटिलताओं के रोगजनन elucidating के लिए आवश्यक है।

Immunohistochemistry और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के उपयोग के प्रत्यक्ष दृश्य और गर्भाशय, decidual, या अपरा ल्यूकोसाइट्स 29,30 के स्थानीयकरण के लिए डेटा उत्पन्न किया है, वहीं आगे इन ऊतकों 31,32 में से प्रत्येक में leukocytes के विशिष्ट सबसेट से पता चला है प्रवाह cytometry विश्लेषण। इसके अतिरिक्त, cytometry के घनत्व और विद्यालय के अनुपात का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है प्रवाहएनएएल-भ्रूण इंटरफ़ेस बाह्य और intracellular प्रोटीन 8-10,34 के 33 और अभिव्यक्ति के स्तर leukocytes। मातृ-भ्रूण इंटरफेस में leukocytes के cytometric विश्लेषण प्रवाह एक एकल कोशिका निलंबन की आवश्यकता है। Decidual, गर्भाशय, और अपरा ऊतकों से घुसपैठ ल्यूकोसाइट्स को अलग-थलग करने के लिए, ऊतक हदबंदी के दो तरीकों का इस्तेमाल किया जा रहा है: यांत्रिक और enzymatic। दोनों ही तरीकों से इन ऊतकों की बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) से घुसपैठ leukocytes की जुदाई अनुमति देते हैं। यह कम कतरनी बल-जुड़े नुकसान 35 के साथ leukocytes के एक उच्च उपज की अनुमति देता है के रूप में एंजाइमी ऊतक हदबंदी यांत्रिक ऊतक हदबंदी के लिए बेहतर है। नतीजतन, यांत्रिक ऊतक हदबंदी नमूनों की परिवर्तनशीलता और विविधता में वृद्धि हो सकती है, जो ऊतकों 36, पूलिंग की आवश्यकता है। फिर भी, यांत्रिक हदबंदी ब्याज की प्रतिजन एंजाइमी हदबंदी या जब तक बदला जा सकता है जब विकल्प हो सकता है सेल की कार्यक्षमताब्याज की जरूरत के संरक्षित किया जाना है (उदाहरण के लिए।, एन.के. कोशिकाओं की cytotoxicity) 35।

ईसीएम नीचा करने के लिए विशिष्ट एंजाइमों के साथ प्रोटियोलिसिस का उपयोग यांत्रिक हदबंदी के साथ मनाया कम पैदावार समाप्त। कई अध्ययनों से ट्रिप्सिन 32, collagenase 37, DNase 31, 38 dispase, और विभिन्न एंजाइमों 32,39 के वाणिज्यिक कॉकटेल के उपयोग की सूचना दी है। हालांकि, प्रकृति और विभिन्न एंजाइमों की एकाग्रता और पाचन की अवधि को सावधानी से परिभाषित किया है और immunophenotyping के लिए आवश्यक कोशिका की सतह प्रतिजनी epitopes की अखंडता के रखरखाव सुनिश्चित करने के क्रम में मान्य किया जाना चाहिए। विभिन्न सतह संरचनाओं कई मोनोक्लोनल एंटीबॉडी द्वारा मान्यता प्राप्त ल्युकोसैट सतह epitopes अलग करना के लिए कुख्यात जा रहा है, इस तरह के ट्रिप्सिन के रूप में कुछ एंजाइमों के साथ, विभिन्न एंजाइमों द्वारा विनाश करने के लिए विभिन्न अतिसंवेदनशील होते हैं।

इस के साथ साथ शुरू की proteolyt का उपयोग कर एक विधि हैAccutase बुलाया आईसी और collagenolytic एंजाइमी कॉकटेल,। इस एंजाइमी समाधान पर्याप्त मातृ-भ्रूण इंटरफेस में murine ऊतकों dissociating में है जबकि अभी भी कुशल विनम्र होता है, और हदबंदी प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए अन्य dissociating अभिकर्मकों या सीरम के अलावा आवश्यकता नहीं है। हदबंदी के समय मान्य किया जा करने की जरूरत है, हालांकि इसके अलावा, यह उसके ऊपर-विख्यात एंजाइमों 40,41 से अधिक मजबूत है, आपूर्ति के रूप में उपयोग करने के लिए तैयार है और।

ऊतक disaggregation के दोनों प्रकार का एक संयोजन का उपयोग प्राप्त कोशिकाओं की गुणवत्ता और मात्रा को सुधार; इस प्रकार, कई अध्ययनों से संतोषजनक परिणाम 31,32,37 के साथ यांत्रिक और enzymatic हदबंदी के संयुक्त उपयोग को लागू किया है। इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल की स्थापना की और हमारी प्रयोगशाला में मान्य किया गया था; यह एक मजबूत एंजाइमी disaggregation के बाद कोमल यांत्रिक हदबंदी का एक संयोजन का उपयोग करता है। इस प्रोटोकॉल के अलगाव और आगे के अध्ययन के लिए अनुमति देता हैमातृ-भ्रूण इंटरफेस में murine ऊतकों में घुसपैठ ल्यूकोसाइट्स (गर्भाशय, पत्या, और प्लेसेंटा)। प्रवाह cytometric विश्लेषण के द्वारा प्रदर्शन के रूप में निम्नलिखित प्रोटोकॉल भी कोशिका की सतह मार्करों और बहाव के अनुप्रयोगों के लिए पैदावार काफी व्यवहार्य कोशिकाओं की अखंडता को बनाए रखता है। अंत में, इस प्रोटोकॉल विश्लेषण और मातृ-भ्रूण इंटरफ़ेस रचना अलग murine ऊतकों की तुलना के लिए सेल तैयार की निरंतरता को बनाए रखता है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में उल्लेख किया नमूनों के साथ काम करने से पहले, पशु नैतिक अनुमोदन स्थानीय अनुसंधान आचार समिति और संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा दी जानी चाहिए। पशु रक्त, सेल, या इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में खतरनाक एजेंटों के साथ काम करना, उचित जैव सुरक्षा और प्रयोगशाला सुरक्षा कार्यों का पालन किया जाना चाहिए।

1. माउस हैंडलिंग और ऊतक संग्रह

  1. एक बाँझ वर्कस्टेशन को तैयार है और ऊतक संग्रह के लिए बाँझ उपकरण प्राप्त करते हैं। इन उपकरणों के बड़े और छोटे शल्य कैंची, संदंश, और ठीक-टिप चिमटी शामिल होंगे। (- 22 डिग्री सेल्सियस 20) आरटी के लिए equilibrated - (5 मिलीलीटर 3) 1x फॉस्फेट बफर (पीबीएस) खारा समाधान के साथ भरा उपयुक्त ऊतक नाम के साथ लेबल छोटे पेट्री डिश, को शामिल करें। (- 15 मिलीलीटर 10) भी 1x पीबीएस समाधान के साथ भरा unlabeled एक बड़े पेट्री डिश, शामिल हैं।
  2. एक गर्भवती माउस Euthanize (10.5-19.0 दिनों के बाद coitum (डीपीसी) या प्रसव से पूर्व) कार्बन डाइऑक्साइड का उपयोग कर (सीओ 2)। माउस euthanized है कि यह सुनिश्चित करने के लिए, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था तकनीक का उपयोग करें।
    नोट: 10.5 डीपीसी करने से पहले, यह मैन्युअल गर्भाशय के ऊतकों से decidual ऊतकों को अलग करने के लिए मुश्किल है। Decidual leukocytes के अलगाव की आवश्यकता नहीं है, तो गर्भाशय गैर गर्भवती चूहों के ऊतकों या कम से चूहों से उन लोगों से ल्यूकोसाइट्स <10.5 डीपीसी भी इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए किया जा सकता है।
  3. बाँझ शल्य कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करना, पूरी तरह से त्वचा और मांसपेशियों के ऊतकों के पेट के निचले भाग हिस्से को हटा दें। संदंश के साथ, गर्भाशय तक एक तरफ सभी अन्य अंगों को स्थानांतरित और अंडाशय दिखाई दे रहे हैं। गर्भाशय अभी भी संलग्न के साथ, peritoneal गुहा (चित्रा 1 ए) के बाहर ले जाने के लिए संदंश का उपयोग करें।
  4. प्रत्येक गर्भाशय सींग का डिंबवाहिनी और uterotubal जंक्शन बाहर का अंडाशय की स्थिति जानें। छोटे शल्य कैंची का प्रयोग, uterotubal जंक्शन पर एक चीरा बनाने और गर्भाशय वाहिकाओं युक्त अन्त्रपेशी से गर्भाशय सींग अलग; फिर,गर्भाशय ग्रीवा पर ​​आबकारी पेरिटोनियल गुहा (चित्रा 1 बी) से गर्भाशय सींग अलग करने के लिए।
  5. छोटे शल्य कैंची के साथ, गर्भाशय ग्रीवा और गर्भाशय सींग के निचले खंड के बीच एक चीरा बनाते हैं। छोड़ दो गर्भाशय सींग खोलने से बचने के लिए इस प्रक्रिया (चित्रा 1C) के दौरान गर्भाशय ग्रीवा के एक हिस्से को संलग्न।
  6. आरोपण साइटों को हाइड्रेट करने के लिए - (15 मिलीलीटर 10) 1x पीबीएस समाधान के साथ भरा एक बड़े पेट्री डिश में (गर्भाशय ग्रीवा सहित) गर्भाशय सींग विसर्जित कर दिया।
  7. अभी भी 1x पीबीएस समाधान में डूब जबकि, छोटे शल्य कैंची के साथ गर्भाशय सींग से किसी भी वसा ट्रिम। विच्छेदन भर 1x पीबीएस समाधान में डूब ऊतकों रखें।
  8. संदंश के साथ जगह में गर्भाशय सींग होल्डिंग, छोटे शल्य कैंची (चित्रा -1) का उपयोग कर, अंतर-आरोपण क्षेत्र के माध्यम से कट एक अनुप्रस्थ साथ गर्भाशय से आरोपण साइटों में से एक को हटा दें। आरोपण साइट से घिरा हुआ भ्रूण, शामिल हैंchorioallantoic झिल्ली, और गर्भाशय, decidual, और अपरा ऊतकों।
  9. संदंश का प्रयोग, जगह में साइट पकड़ और अपरा और decidual ऊतकों (चित्रा 1E) के निकट गर्भाशय की दीवार में एक छोटा सा चीरा बनाते हैं। इन गर्भाशय की दीवार और भ्रूण भी शामिल है कि chorioallantoic झिल्ली (चित्रा 1F) दोनों से अलग हो जब तक नाल / पत्या की परिधि के आसपास ट्रिम।
  10. 1x पीबीएस समाधान में नाल और संलग्न decidual ऊतकों और जगह निकालें (3 - 5 मिलीलीटर, कदम 1.12 देखें)।
  11. (- 5 मिलीलीटर 3) 1x पीबीएस समाधान के साथ भरा एक पेट्री डिश में गर्भाशय के ऊतकों से जुड़ी chorioallantoic झिल्ली से घिरा हुआ भ्रूण रखें। इन ऊतकों के जलयोजन गर्भाशय की दीवार से chorioallantoic झिल्ली की जुदाई की सुविधा होगी (कदम 1.14 देखें)।
  12. ठीक-टिप चिमटी की एक जोड़ी का प्रयोग, धीरे अपरा सतह से decidual ऊतक (सफेद ग्रे परत) छील। इस प्रदर्शनअपरा और decidual ऊतकों (चित्रा 1G) की अखंडता को बनाए रखने के लिए सावधानी से कदम।
  13. (- 5 मिलीलीटर प्रत्येक 3) 1x पीबीएस समाधान के साथ भरा दो अलग-अलग लेबल वाले पेट्री डिश में नाल और decidual ऊतकों रखें।
  14. धीरे ठीक टिप चिमटी के साथ chorioallantoic झिल्ली से गर्भाशय की दीवार को हटा दें। ये गर्भाशय ऊतकों हैं।
  15. (- 5 मिलीलीटर 3) 1x पीबीएस समाधान के साथ भरा एक पेट्री डिश में गर्भाशय के ऊतकों रखें।
  16. सभी आरोपण साइटों संसाधित किया गया है दोहराएँ जब तक 1.15 के माध्यम से 1.8 कदम।
  17. Enzymatic पाचन के दौरान कोशिकाओं की उपज में सुधार करने के लिए कई गर्भाशय, decidual, और अपरा ऊतकों लीजिए। ऊतकों की राशि कूड़े के आकार पर निर्भर करता है; हालांकि, ल्युकोसैट अलगाव ऊतक के> 2 टुकड़े की आवश्यकता है।
    नोट: विभिन्न गर्भावधि दिनों पर आरोपण साइटों के विच्छेदन के बारे में अधिक विस्तृत जानकारी के लिए, Investigati के लिए गाइड का अध्याय दो में पाया तस्वीरें देखनेमाउस गर्भावस्था के 42 में से एक पर।

2. गर्भाशय, Decidual, और Placental ऊतक हदबंदी

  1. उचित ऊतक नाम के साथ कई बाँझ 2 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब लेबल, और बर्फ पर एंजाइमी समाधान के 1,000 μl के साथ एक शीशी जगह है।
  2. एक लेबल 2 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब गर्भाशय, decidual, या अपरा ऊतकों की - (150 मिलीग्राम 100) 1x पीबीएस समाधान के साथ भरा पेट्री डिश से, दो टुकड़े हस्तांतरण।
  3. प्रत्येक 2 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में ठंड एंजाइमी समाधान के 500 μl जोड़ें।
  4. ठीक बाँझ कैंची के साथ, यह सूक्ष्मता कीमा बनाया हुआ है, जब तक एंजाइमी समाधान में डूब ऊतक अलग कर देना शुरू करते हैं। समय के साथ, निलंबन एक दूधिया उपस्थिति का विकास होगा। यह कदम नमूने की ओवर-हेरफेर को रोकने के लिए अधिक से अधिक 2 मिनट से अधिक नहीं होना चाहिए।
  5. ऊतक अलग हो जाने के बाद, 2 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब ठंड एंजाइमी समाधान की एक अतिरिक्त 500 μl जोड़ें।
  6. बर्फ पर 2 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब रखें।
  7. सभी ऊतकों संसाधित किया गया है दोहराएँ जब तक प्रत्येक व्यक्ति के ऊतकों के साथ 2.6 के माध्यम से 2.2 कदम।
  8. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में बर्फ से homogenized ऊतक (कीमा बनाया हुआ ऊतक + एंजाइमी समाधान) के नमूनों के साथ सभी 2 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब स्थानांतरण और एक सज्जन कक्षीय आंदोलन (80 आरपीएम) प्रदर्शन करते हैं। 35 मिनट - 30 के लिए सेते हैं। इनक्यूबेटर का तापमान ऊष्मायन समय शुरू करने से पहले स्थिर है सुनिश्चित करें।
  9. ऊष्मायन के बाद, इनक्यूबेटर से अलग ऊतकों के साथ 2 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को हटाने और किसी भी आगे की पाचन को रोकने के लिए बर्फ पर उन्हें जगह है।
  10. ऊतक के प्रकार के अनुसार बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब लेबल। पलकों निकालें और एक बाँझ सेल झरनी (100 माइक्रोन रोमकूप आकार) के साथ बदलें।
  11. ~ 1x पीबीएस समाधान के 20 मिलीलीटर सेल झरनी के माध्यम से शंक्वाकार ट्यूब का उपयोग 2 मिलीलीटर से अलग ऊतकों डालो। ऊतक के टुकड़े सेल झरनी में रहेगा और सेल निलंबन के माध्यम से इसे पारित करेंगे।
  12. डि धो लेंसेल झरनी में ssociated ऊतकों 2 - एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग 1x पीबीएस समाधान के 20 मिलीलीटर के साथ 3 बार।
  13. खाली 2 मिलीलीटर 1X पीबीएस समाधान (1 मिलीलीटर) के साथ शंक्वाकार ट्यूब कुल्ला और सेल strainers के माध्यम से सामग्री डाल।
  14. 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब से सेल strainers निकालें और पलकों की जगह। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1,250 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र।
  15. ध्यान से, सेल गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला महाप्राण। सेल गोली पृथक leukocytes और stromal कोशिकाओं में शामिल है।
  16. भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के बिना RPMI संस्कृति के माध्यम से 1 मिलीलीटर में सेल गोली फिर से निलंबित। धीरे मिलाएं। भंवर का प्रयोग न करें।
  17. एक 5 एमएल polystyrene प्लास्टिक ट्यूब को साफ FBS की 500 μl जोड़ें और धीरे धीरे सेल निलंबन उपरिशायी।
  18. सेलुलर मलबे पीबीएस / FBS के इंटरफेस में बरकरार रखा गया है, जबकि आरटी पर ब्रेक के बिना 1100 XG पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र व्यवहार्य गोली कोशिकाओं।
  19. सेल गोली छूने के बिना सतह पर तैरनेवाला aspirate। सेलएल गोली ज्यादातर व्यवहार्य सेल शामिल हैं।
  20. वैकल्पिक: नीचे वर्णित के रूप में मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं ध्यान केंद्रित करने के लिए, एक 20% संतृप्त पॉलीसैक्राइड समाधान का उपयोग करें।
    1. FBS के बिना RPMI संस्कृति के माध्यम से 1,000 μl में सेल गोली Resuspend।
    2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, एक 5 एमएल polystyrene प्लास्टिक ट्यूब करने के लिए 20% संतृप्त पॉलीसैक्राइड समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे धीरे इस समाधान के शीर्ष पर सेल निलंबन उपरिशायी। नमूना लेयरिंग, वहीं सेल निलंबन के साथ 20% संतृप्त पॉलीसैक्राइड समाधान मिश्रण से बचने।
    3. ब्रेक के बिना आरटी पर 30 मिनट के लिए 500 XG पर एक स्विंग बाहर रोटर के साथ अपकेंद्रित्र। यह कोशिकाओं मिश्रण और ढाल को खोने से बचने के लिए ब्रेक बंद करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं 20% संतृप्त पॉलीसैक्राइड समाधान और 1x पीबीएस समाधान के बीच इंटरफेस में मिल जाएगा।
    4. महाप्राण और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। सेल गोली ज्यादातर मोनोन्यूक्लियर सेल शामिल हैं।
      नहींते: प्रदर्शन करने के लिए कदम 6. देखते हैं, पृथक leukocytes के एक सेल संस्कृति को करने के लिए चरण 5 देखते हैं, व्यवहार्यता धुंधला और केवल बाह्य धुंधला प्रदर्शन करने के लिए कदम 4 देखें immunophenotyping प्रदर्शन करने के लिए कदम 3. देखते हैं, व्यवहार्यता धुंधला और intracellular धुंधला प्रदर्शन करने के लिए चुंबकीय सेल छँटाई, चरण 7 में देखते हैं।

Fixable प्रकोष्ठों के लिए 3. व्यवहार्यता धुंधला

  1. 1x पीबीएस समाधान के 1100 μl में सेल गोली Resuspend। धीरे एक माइक्रो पिपेट का उपयोग कर मिलाएं।
  2. एक 5 एमएल polystyrene प्लास्टिक ट्यूब में सेल निलंबन के 100 μl स्थानांतरण। 5 मिलीलीटर polystyrene ट्यूब 1X पीबीएस समाधान के 400 μl जोड़ें। इस ट्यूब ऊतक ऑटो प्रतिदीप्ति के लिए एक नियंत्रण है। 3.5 कदम जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  3. एक नया 5 एमएल polystyrene प्लास्टिक ट्यूब सेल निलंबन के शेष 1,000 μl स्थानांतरण। व्यवहार्यता डाई का 1 μl जोड़ें और धीरे homogenize। 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  4. ऊष्मायन के बाद, 1,000 & # जोड़ने181; 1x पीबीएस समाधान के एल। हाथ से धीरे मिलाएं।
  5. अपकेंद्रित्र दोनों 5 एमएल polystyrene प्लास्टिक की ट्यूब 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1250 XG पर (3.2 और 3.3 कदम)। महाप्राण और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    नोट: सेल गोली (कदम 3.3) ऊतक ऑटो प्रतिदीप्ति के लिए एक नियंत्रण के रूप में काम करेगा चरण 4 सेल गोली (3.2 कदम) में इस्तेमाल किया जाएगा।

4. Immunophenotyping

  1. विरोधी माउस CD16 / CD32 के 50 μl में सेल गोली Resuspend (1 पतला: FACS बफर में 100 [0.1% बीएसए, 0.05% सोडियम azide, 1x पीबीएस समाधान, पीएच 7.4])। धीरे सेल निलंबन मिलाएं। भंवर का प्रयोग न करें।
  2. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 5 मिलीलीटर polystyrene ट्यूब में सेल निलंबन सेते हैं।
  3. ऊष्मायन के बाद, बाह्य कोशिका की सतह मार्करों या निर्धारण-मिलान नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ प्रतिक्रिया प्रत्येक विरोधी ल्युकोसैट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के 50 μl (एंटीबॉडी dilutions के मान्य किया जाना चाहिए) जोड़ें। उदाहरण के लिए, ल्युकोसैट उप आबादी का विश्लेषण विरोधी मो उपयोग करने के लिएCD45, Ly6G, F4 / 80, CD11c, CD49b, B220, CD3, सीडी 4, और सीडी 8 (1 टेबल): निम्न ल्युकोसैट-कोशिका की सतह मार्कर के साथ प्रतिक्रिया एंटीबॉडी का उपयोग करें।
  4. कोशिकी मार्करों के खिलाफ एंटीबॉडी 5 एमएल polystyrene प्लास्टिक ट्यूब करने के लिए जोड़ दिया गया है एक बार, धीरे मिश्रण। 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए अंधेरे में सेते हैं।
  5. इस ऊष्मायन के दौरान, तैयार करने और (विआयनीकृत पानी से पतला, 1: 5) निर्धारण बफर समाधान पूर्व गर्म यदि जरूरी हुआ तो 37 डिग्री सेल्सियस,। इसके उपयोग के लिए आवश्यक है जब तक अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर बफर रखें।
  6. 30 मिनट ऊष्मायन के बाद, 5 एमएल polystyrene प्लास्टिक ट्यूब में FACS बफर के 500 μl जोड़ने और धीरे मिश्रण। यह कदम कोशिकाओं को धोने और अनबाउंड एंटीबॉडी के किसी भी अधिक दूर करने के लिए आवश्यक है।
  7. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,250 XG पर नमूने अपकेंद्रित्र। महाप्राण और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    नोट: इंट्रासेल्युलर धुंधला की आवश्यकता नहीं है, तो इंट्रासेल्युलर धुंधला की आवश्यकता है, चरण 5 देखना permeabilization के प्रदर्शन और intracellular धुंधला यहां, और उसके निर्धारण (कदम 4.8) के साथ आगे बढ़ें।
  8. सेल गोली पूर्व गर्म निर्धारण बफर समाधान के 500 μl जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए अंधेरे में सेते हैं।
  9. 5 एमएल polystyrene प्लास्टिक ट्यूब में FACS बफर के 500 μl बांटना। धीरे मिलाएं।
  10. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,250 XG पर नमूने अपकेंद्रित्र। महाप्राण और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  11. प्रत्येक नमूने के लिए FACS बफर के 500 μl जोड़ें। इन नमूनों अब फ्लो से विश्लेषण किया जा सकता है। अच्छे परिणाम के लिए तुरंत नमूने मोल।

Unfixable प्रकोष्ठों के लिए 5. व्यवहार्यता धुंधला

  1. कोशिकी immunophenotyping के बाद, FACS बफर के 500 μl में सेल गोली resuspend।
  2. सिर्फ नमूना प्राप्त करने से पहले 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI, 200 माइक्रोग्राम / एमएल) के 1 μl जोड़ें।
  3. एक प्रवाह cytometer का उपयोग कर DAPI जोड़ने के बाद 2 मिनट - 1 के भीतर नमूने कल्पना।

  1. एक बाँझ धूआं हुड के तहत एक कार्य केंद्र तैयार करें। एक नहाने के पानी का उपयोग कर 37 डिग्री सेल्सियस के लिए RPMI संस्कृति के माध्यम से पूर्व गर्म।
  2. सेल गिनती के लिए FACS बफर के 1000 μl में सेल गोली Resuspend।
  3. निर्माता के निर्देशों का पालन एक स्वचालित सेल काउंटर या hemocytometer और 0.4% trypan नीले समाधान का उपयोग व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या की गणना। कुल जीवित कोशिका गिनती रिकॉर्ड।
  4. अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,250 XG पर कोशिकाओं को 10 मिनट FACS बफर को दूर करने के लिए।
  5. धीरे 2 से 3 बार pipetting द्वारा पूर्व गर्म RPMI संस्कृति के माध्यम से 500 μl में सेल गोली Resuspend।
  6. एक बाँझ 24 अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं के वांछित नंबर प्लेट और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। ऊष्मायन समय अनुसंधान प्रश्न द्वारा निर्धारित किया जाएगा।

7. चुंबकीय सेल छंटनी

  1. एमएस कॉलम, चुंबकीय सेल विभाजक, 15: निम्नलिखित सामग्री के साथ एक साफ कार्य केंद्र स्थापितएमएल शंक्वाकार ट्यूब, 30 माइक्रोन पूर्व जुदाई फिल्टर, और एक बहु-स्टैंड।
  2. एमएसीएस बफर (0.5% बीएसए, 2mm EDTA, 1x पीबीएस समाधान, पीएच 7.2) के 500 μl में सेल गोली Resuspend।
  3. एक स्वचालित सेल काउंटर या hemocytometer और 0.4% trypan नीले समाधान का उपयोग करना, गिनती और कुल जीवित कोशिका गिनती रिकॉर्ड है।
  4. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,250 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। महाप्राण और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। एमएसीएस बफर का एक और 500 μl जोड़ें।
  5. निर्माता की सिफारिशों का पालन चुंबकीय जुदाई प्रदर्शन करने के लिए आगे बढ़ें।
  6. फ्लो या माइक्रोस्कोपी द्वारा पवित्रता का निर्धारण करते हैं।

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Representative Results

मातृ-भ्रूण इंटरफ़ेस से murine ऊतकों के विच्छेदन चित्र 1 में दिखाया गया है; इस प्रक्रिया पेरिटोनियल गुहा (चित्रा 1 ए, बी), आरोपण साइटों (चित्रा -1) सहित गर्भाशय सींग (चित्रा 1C), और गर्भाशय के ऊतकों का संग्रह (चित्रा 1E), नाल (चित्रा 1F), और decidual ऊतकों खोलने शामिल 16.5 (चित्रा 1G) डीपीसी। चित्रा 2 अलग मैक्रोफेज की आकृति विज्ञान से पता चलता है (F4 / 80 +) चुंबकीय सेल छँटाई का उपयोग करते हुए 16.5 डीपीसी पर decidual और गर्भाशय के ऊतकों से एकत्र की। पृथक मैक्रोफेज (डेटा) नहीं दिखाया साइटोकिन्स को रिहा करने की क्षमता बनाए रखने के लिए। पत्या, गर्भाशय, और प्लेसेंटा से अलग व्यवहार्य कोशिकाओं की उपज में 3 चित्र में दिखाया गया है, और सेल व्यवहार्यता सभी ऊतकों में अधिक से अधिक से अधिक 70% है। 4 चित्रा polymorphonucle विश्लेषण करने के लिए gating रणनीति से पता चलता है टी कोशिकाओं (CD45 + CD3 +) न्यूट्रोफिल (CD45 + Ly6G +) मैक्रोफेज (CD45 + F4 / 80 +) वृक्ष के समान कोशिकाओं (CD45 + CD11c +) और एन.के. कोशिकाओं सहित singlets और व्यवहार्यता फाटकों के भीतर की गिरफ्तारी और मोनोन्यूक्लियर ल्यूकोसाइट्स (CD45 + 16.5 डीपीसी पर CD49b +)। सह-एक्सप्रेस CD11c मैक्रोफेज की एक उच्च अनुपात। 5 चित्रा 16.5 डीपीसी पर न्यूट्रोफिल, मैक्रोफेज, और टी कोशिकाओं decidual, गर्भाशय में, और अपरा ऊतकों को दर्शाता है। आंकड़ा 6, Singlets और व्यवहार्यता फाटकों के भीतर लिम्फोसाइटों का विश्लेषण करने सहित के लिए gating रणनीति से पता चलता है टी कोशिकाओं (CD45 + CD3 +) और 16.5 डीपीसी में बी कोशिकाओं (CD45 + B220 +)। टी कोशिकाओं CD4 + और CD8 + टी कोशिकाओं में शामिल हैं। मातृ-भ्रूण इंटरफेस में Murine ऊतकों भी उच्च अनुपात में CD3 + सीडी 4-CD8- (गामा-डेल्टा टी कोशिकाओं) शामिल हैं। 7 decidual, गर्भाशय में टी कोशिकाओं और बी कोशिकाओं से पता चलता है, और 16.5 डीपीसी में अपरा ऊतकों।

जेपीजी "चौड़ाई =" 700 "/>
चित्रा 1. ऊतक विच्छेदन। एक बी -6 माउस में 16.5 डीपीसी में (ए) गर्भाशय सींग। गर्भाशय सींग अन्त्रपेशी और draining वाहिकाओं से जुड़े होते हैं। (बी) गर्भाशय सींग अन्त्रपेशी से विच्छेदित और अभी भी गर्भाशय ग्रीवा से जुड़ी। आरोपण साइटों और गर्भाशय ग्रीवा सहित (सी) गर्भाशय सींग। एक आरोपण साइट (डी) विच्छेदन। आरोपण साइट से गर्भाशय के ऊतकों (ई) विच्छेदन। आरोपण साइट से नाल और पत्या की (एफ) पृथक्करण। (जी) टुकड़ी नाल से पत्या (सफेद ग्रे परत) की। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. मैक्रोफेज decidual और गर्भाशय के ऊतकों से अलग किया। मैक्रोफेज (F4 / 80 + कोशिकाओं) चुंबकीय सेल छँटाई का उपयोग करते हुए 16.5 डीपीसी पर decidual और गर्भाशय के ऊतकों से अलग किया। 20X बढ़ाई। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा अलग कक्षों की 3. व्यवहार्यता। Decidual, गर्भाशय, और अपरा ऊतकों से अलग व्यवहार्य कोशिकाओं (तीर के साथ प्रतिनिधित्व DAPI- कोशिकाओं)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Polymorphonuclear और मोनोन्यूक्लियर ल्यूकोसाइट्स के लिए चित्रा 4. Gating रणनीति। कुल ल्युकोसैट आबादी singlets और व्यवहार्यता फाटकों के भीतर gated किया गया था। टी कोशिकाओं (CD45 + CD3 +) मैक्रोफेज (CD45 + F4 / 80 +) न्यूट्रोफिल (CD45 + Ly6G +) वृक्ष के समान कोशिकाओं (CD45 + CD11c +) और एन.के. कोशिकाओं (CD45 + CD49b +) (कुल-ल्युकोसैट फाटक के भीतर gated गया CD45 +)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
मातृ-भ्रूण इंटरफेस में murine ऊतकों में चित्रा 5. न्यूट्रोफिल, मैक्रोफेज, और टी कोशिकाओं। न्यूट्रोफिल (CD45 + Ly6G +) मैक्रोफेज (CD45 + F4 / 80 +) और टी कोशिकाओं (CD45 + CD3 +) व्यवहार्यता के भीतर gated गया और कुल-ल्युकोसैट (CD45 +) पृथक decidual, गर्भाशय, और अपरा कोशिकाओं में फाटकों।टीपीएस: //www.jove.com/files/ftp_upload/52866/52866fig5highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 लिम्फोसाइटों के लिए Gating रणनीति। मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं singlets और व्यवहार्यता फाटकों के भीतर gated थे। टी कोशिकाओं (CD3 +) और बी कोशिकाओं (B220 +) व्यवहार्यता फाटक के भीतर gated थे। सीडी 4 + और ​​CD8 + टी कोशिकाओं टी सेल फाटक (CD3 +) के भीतर gated गया। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
मातृ-भ्रूण इंटरफेस में murine ऊतकों में चित्रा 7. लिम्फोसाइट उप आबादी। टी कोशिकाओं (CD3 +)और बी कोशिकाओं (B220 +) पृथक decidual, गर्भाशय, और अपरा कोशिकाओं में व्यवहार्यता फाटक के भीतर gated थे। सीडी 4 + और ​​CD8 + टी कोशिकाओं टी सेल फाटक (CD3 +) के भीतर gated गया। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सेल मार्कर Fluorochrome क्लोन कंपनी सूची की संख्या
लाइव / मृत DAPI - जीवन टेक्नोलॉजीज L23105
CD45 V450 30-F11 बी.डी. बायोसाइंसेज 560,501
CD3 FITC 145-2C11 बी.डी. बायोसाइंसेज 553,062
सीडी 4 एपीसी RM4-5 बी.डी. बायोसाइंसेज 553,051
सीडी 8 पीई-CF594 53-6.7 बी.डी. बायोसाइंसेज 562,283
B220 एपीसी-Cy7 RA3-6B2 बी.डी. बायोसाइंसेज 552,094
F4 / 80 पीई BM8 eBiosciences 12-4801-82
Ly6G एपीसी-Cy7 1A8 बी.डी. बायोसाइंसेज 560,600
CD49b एपीसी DX5 बी.डी. बायोसाइंसेज 560,628
CD11c पीई Cy7 HL3 बी.डी. बायोसाइंसेज 558,079

एंटीबॉडी की तालिका 1. सूची ल्युकोसैट सबसेट immunophenotyping के लिए उपयोग

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Discussion

मातृ-भ्रूण इंटरफेस में घुसपैठ leukocytes की बहुतायत और प्ररूपी विशेषताओं है कि रिकॉर्ड संगत डेटा के संग्रह गर्भावस्था संबंधी जटिलताओं के रोगजनन को समझने के लिए आवश्यक है। कई तकनीकों गर्भावस्था 31,38,39,43-46 भर में मातृ-भ्रूण इंटरफेस में murine ऊतकों से ल्यूकोसाइट्स घुसपैठ के अलगाव की सुविधा है कि वर्णित किया गया है। हालांकि, प्रत्येक तकनीक अलग है, हमेशा अलग कक्षों की व्यवहार्यता निर्दिष्ट नहीं करता है, सबसे महत्वपूर्ण बात, एंजाइम या एंजाइम संयोजन विभिन्न उपयोगों की आवश्यकता है अलग हदबंदी बार, ऊतक की मात्रा निर्दिष्ट नहीं करता है, और। इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल उच्च व्यवहार्यता के साथ मातृ-भ्रूण इंटरफेस में murine ऊतकों से ल्यूकोसाइट्स घुसपैठ के अलगाव की अनुमति देता है, और में मान्य विस्तृत वाणिज्यिक अभिकर्मकों के बारे में जानकारी, बफर तैयारी, ऊतक मात्रा में है, और ऊष्मायन बार प्रदान करता हैप्रयोगशाला।

ल्युकोसैट अलगाव की प्रक्रिया का सबसे महत्वपूर्ण कदमों में से एक ऊतक हदबंदी है; इस चरण प्ररूपी लक्षण वर्णन 47 में इस्तेमाल किया कोशिकी प्रोटीन की अखंडता को बदल सकते हैं कि यांत्रिक homogenization और / या एंजाइमी प्रतिक्रियाओं शामिल है। इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल नाल और चूहों के decidual और गर्भाशय के ऊतकों से अलग ल्यूकोसाइट्स में कोशिकी मार्कर की अखंडता की रक्षा करने के लिए कोमल यांत्रिक और enzymatic ऊतक हदबंदी तकनीकों के उपयोग को जोड़ती है एक उपन्यास दृष्टिकोण प्रदान करता है।

एकल एंजाइम और विभिन्न एंजाइमों के संयोजन मातृ-भ्रूण इंटरफ़ेस 31,32,39,44 पर murine ऊतकों से घुसपैठ ल्यूकोसाइट्स अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। कई मामलों में, प्रयोगशाला में हाथ से विशिष्ट सांद्रता के लिए तैयार कर रहे हैं कि इन एंजाइमों मानव त्रुटि के अधीन किया जा सकता है। यहाँ, इसके बजाय, एक के लिए तैयार करने के लिए उपयोग शुद्ध collagenase / तटस्थ protकॉकटेल, Accutase, प्रयोगशाला में लागू किया गया है आसानी; एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंजाइम तैयारी के रूप में, यह सेल संस्कृति 48 में विश्वसनीय परिणाम प्रदान करने के लिए दिखाया गया है। इस एंजाइमी समाधान सतह खोने 48 प्रतिजन के बिना प्रभावी ढंग से, सबसे महत्वपूर्ण बात, scraping और बिना संस्कृति प्लेटों से मैक्रोफेज अलग करने के लिए जाना जाता है। यह तैयार एंजाइम भी उनके बाद संस्कृति 47 की अनुमति देता है, जो लंबी अवधि के लिए स्थायी रहते हैं कि व्यवहार्य अलग कक्षों में जिसके परिणामस्वरूप, मानव और पशुओं के तंत्रिका तंत्र के ऊतकों की पाचन प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल किया गया है। इसके अलावा, इस एंजाइमी समाधान केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के ऊतकों 47 से अलग कक्षों में CD24 प्रतिजनकता बरकरार रखता है। Liberase -1, collagenase और तटस्थ प्रोटीज का एक और कॉकटेल, न तो Accutase और न ही Liberase-1 मुक्त डीएनए समुच्चय उत्पन्न करने के लिए जब तुलना में; हालांकि, Accutase ऊतक हदबंदी 47 के दौरान Liberase-1 से gentler है। collagenase / तटस्थ प्रोटीज सहइस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल cktail भी CD44, एक कैंसर स्टेम कोशिका की सतह मार्कर 49 के संरक्षण में trypsin के लिए श्रेष्ठता का प्रदर्शन किया है। इस प्रयोगशाला का लगातार अध्ययन से इस एंजाइमी समाधान माउस ल्युकोसैट सतह एंटीजन को बरकरार रखता है कि उल्लेख किया है। दरअसल, जानकारीपूर्ण मतभेद मैक्रोफेज में कोशिकी मार्करों की अभिव्यक्ति में पाया गया है (CD11b + F4 / 80 + कोशिकाओं), न्यूट्रोफिल (CD11b + Ly6G + कोशिकाओं), NKT कोशिकाओं (CD3 + CD49b + कोशिकाओं), टी कोशिकाओं (CD3 + कोशिकाओं) और बी सीडी 4, सीडी 8, CD69, CD25, CD40L, PD1, CD44, CD62L, और CTLA4, और साइटोकाइन रिलीज में शामिल कोशिकाओं (B220 CD19 + कोशिकाओं +)। इसलिए, इस के साथ साथ वर्णित विधि प्रतिनिधि परिणामों में दिखाया गया है, चूहों में मातृ-भ्रूण इंटरफेस में ल्यूकोसाइट्स घुसपैठ की immunophenotyping के लिए इष्टतम है।

इस विधि से एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि व्यवहार्यता गेट के भीतर कई बाह्य और intracellular एंटीजन का एक साथ दृढ़ संकल्प है। डाई सबसे डे के लिए इस्तेमाल कियाtermine सेल व्यवहार्यता propidium आयोडाइड (पीआई) है; यह केवल FITC के साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है के बाद से हालांकि, इसके उपयोग सीमित है। गड़बड़ी के लिए पर्याप्त रूप से नीले और लाल लेसरों 50 से उत्साहित अधिकांश अन्य fluorochromes से प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता क्योंकि यह है। एक समाधान DAPI के 50 या यूवी लेजर द्वारा नहीं बल्कि आमतौर पर immunophenotyping के लिए इस्तेमाल किया, नीले और लाल लेसरों से उत्साहित है कि किसी भी अन्य रंग का उपयोग करने के लिए है। यह unfixable कोशिकाओं या फिक्स कोशिकाओं के लिए व्यवहार्यता डाई के प्रयोग के लिए DAPI 50 का उपयोग भी शामिल रूप में इस प्रोटोकॉल व्यवहार्य कोशिकाओं की immunophenotyping अनुमति देता है।

इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल का एक दूसरा महत्वपूर्ण लाभ यह है कि यह व्यवहार्य कोशिकाओं के एक उच्च उपज के साथ leukocytes के अलगाव की अनुमति देता है। प्रतिनिधि डेटा अलग कक्षों का 70% 89% तक व्यवहार्य हैं कि पता चलता है। इस प्रोटोकॉल मातृ-भ्रूण इंटरफेस में murine ऊतकों से अलग कक्षों के कार्यात्मक गुणों के अध्ययन की अनुमति दी है के रूप में इस महान महत्व का है। एफया उदाहरण के लिए, decidual और गर्भाशय मैक्रोफेज और उत्तेजना के तहत साइटोकाइन रिहाई के अध्ययन की संस्कृतियों के लिए इस विधि का उपयोग किया गया है।

की व्यवहार्यता की रक्षा करने के लिए 1) ऊतक संग्रह पेरिटोनियल गुहा खोलने के बाद 5 से 10 मिनट के भीतर किया जाना चाहिए, और इन ऊतकों बर्फ पर रखा जाना चाहिए: निम्नलिखित कारकों पर विचार जब सफल परिणाम प्राप्त करने के लिए, वर्णित प्रोटोकॉल के आवेदन के लिए महत्वपूर्ण है अलग कक्षों; 2) यांत्रिक ऊतक homogenization ठीक-टिप कैंची का उपयोग किया जाना चाहिए और लंबी अवधि व्यवहार्य कोशिकाओं की उपज को कम करने के लिए प्रदर्शन किया गया है के बाद से 2 मिनट से अधिक नहीं हो सकता है; अपनी गतिविधि समय की इस अवधि के बाद कम हो के बाद 3) एंजाइमी समाधान के साथ ऊष्मायन की अवधि कम से कम 1 घंटा होना चाहिए; 4) एंजाइमी समाधान के साथ ऊष्मायन के तापमान एंजाइमों के इस कॉकटेल का इष्टतम गतिविधि प्राप्त करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाना चाहिए; 5) सेल गोली manipभंवर का उपयोग कोशिकाओं की अखंडता (अलग कक्षों को आसानी से अपने व्यवहार्यता को कम कर सकते हैं विभेदित और अचानक हेरफेर कर रहे हैं) को नुकसान पहुंचा सकता है क्योंकि आबादी micropipettes के साथ धीरे से किया जाना चाहिए; 6) बफर और अपकेंद्रित्र तापमान सेल निलंबन के रूप में ही तापमान पर रखा जाना चाहिए; उनकी व्यवहार्यता तेजी से कम कर देता है के रूप में 7) अलग कक्षों immunophenotyping के लिए कार्रवाई या तुरंत इस्तेमाल किया जाना चाहिए; immunophenotyping जब प्रदर्शन और 8), नमूने अच्छे परिणाम के लिए कोशिकामापी तुरंत एक प्रवाह का उपयोग कर हासिल किया जाना चाहिए।

इस प्रोटोकॉल की एक सीमा भी इसी तरह काम करता है, जैसे, ट्रिप्सिन, dispase द्वितीय, और collagenase साथ अन्य एंजाइमों की तुलना में महंगा है जो एंजाइमी समाधान की लागत है। हालांकि, इस एंजाइमी समाधान पर और वर्णित एंजाइमों से ऊपर प्रदर्शित करता है कि फायदे के लिए बेहतर होते हैं।

Immunophenotyping और सेल संस्कृति और छँटाई के अलावा, इस प्रोटोकॉल के भविष्य के आवेदनों परमाणु रहे हैंmerous और विविध। उदाहरण के लिए, यह अलग ल्यूकोसाइट्स में इन विट्रो ल्युकोसैट कार्यक्षमता (उदाहरण के लिए, phagocytosis, cytotoxicity, टी-सेल प्रसार और plasticity assays के, आदि), और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन में डीएनए मेथिलिकरण, लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति है, यह निर्धारित करने के लिए अब संभव है मातृ भ्रूण इंटरफेस में murine ऊतकों से। दरअसल, मातृ-भ्रूण इंटरफेस में murine ऊतकों में नए और दुर्लभ leukocytes के वर्णन भी किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक ब्याज की कोई संघर्ष का खुलासा।

Acknowledgments

एनजीएल मातृ, प्रसवकालीन और बाल स्वास्थ्य में वेन स्टेट यूनिवर्सिटी प्रसवकालीन इनीशिएटिव द्वारा समर्थित किया गया। हम कृतज्ञता पांडुलिपि के अपने महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए मॉरीन McGerty और एमी ई Furcron (वेन स्टेट यूनिवर्सिटी) स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Magentic Cell Separation
MS Columns Militenyi Biotec 130-042-201
Cell Separator Militenyi Biotec 130-042-102
30 μm pre-separation filters Militenyi Biotec 130-041-407
Multistand Militenyi Biotec 130-042-303
15 ml conical tubes Thermo Fisher 339650
MACS Buffer Militenyi Biotec Laboratory preparation (0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1x PBS, pH 7.2)
Reagents
Accutase enzymatic solution Life Technologies A11105-01
Anti-mouse CD16/CD32 BD Biosciences 533142
Anti-mouse extracellular antibodies BD Bioscences/eBiosciences Table 1
Sodium azide Fisher S227-500
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7906-100G
LIVE/DEAD viability dye Life Technologies L23105
Fixation buffer solution BD Biosciences 558049
FACS Buffer BD Biosciences Laboratory preparation 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 1x PBS, pH 7.4
Trypan blue solution 0.4% BIO-RAD 145-0013
Fetal bovine serum (FBS) Life Technologies 16000-044
Additional Instruments
Incubator with shaker Thermo Scientific MaxQ 4450
Flow cytometer BD LSRFortessa
Centrifuge Thermo Scientific Legend LXTR
Vacuum system laboratory constructed
Incubator Thermo Scientific Incubator 3307
Water bath Precision 51221035
Cell counter BIO-RAD TC20 Automated Cell Counter
Optical and fluorescence microscopes Zeiss and Olympus Zeiss LSM780 and Olympus CKX41

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 99 पत्या पृथक्करण अलगाव leukocytes myometrium नाल गर्भावस्था गर्भाशय
मातृ-भ्रूण इंटरफेस पर Murine ऊतकों से leukocytes की अलगाव
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Arenas-Hernandez, M., Sanchez-Rodriguez, E. N., Mial, T. N., Robertson, S. A., Gomez-Lopez, N. Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface. J. Vis. Exp. (99), e52866, doi:10.3791/52866 (2015).

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