Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

דור של תנודות γ CA1 מקומיות על ידי גירוי Tetanic

Published: August 14, 2015 doi: 10.3791/52877
Automatic Translation
1, 1, 1
1The Florey Institute of Neuroscience and Mental Health, University of Melbourne

Summary

תנודות הן מאפייני רשת בסיסיים והם מווסתים על ידי מחלה ותרופות. לומד תנודות המוח פרוסה מאפשר אפיון של רשתות מבודדות בתנאים מבוקרים. פרוטוקולים ניתנים להכנת פרוסות מוח חריפות ללעורר תנודות γ CA1.

Abstract

תנודות רשת עצביות הן תכונות חשובות של פעילות מוח בבריאות ובמחלה ויכולות להיות מווסתת על ידי מגוון רחב של תרופות בשימוש קלינית. פרוטוקול מסופק ליצור מודל לחקר תנודות γ CA1 (20 - 80 הרץ). תנודות γ אלה הן יציבים לפחות 30 דק 'ותלויים בפעילות הסינפטית מעוררת ומעכבת בנוסף להפעלה של זרמי קוצב לב. יש תנודות מגורה Tetanically מספר המאפיינים לשחזור בקלות ובכימות כוללים ספירת ספייק, משך תנודה, חביון ותדירות שתדווחנה על מצב הרשת. היתרונות של תנודות גירוי חשמלי כוללים יציבות, שחזור ורכישת אפיזודי המאפשרים אפיון חזק של פונקצית רשת. מודל זה של תנודות γ CA1 יכול לשמש כדי לחקור מנגנונים תאיים ולחקור באופן שיטתי כיצד עצבי רשת פעילות משתנה במחלה ועל ידי תרופות.פרמקולוגיה מדינת מחלה ניתן לשלב בקלות על ידי השימוש בפרוסות מוח ממודלים של בעלי חיים מהונדסים גנטי או התערבותית כדי לאפשר בחירה של תרופות שמתמקדות מנגנוני מחלה.

Introduction

תנודות רשת המוח מתרחשות בתוך תחומי תדרים שונים שתואמים למדינות התנהגותיות. במכרסמים, תנודות בהיפוקמפוס θ (5 - 10 הרץ) הם נצפו בהתנהגויות גישוש 1,2, תוך תנודות γ - עמית (20 80 הרץ) עם תהליכים קוגניטיביים שונים, כוללים תפיסה ותשומת לב 3,4. פעילות רשת γ סינכרוני גם מעורבת בפתולוגיה של הפרעות כגון 5,6 אפילפסיה וסכיזופרניה. לדוגמא, תנודות γ הם חשבו מתאימות לאזורים של מוקדי אפילפסיה קליפת המוח 5,7,8 ויכולות לשמש כסמנים של pharmacosensitivity או התנגדות, שני תחומים חשובים של חקירה באפילפסיה מחקר 9.

פרוסת המוח בהיפוקמפוס היא מודל שכבר בשימוש נרחב כדי לחקור את פעילות רשת 10-12. פרוטוקולים שונים פותחו כדי ליצור תנודות γ בפרוסות מוח, כי בדרך כלל אניאפנון תרופתי nvolve כגון Mg 2 + הנמוך, 4-aminopyridine (4AP), bicuculline, וחומצת kainic 12-17. חסרונות של תנודות מופעלות פרמקולוגית הם שהם מתרחשים באופן אקראי לאחר יישום סמים ולא אמין שנוצרו או יציב לאורך זמן. חשמלי מופעל תנודות γ להתגבר רבות של בעיות אלה וגם יש את היתרון של להיות נעול באופן זמני לאירוע המעורר המאפשר הקלטה וניתוח אפיזודי. הנה פרוטוקול מתואר ליצירת תנודות γ CA1 ידי מתן גירוי tetanic לאוריין השכבה בפרוסה בהיפוקמפוס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים על עכברים שאושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים Florey המכון.

1. הגדרה לחיתוך פרוסות המוח

  1. הכן פתרון חיתוך המורכב מ( מ"מ) 125 כולין-Cl, 2.5 KCl, 0.4 CaCl 2, 6 MgCl 2, 1.25 לאא 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 20 D-גלוקוז רווי בגז carbogen (95% O 2 -5 (פתרון הקלטת aCSF)% CO 2) ונוזל השדרתי מלאכותי מורכב מ( מ"מ) 125 NaCl, 2.5 KCl, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 1.25 לאא 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 10 D-גלוקוז, רווי ב carbogen. מניחים את פתרון החיתוך על קרח כדי לשמור אותו קר.
  2. להקפיא כ 400 מיליליטר של פתרון החיתוך ומתמזג עם פתרון של חיתוך יצאה מן ההקפאה 100 מיליליטר ליצור slurry קרח. בועה עם carbogen (95% CO 2 -5% O 2) בזרימה של כ 0.5 ליטר / דקה דרך ג הקטןצינורות aliber או זכוכית sintered לייצר זרם קבוע אך עדין של בועות.
  3. הכן כוס 250 מיליליטר עם הוספת רשת הניילון העלתה על שפרוסות המוח תוצבנה. מלא עם aCSF כדי לכסות את הרשת בכ 2 סנטימטר ובועה עם carbogen, להבטיח כי הבועות לא ישירות לשבש את אזור הפרוסה מחזיקה. כמו כן, חשוב שאין בועות אוויר ברשת הניילון, כך שאם כל נוכחים להסיר אותם. זה יהיה התא מחזיק ונשמר ב RT (20 - 25 מעלות צלזיוס).
  4. פריסת המכשירים לנתח כולל זוג מספריים גדול, מספריים קטנים, מריות מיקרו קטנות וגדולות, וזוגות גדולים והקטנים של מלקחיים ולצנן אותם על קרח. מניחים את גוש חיתוך רקמת vibratome על קרח בריבוע של רדיד אלומיניום. להשיג 2 חתיכות של 6 סנטימטר נייר מסנן, סכין גילוח קצה אחד, וכוס 25 מיליליטר מלא בתרחיף פתרון החיתוך גם כן.
  5. מלא מיכל שני עם קרח, ולהניח פיסת הרקמה פאפאה על הקרח ומניח את צלחת תרבות 12 סנטימטר על גבי. מלא את צלחת התרבות עם חיתוך קרח slurry פתרון ובועה עם carbogen. זה הוא המכל שבו נתיחת המוח עם להתבצע.
  6. הכן את vibratome. הסר סכין גילוח טרי פיפיות (להשתמש להב טרי בכל פעם) מהעטיפה ולרסס במים ולאחר מכן deionized 80% אתנול. חותך פיפטה העברה פלסטיק 3 מיליליטר בנקודה שבה מתחילה להתחדד. זה ישמש להעברת פרוסות מוח. בנד מחט G 27 בבסיס בכ -45 מעלות ולצרף למזרק 1 מיליליטר. זה ישמש כדי לתפעל פרוסות במהלך חיתוך.

2. חיתוך פרוסות המוח

  1. הרדימי עכבר (P16 - P18) עם 2% isoflurane או שיטה שאושרה באופן מקומי. בעקבות אינדוקציה, לערוף את החיה עם זוג מספריים גדול ושחרר את הראש לתוך צלחת תרבות 12 סנטימטרים המכילה תרחיף פתרון חיתוך בועות. התרחיף חייב לחלוטין לטבול את הראש לקירור מהיר.
  2. החזק את החזית של הראש עם יד אחת קילוף העור ורקמות חיבור קדימה לכיוון האף. בעזרת המספריים הקטנים לחתוך את רקמת החיבור לחשוף את הגולגולת הבסיסית. ואז להסיר את השרירים שמעל היבט גב של הגולגולת והצוואר.
  3. הסר את המוח מהגולגולת על ידי הבטחת הראשונה מול הגולגולת עם המלקחיים הגדולים ולאחר מכן לבצע שני חתכים לרוחב דרך העצם משני צדי הנקב הגדול באמצעות המספריים הקטנים (איור 1, קיצוצי שכותרת A1 ו- A2).
    1. הפוך קיצוץ נוסף בין העיניים (רק קדמית של גבחת) (איור 1, B שכותרתו לחתוך) אז לחתוך בזהירות לאורך תפר sagittal anteriorly ומשקפים את חלקי גולגולת חתך כדי לחשוף את המוח (איור 1, חתך C שכותרתו).
    2. השתמש במרית הקטנה כדי לגרוף את המוח ומקום על צלחת תרבות. להיות מודע לקראןעצבי ial בהיבט הנחות של המוח שצריכים לקטוע, זה יכול להיעשות באמצעות מרית מיקרו בגודל קטנה יותר. מרית גדולה יותר באמצעות העברת המוח לכוס 25 מיליליטר מלא בתרחיף פתרון חיתוך.
  4. הכנת האונה המוח לחיתוך.
    1. מניחים פיסת נייר מסנן 6 סנטימטר אחד בתחתית צלחת תרבות טרי אז למלא עם slurry פתרון חיתוך הטרי ובועה. השתמש במרית הגדולה יותר למצב את המוח, צד הגחון למטה, על נייר הסינון. קח סכין גילוח קצה סינגל חדש וניקה וחתך את המוח כדי להסיר את המוח הקטן, ואז לעשות חתך לאורך קו אמצע כדי להפריד את המוח לשתי אונות.
  5. הכנת בלוק רקמת vibratome.
    1. קח גוש רקמת vibratome המצונן, לייבש את פני השטח, ואת מקום טיפה של דבק cyanoacrylate באמצע ולהתפשט באופן שווה לגודל המשוער של המוח. השתמש במרית הקטנה כדי לתפעל אחדאונות מוח על מרית מיקרו הגדולה כל כך בצד המדיאלי של המוח הוא למטה.
    2. לגעת בקצה של המרית בממשק של המוח על פיסת נייר הסינון השנייה כדי להסיר כמה שיותר מהפתרון אפשרי. חלק את המוח מהמרית הגדולה יותר באמצעות המרית קטנה כדי להנחות אותו על הדבק.
    3. אבטח את לחסום חיתוך לתוך תא vibratome ולמלא את החדר עם slurry פתרון חיתוך ובועה, הבטחת המוח הוא שקוע לחלוטין. סובב את בלוק החיתוך כך הצד הגחוני של המוח מול הלהב.
  6. חותך את המוח.
    הערה: כל vibratome הוא ייחודי כל כך לעקוב אחר הוראות היצרן.
    1. הגדר את העובי הפרוסה עד 450 מיקרומטר, ולהבטיח את הלהב רוטט כמו שהוא עובר דרך המוח במהירות של כ 0.3 מ"מ / s. לחתוך לחלוטין דרך המוח מהצד הגחון אל פני השטח בקליפת המוח, זה יהיה לייצר פרוסות מוח כל sagittal שיכולים בדואר משמש לקלטות אלקטרו. פרוסות יופקו רוחבית למדיאלית ובדרך כלל 3 - ניתן לחתוך 4 פרוסות מכל חצי הכדור.
    2. אם הבסיס של מעליות הפרוסה להשתמש במחט G הכפופה 27 לעיתונות עדינה הפרוסה בחזרה למטה. ככל פרוסה היא לחתוך, להשתמש בפיפטה ההעברה כדי להעביר אותה אל הרציף בתא שבו הם מחזיק קיימא לעד 8 שעות.

3. הקלטות אלקטרופיזיולוגיה תאית

  1. הרכבה הפרוסה בחדר ההקלטה.
    1. באמצעות פיפטה ההעברה, למקם את פרוסת מוח לתא הקלטה שקועה perfused עם aCSF זורם 1 - 2 מיליליטר / דקה ומחומם ל- C ° 32. ACSF משמש להקלטות שונים מזו בתא מחזיק כריכוז Mg 2 + הוא עלה מ 2 מ"מ עד 4 מ"מ.
    2. אבטח את הפרוסה עם "נבל" (פלדת אל-חלד חצי עגולה עם גדילי ניילון נמתחו על פני 2 - מרווח של 3 מ"מ). מקוםהנבל, כך שהגדילים במקביל לCA1. להגדיל את המהירות של זלוף ל8 - 10 מיליליטר / דקה ב 32 מעלות צלזיוס.
  2. תחת מיקרוסקופ לנתח מקום האלקטרודה מגרה והאלקטרודה הקלטה (אלקטרודת זכוכית מלאה בפתרון הקלטת aCSF) על פני השטח של radiatum השכבה של CA1 (איור 2 א). מניחים את האלקטרודה מגרה ראשון ואז למקם את האלקטרודה ההקלטה.
  3. לעורר את שפר טחונות עם 120 - 150 מיקרו-אמפר משרעת ודופק 0.1 בדיקת משך msec ולבחון את צורת גל וכתוצאה משדה פוסט מעורר הסינפטי פוטנציאלי (fEPSP) כדי לקבוע בריאות פרוסה (איור 2). אלקטרודות המגרה והקלטה ייתכן שתהיינה הצורך עברו לפרוסה כ 50-100 מיקרומטר מפני השטח הפרוסה כדי לקבל fEPSP הקלטה עם מטח סיבים קטן ומשרעת גדולים. בטחונות שפר עוררו fEPSPs הן סטריאוטיפיים ולספק אינדיקציה טובה של בריאות פרוסה. Hפרוסות ealthy בדרך כלל להראות מטח סיבים לfEPSP יחס המשרעת של פחות מ -0.3.
  4. למקם מחדש את האלקטרודות.
    1. באמצעות מיקרוסקופ לנתח, להעביר את האלקטרודה מגרה לאמצע אוריין השכבה ולהעביר את האלקטרודה ההקלטה לשכבת תאי הפירמידה הקרובה לאלקטרודה ההקלטה ככל האפשר כפי שמוצג באיור 3 א. אלקטרודות המגרה והקלטה ייתכן שתהיינה הצורך דחפו לתוך הפרוסה כ 50-100 מיקרומטר כך שמשרעת תגובת fEPSP ל120 - דופק בדיקת מיקרו-אמפר 150 היא כ 1 mV.
  5. יצירת תנודות γ.
    1. כדי ליצור תנודות γ לעורר את הרקמה עם רכבת של 20 x 0.1 פולסים msec נמסרו ב 200 הרץ. גירוי tetanic זה יכול להניב תגובות לשחזור כאשר נמסרו כל 5 דקות.
  6. השתמש בפרמטרים הבאים ההקלטה.
    1. קנה מידה של הרווח של אות הפלט כדי להתאים את טווח מתח כניסה שלאנלוגי ממיר דיגיטלי ל. ודא שטיול אות מקסימאלי צפוי משתמש מינימום של 30% מטווח מתח כניסה. היזהר בעת קביעת רווחים גבוהים כאותות עשויים קליפ. רוחב הפס הטיפוסי הנדרש להקלטות שטח הוא הרץ 500 עם צימוד AC 0.1 הרץ להסיר להיסחף בסיס.
    2. עבר דיגיטציה לפחות 4-5 פעמים מהר יותר מאשר תדירות פינת מסנן המעביר הנמוך, כדי למנוע aliasing אות.
  7. ניתוח נתונים.
    1. נתונים לעבור סינון גבוה ב 5 הרץ כדי להסיר כל משמרות בסיס. לזהות קוצים באמצעות סף נגזר, עם מרחק מינימאלי של 10 אלפיות שנייה אירוע, זמן אירוע אופייני לשיא ומרווח נסיגה של 7 אלפיות, סף ~ 100 mV / msec, ועמק מפריד של 100%. לחשב השהיה כזמן שלוקח לספייק זוהה לראשונה להתרחש לאחר תום חפץ הגירוי. ניתוח זה מאפשר לאפיון של מספר הקוצים, חביון, מרווח בין אירוע, ומשך מחושב ככדלקמן:
    2. לחשב את מספר הקוצים כמספר הכולל של קוצים לתנודה עבור כל לטאטא נקבע.
    3. לחשב את זמן אחזור התנודה. לכל תנודה, להפחית את הזמן של ספייק זוהה לראשונה מסוף חפץ הגירוי.
    4. לחשב את הרווח הממוצע בין האירוע (ISI). לקבוע את פרק הזמן בין קוצים מזוהים מרובים וממוצע.
    5. חשב את משך התנודה. מדוד את הזמן בין ספייק זוהה הראשון והאחרון בכל תנודה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

גירוי Tetanic של אוריין השכבה שנוצר תנודות γ חזקות ושחזור (35.4 ± 2.2 הרץ), ראה איור 3. על מנת להוכיח כי התנודות נוצרו בתוך רשת CA1 המקומית התשומות מCA3 נותקו על ידי החיתוך הפרוסה באזור Ca 2 באמצעות מחט G 32 כפופה. מאפייני התנודה בפרוסות לחתוך לא היו שונים מהפרוסות חתוכות (p = 0.85; פרוסות לחתוך 6.16 ± 1.1 קוצים, n = 6; פרוסות חתוכות 5.89 ± 0.8 קוצים, n = 6), מצביעים על כך שהתנודות נוצרות באופן מקומי.

יתרון חשוב של שיטה זו הוא היציבות של הקלטות. כאשר טטנוס נמסר ב5-דקות מרווחי התנודות היו יציבים במשך לפחות 30 דקות לכל פרוסה נתון (p = 0.26 עבור מספר הקוצים בלעומת 15 דקות 30 דקות). יש שונות בין פרוסות במספר הכולל של קוצים בתוך תנודה ופרמטרים נוספים. לדניתן לעשות מחקרי שטיח לזווג ניסויים כך שהבדלים במאפיינים בסיסיים הם גורמי קטין. לשונות השוואות תוך-פרוסה יכולה להיות דאגה וניתן להתגבר על ידי השוואות מספיק שיפור יכולות.

בשלב הבא, תעלות היונים וקולטנים הנדרשים לדור של תנודות γ אלה עוררו tetanically CA1 נחקרו. מצור תרופתי של α-אמינו-3-הידרוקסי-5-מתיל-4-isoxazolepropionic חומצה (AMPA) קולטני עם 20 מיקרומטר 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-דיונה (CNQX) (איור 4 א ', ב'), GABA קולטנים עם 20 bicuculline מיקרומטר (איור 4C), אני h נוכחי עם 20 מיקרומטר 4 (N-אתיל-N-phenylamino) -1,2-דימתיל-6- כלוריד (methylamino) pyrimidinium (ZD7288) (איור 4D), ו- T-הסוג Ca 2 + ערוצים עם 100 מיקרומטר Ni 2 + (איור 4E) כל היו באופן עצמאי תוכל לצמצם את מספר הקוצים שנוצרו(P <0.05; CNQX n = 6; bicuculline n = 7; ZD7288 n = 6; Ni 2 + n = 6). יישום של -amino-5-phosphonopentanoate (2R) (AP5, 20 מיקרומטר) לא השפיע על מספר הקוצים (p = 0.22; n = 5; AP5, 5.9 ± 3.1 קוצים; שליטה, 8.3 ± 2.2 קוצים), המצביע על כך קולטני NMDA אינם מעורבים בדור תנודת γ בהכנה זו.

הכנה זו היא אידיאלית לקביעת הפעולה בקנה מידה של רשת סמים. Retigabine היא תרופה אנטי-אפילפטי בשימוש קליני שנפתחה ערוצי אשלגן ומפחית את רגישות קרום 18-20. יישום אמבט של retigabine מיוצר הפחתת מינון תלוי במספר הקוצים ובזמן של התנודה (איור 5).

איור 1
סכמטי באיור 1. של הגולגולת ושמעל העור מראה מיקום של חתכים מחדש בשר עגל המוח. A1, A2, B ו- C לסמן את מיקומם של קיצוצים שצריכים להיעשות כדי לפתוח את הגולגולת להסרת המוח. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. מיקום של אלקטרודות מגרה וההקלטה בשפר CA1 בטחונות לבריאות פרוסה מבחן. (א) מראה מיקום של האלקטרודה מגרה (סטים) ואת האלקטרודה ההקלטה (Rec). (ב) דוגמא מייצגת של fEPSP עורר על ידי גירוי מיקרו-אמפר 120 (מטח סיבים המסומנים על ידי *). אנא לחץ כאן לצפייה גדולה יותר גרסה של נתון זה.

jove_content "FO: לשמור-together.within עמודים =" תמיד "> איור 3
תצורת איור 3. אלקטרודות הקלטה וגירוי משמשת לעורר תנודה. (א) מיקום של האלקטרודה המגרה (סטים) באלקטרודה אוריין השכבה והקלטה (Rec) בpyramidale השכבה של CA1. (ב) דוגמא מייצגת של תנודות γ הנגרמות על ידי גירוי tetanic (מסומנות חפץ ידי "סטים"). עקבות נציג מראים יציאות לכימות. מרווח בין ספייק ISI. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. אפיון תרופתי של gener tetanicallyתנודות ated γ. () עקבות נציג מדגימות את ההשפעה של CNQX. גרפים הממחישים את ההשפעה של (B) CNQX (20 מיקרומטר; n = 6), (ג) bicuculline (20 מיקרומטר; n = 7), (ד) ZD7288 (20 מיקרומטר; n = 6) ו- (ה) Ni 2 + (100 מיקרומטר, n = 6) במספר הקוצים. הנתונים מוצגים כהשוואות לזווג. * P <0.05, ** p <0.01 ו, *** p <0.001. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
השפעות איור 5. Retigabine על נכסי רשת. דוגמאות מייצגות מראה את פעילות הרשת המופחתת של תנודות מושרה () בתנאי שליטה ו( ב) ו- <strong> (C) עם retigabine. סיכום של ההשפעות מוצגות בהשהית הספירה (ד ') עלייה חדה, (ה) משך תנודה, (F) לתחילת תנודה, ומרווח (G) בין-ספייק (ISI). הנתונים מוצגים כהשוואות לזווג. * P <0.05. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיטה חזקה כדי ליצור תנודות γ CA1 בפרוסות מוח חריפות מתוארת. התנודות שנוצרו נובעות ממעגל מקומי מאפשר הזדמנות טובה יותר לשליטה והבנת בסיס neurophysiological של תנודות רשת 12. כל ערוצי 2 + קולטני AMPA, קולטני GABA, אני שעות ו- T-הסוג Ca נדרשים לתנודות γ במודל זה. בעוד תנודות CA1 המקומיות שתוארו כאן יכולות להיות שנוצרו חסונה זה תלוי בהבטחת שפרוסות המוח בריאה. שלב קריטי הוא ההסרה מהירה של המוח מהגולגולת, נזהרת שלא לחדור למוח בזמן ההסרה וטבילה אז מהירה בפתרון קר כקרח. באופן אידיאלי את הזמן בין עריפת הראש וההסרה של המוח מהגולגולת צריך להיות לא יותר מ 30 - 60 שניות כדי לשמור על בריאות פרוסה 21.

באמצעות גירוי tetanic תנודות γ CA1 מקומיים יכולות להיותנוצר בפתרונות הקלטה פיסיולוגיים סטנדרטיים ללא הסתמכות על סוכנים תרופתיים. זהו יתרון לאפיון פתולוגיות במודלי מחלה שבי תוספת של סוכנים תרופתיים עשויה לבלבל פרשנות. לדוגמא, באמצעות פעילות זו המודל מקומית CA1 ורגישות לתרופות אנטי-אפילפטי היה משופר במודל עכבר של אפילפסיה גנטית אנושית 22. השימוש במודל זה כדי לחקור את פעילות רשת אינו מוגבל לאפילפסיה ועשוי בקלות להיות מיושם על מחלות אחרות כמו מחלות, אוטיזם וסכיזופרניה אלצהיימר. בעוד סוכנים תרופתיים אינם נדרשים ליצור תנודות CA1 המקומיות חמצון רקמות מספיק הוא, בשל ביקוש חילוף החומרים של פרוסת המוח 23. שיעורי זלוף גבוהים לשפר את החמצן ו- pH איזון בתוך הפרוסה יצירת סביבה פיזיולוגית יותר לפרוסות מוח 24,25.

יתרון נוסף של שימוש בגירוי tetanic לgeneratתנודות רשת דואר היא שעיצוב ניסיון אפיזודי יכול לשמש המאפשר כימות מוכן יותר של פרמטרים פעילות רשת, כגון עיכוב למספרי תחילת, משך וספייק, באופן חזרתי. לעומת זאת, פעילות רשת מושרה כימי היא ספונטנית 13,15,16,26-28 ויותר קשה לכמת. גירוי Tetanic, לעומת זאת, יכול לגרום לשינויים בפלסטיות הסינפטית קולט תלוי NMDA, אשר יכול לגרום לשינויים בפעילות רשת לאורך זמן. כדי לשלוט על זה ולאפשר דור תנודה יציב לאורך שינויי פלסטיות גירויים tetanic מרובים יכול להיות מוגבל על ידי העלאת רמות 2 + Mg. למרות שפרוטוקול זה משפר שחזור הוא אטום לכל השפעה של תפקוד הקולטן NMDA.

חדרי הקלטת ממשק יכולים לשפר את הבריאות פרוסה, להניב אות טובה יותר ליחסי רעש וגירוי בעוצמה יותר מוקדי נמוכים עם הערך המוסף של חפצי גירוי קטנים יותר. chambe מחוררשיטות הקלטת r גם לשפר את הבריאות פרוסה לניסויים לטווח ארוכים. שימוש בתאי מיקרו מערך אלקטרודות הקלטה או הקלטת מהדק תיקון מאפשר שדה רחב ותפקוד תא עצב אחד לנמדד במהלך הקלטות לחקור טוב יותר מנגנוני תנודות γ והשפעת על תפקוד רשת רחב יותר. התאגדות של חיישני מתח וסידן, כמו גם שיטות optogenetic הייתה להציג את הגמישות ניסיונית נוספת בשתי פרדיגמות ההקלטה ומגרה. פרוטוקולים דומים שפותחו עבור אזורים אחרים במוח שעלולה להיות יותר רלוונטי לפתולוגיה המחלה הנחקרת. שימוש סופי לפרוטוקול מתאר כאן עשוי להיות לבנייה ובדיקת מודלים חישוב של תנודות על ידי שילוב של הקלטות שטח עם מחקרי מהדק תיקון נוירון והדמיה יחידים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-(N-Ethyl-N-phenylamino)-1,2- dimethyl-6-(methylamino) pyrimidinium chloride (ZD7288) Sigma-Aldrich Z3777
Biuculline Sigma-Aldrich 14340
6-cyano-7-nitroquinoxa- line-2,3-dione (CNQX) Sigma-Aldrich C127
Nickel Sigma-Aldrich 266965
Carbamazepine Sigma-Aldrich C4024
(2R)-amino-5-phosphonopentano-ate (APV) Tocris Bioscience 0105
Retigabine ChemPacific 150812-12-7
Choline-Cl Sigma-Aldrich C1879-5KG
KCl Sigma-Aldrich P9333-500G
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9638-250G
NaHCO3 Sigma-Aldrich S6297-250G
NaCl Sigma-Aldrich S7653-5KG
Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
CaCl2 • 2H2O Sigma-Aldrich 223506-500G
MgCl2 • 6H2O Sigma-Aldrich M2670-500G
Electrode glass Harvard Apparatus  GC150F-10
Concentric bipolar stimulating metal electrode  FHC CBBPF75
Digital Isolator Getting Instruments Model BJN8-9V1 
Model 1800 amplifier A-M systems Model 1800 amplifier
Digitizer National Intruments NI USB-6211
Vibrotome Leica VT1200s

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buzsaki, G. Theta rhythm of navigation: link between path integration and landmark navigation, episodic and semantic memory. Hippocampus. 15 (7), 827-840 (2005).
  2. Vanderwolf, C. H. Hippocampal electrical activity and voluntary movement in the rat. Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 26 (4), 407-418 (1969).
  3. Bartos, M., Vida, I., Jonas, P. Synaptic mechanisms of synchronized gamma oscillations in inhibitory interneuron networks. Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 45-56 (2007).
  4. Buzsáki, G., Wang, X. -J. Mechanisms of gamma oscillations. Annu. Rev. Neurosci. 35, 203-225 (2012).
  5. Kobayashi, K., et al. Cortical contribution to scalp EEG gamma rhythms associated with epileptic spasms. Brain Dev. 35 (8), 762-770 (2013).
  6. Andreou, C., et al. Increased Resting-State Gamma-Band Connectivity in First-Episode Schizophrenia. Schizophr Bull. , (2014).
  7. Alarcon, G., Binnie, C. D., Elwes, R. D., Polkey, C. E. Power spectrum and intracranial EEG patterns at seizure onset in partial epilepsy. Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 94 (5), 326-337 (1995).
  8. Fisher, R. S., Webber, W. R., Lesser, R. P., Arroyo, S., Uematsu, S. High-frequency EEG activity at the start of seizures. J. Clin. Neurophysiol. 9 (3), 441-448 (1992).
  9. Kwan, P., Brodie, M. J. Early identification of refractory epilepsy. N. Engl. J. Med. 342 (5), 314-319 (2000).
  10. Traub, R. D., Kopell, N., Bibbig, A., Buhl, E. H., LeBeau, F. E., Whittington, M. A. Gap junctions between interneuron dendrites can enhance synchrony of gamma oscillations in distributed networks. J. Neurosci. 21 (23), 9478-9486 (2001).
  11. Traub, R. D., Whittington, M. A., Buhl, E. H., Jefferys, J. G., Faulkner, H. J. On the mechanism of the gamma --> beta frequency shift in neuronal oscillations induced in rat hippocampal slices by tetanic stimulation. J. Neurosci. 19 (3), 1088-1105 (1999).
  12. Whittington, M. A., Stanford, I. M., Colling, S. B., Jefferys, J. G., Traub, R. D. Spatiotemporal patterns of gamma frequency oscillations tetanically induced in the rat hippocampal slice. J. Physiol. 502 (3), 591-607 (1997).
  13. Avoli, M., Panuccio, G., Herrington, R., D’Antuono, M., de Guzman, P., Lévesque, M. Two different interictal spike patterns anticipate ictal activity in vitro. Neurobiol. Dis. 52, 168-176 (2013).
  14. Boido, D., Jesuthasan, N., de Curtis, M., Uva, L. Network Dynamics During the Progression of Seizure-Like Events in the Hippocampal-Parahippocampal Regions. Cereb Cortex. 24 (1), 162-173 (2014).
  15. Gloveli, T., Albrecht, D., Heinemann, U. Properties of low Mg2+ induced epileptiform activity in rat hippocampal and entorhinal cortex slices during adolescence. Brain Res. Dev. Brain Res. 87 (2), 145-152 (1995).
  16. McLeod, F., Ganley, R., Williams, L., Selfridge, J., Bird, A., Cobb, S. R. Reduced seizure threshold and altered network oscillatory properties in a mouse model of Rett syndrome. Neuroscience. 231, 195-205 (2013).
  17. Bracci, E., Vreugdenhil, M., Hack, S. P., Jefferys, J. G. On the synchronizing mechanisms of tetanically induced hippocampal oscillations. J. Neurosci. 19 (18), 8104-8113 (1999).
  18. Main, M. J., Cryan, J. E., Dupere, J. R., Cox, B., Clare, J. J., Burbidge, S. A. Modulation of KCNQ2/3 potassium channels by the novel anticonvulsant retigabine. Mol. Pharmacol. 58 (2), 253-262 (2000).
  19. Wickenden, A. D., Yu, W., Zou, A., Jegla, T., Wagoner, P. K. Retigabine, a novel anti-convulsant, enhances activation of KCNQ2/Q3 potassium channels. Mol. Pharmacol. 58 (3), 591-600 (2000).
  20. Otto, J. F., Kimball, M. M., Wilcox, K. S. Effects of the anticonvulsant retigabine on cultured cortical neurons: changes in electroresponsive properties and synaptic transmission. Mol. Pharmacol. 61 (4), 921-927 (2002).
  21. Pomper, J. K., Graulich, J., Kovacs, R., Hoffmann, U., Gabriel, S., Heinemann, U. High oxygen tension leads to acute cell death in organotypic hippocampal slice cultures. Brain Res. Dev. Brain Res. 126 (1), 109-116 (2001).
  22. Hatch, R. J., Reid, C. A., Petrou, S. Enhanced in vitro CA1 network activity in a sodium channel β1(C121W) subunit model of genetic epilepsy. Epilepsia. 55 (4), 601-608 (2014).
  23. Lord, L. -D., Expert, P., Huckins, J. F., Turkheimer, F. E. Cerebral energy metabolism and the brain/'s functional network architecture: an integrative review. J. Cereb. Blood Flow Metab. 33 (9), 1347-1354 (2013).
  24. Hájos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur. J. Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
  25. Hájos, N., Mody, I. Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content. J. Neurosci. Methods. 183 (2), 107-113 (2009).
  26. Boido, D., Jesuthasan, N., de Curtis, M., Uva, L. Network Dynamics During the Progression of Seizure-Like Events in the Hippocampal-Parahippocampal Regions. Cereb Cortex. 24 (1), 163-173 (2012).
  27. Antuono, M., Köhling, R., Ricalzone, S., Gotman, J., Biagini, G., Avoli, M. Antiepileptic drugs abolish ictal but not interictal epileptiform discharges in vitro. Epilepsia. 51 (3), 423-431 (2010).
  28. Stenkamp, K., et al. Enhanced temporal stability of cholinergic hippocampal gamma oscillations following respiratory alkalosis in vitro. J. Neurophysiol. 85 (5), 2063-2069 (2001).

Tags

Neuroscience גיליון 102 תנודות גמא CA1 ההיפוקמפוס פעילות רשת תרופות אנטי-אפילפטי
דור של תנודות γ CA1 מקומיות על ידי גירוי Tetanic
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hatch, R. J., Reid, C. A., Petrou,… More

Hatch, R. J., Reid, C. A., Petrou, S. Generation of Local CA1 γ Oscillations by Tetanic Stimulation. J. Vis. Exp. (102), e52877, doi:10.3791/52877 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter