Protocol
Ethics statement: Achtste editie van het Instituut voor Laboratory Animal Research (ILAR, 2011) en waren: Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de goede praktijken dier, zoals gedefinieerd in de richtlijnen in de Gids voor het gebruik en onderhoud van proefdieren uitgevoerd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Michigan (PRO0001553).
1. Mouse Surgical Procedures
OPMERKING: Gebruik 8-10 week oud C57BL / 6 muizen. Andere leeftijden, achtergronden en muizenstammen kunnen worden gebruikt om verschillende aandoeningen of genetische make-up testen. Voor de tenotomie deel van de procedure, onderhouden steriele omstandigheden met behulp van een gezichtsmasker, haar motorkap, en steriele toga, handschoenen en instrumenten. Chirurgische sites moeten steriel worden bereid met povidonjood en steriel draperen. Vermijd hypothermie met een veterinair verwarmingselement en opwarming reanimatie tot 37 ° C vóór Toedieningtie.
- Verdoven van de muis met behulp van 2,5% geïnhaleerde isofluraan. Gebruik een neuskegel op het dorsale gedeelte en de achterste ledematen gemakkelijk toegankelijk te verlaten. Pas de snelheid van isofluraan toediening aan de juiste ademhaling en de verkleuring van de slijmvliezen te handhaven en anesthesie te verzekeren door het controleren van de spierspanning, teen knijpen en cornea reflex. Breng saai oogzalf voor de ogen van de muis om droge oogletsel tijdens de procedure te voorkomen. Handhaaf adequate lichaamstemperatuur met behulp van een veterinaire verwarming pad of warm water circulatiepomp onder het chirurgische veld.
- Dien buprenorfine, 0,1 mg / kg, subcutaan onmiddellijk voorafgaand aan chirurgie voor analgesie.
- Nauw scheren de chirurgische site op de linker achterpoot met clippers van de hiel tot de knie.
- Nauw scheren het dorsum van de muis, beginnend op de wervelkolom en het geschoren gebied op links van de dorsale middellijn, clearing een ten minste 2 cm x 3 cm aan de brandwond tegemoet.
- Bereid de operatieplaats, waaronder de achterpoot om de knie met behulp 3 alternerende povidonjood scrubs.
- Voer een longitudinale incisie langs de mediale zijde van de linker achillespees. Verleng de incisie, zodat de achillespees gemakkelijk kan worden gevisualiseerd; ongeveer 0,5 cm.
- Voer een Achilles tenotomie met scherpe dissectie van de pees op het middelpunt met scherpe weefsel schaar. Steek een mes van het weefsel schaar in het weefsel vlak onder de pees en ontleden langs het vlak tot het mes is op de pees middelpunt. Sluit de schaarbladen de pees scherp verbreken.
OPMERKING: Zorg ervoor dat integratie van alle posterieure pezen waaronder Gastrocnemius, Soleus en plantaris pezen. - Bereiken hemostase door het toepassen van druk met een steriel gaasje (er moet minimaal bloeden zijn) en sluit de huid incisie met een 5-0 vicryl steek.
- Voer de dorsale gedeeltelijke dikte brandwonden met een aluminium blok met een gewicht van 35 g met geschatte measurements 2 cm x 2 cm x 3 cm verhit tot 60 ° C in een waterbad aangebracht op het geschoren dorsum van muis voor 17 sec.
OPMERKING: Bereik de juiste brandwond diepte door te rusten blok bovenop de verdoofde muis, zodat het gehele oppervlak van het blok in contact met de muis echter voorkomen dat er enige extra druk aan het blok, dat wil zeggen, laat de zwaartekracht te de enige kracht die het blok op zijn plaats. Een dunne plastic handvat bevestigd aan één kant van het blok is geschikt voor het manipuleren, stabilisatie en het ophalen van warm waterbad. Dit zal leiden tot een ongeveer 30% totale lichaamsoppervlak verbrand in een 8-10 weken oude C57BL / 6 muis. Dit contact brandwond is verkozen boven andere methoden (vlam en brand branden) vanwege de uniformiteit van brandwond diepte over de wond en de reproduceerbaarheid tussen dieren. - Droog de brandwond site met gaas en een Tegaderm dressing toepassen.
- Dien opgewarmd reanimatie vloeistoffen: Ringerlactaat's oplossing 1 mlintraperitoneale injectie en 0,5 ml subcutane injectie. Deze eenmalige toediening van reanimatie is geschikt voor het herstel van de brandwond en tenotomie.
OPMERKING: niet verdoofde muizen individueel terug naar huis kooien met andere muizen, huis in schone kooien onder controle totdat muizen volledig hersteld. Typische herstel optreedt binnen 1-6 uur. Burn-sites meestal genezen binnen 2-4 weken en worden zelden gecompliceerd door wondinfectie indien bewaard in schone woonmilieus. - Dien Buprenorfine 0,1 mg / kg subcutaan elke 12 uur gedurende 3 dagen na de procedure. Monitor HO groei met seriële μCT scans op geschikte tijdstippen. Buitenbaarmoederlijke botgroei is eerst duidelijk ongeveer 3 weken na de operatie door μCT.
OPMERKING: De meeste HO ontwikkeling voltooid door 9 weken na de operatie. We hebben niet een verschil in HO volume of locatie met herhaalde μCT waargenomen scans tweewekelijkse voor 15 weken in vergelijking met een enkel eindpunt μCT scan bij 15 weken.Aan het eind van de experimenten euthanize alle muizen met CO 2 inhalatie volgens de institutionele richtlijnen en controleren dood met cervicale dislocatie na 10 min.
2. μCT Verwerving en Analyse
- Bevestig de verdoofde muis op de scanner bed in buikligging. Tape de achterste ledematen stevig aan het bed om te voorkomen dat de ademhaling beweging artefact. Neem de lucht, water en hydroxyapatiet met fantoom onder de muis voor het kalibreren.
- Open Bone Analysis software en definieert een gebied van belang (ROI) beide achterpoten van het heupgewricht omvat proximaal tot het uiteinde van de achterpoot distaal. Het verkrijgen van een afbeelding met behulp van de volgende parameters:. 80 kV, 500 uA en 1300 msec blootstelling, 48 micrometer voxelgrootte 14,15
- Kalibreer het beeld aan Hounsfield eenheden (HU) uit door een ROI in elk van de drie kamers fantoom en het invoeren van de gemiddelde dichtheid in de juiste velden inde software.
- Met behulp van de "grabber" tool in de software, re-oriënteren het beeld, zodat het scheenbeen van de linker achterpoot is parallel langs de Z-as naar de duidelijkste anatomische weergave voor de afbakening van orthotope corticale botstructuren en HO mogelijk te maken.
- Beginnend bij de knie, bladert distaal door het beeld plakken totdat HO wordt aangetroffen. Met behulp van de handleiding spline tool, maak een ROI rond de buitenbaarmoederlijke bot op elke 5e slice voortzetting distaal door de poot of totdat HO is overtroffen. Gebruik het extrapoleren tool om uit te breiden en steek de ROI samen in een ROI dat alle HO bevat.
- Maak een 3D ROI en kies de analyse menu. Bereken het volume bot door het instellen van de onderste en bovenste drempelwaarden die het beste laten zien het bot venster. Met dezelfde vaste drempelwaarden voor alle scans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze studie wordt het protocol beschreven voor de eerder gepubliceerde muismodel van trauma / branden veroorzaakte HO. 14-17 Dit omvat de oprichting van gelijktijdige gelokaliseerde bewegingsapparaat letsel met een Achilles tenotomie en wereldwijde inflammatoire belediging met een gedeeltelijke dikte brandwonden. Dit leidt tot een betrouwbare vorming van reactieve bot op de tenotomie site die kan worden gevolgd door seriële imaging. Tot op heden zijn alle muizen (meer dan 50) die beide Achilles tenotomie hebben geleden en brandwonden een meetbare hoeveelheid HO ontwikkeld op tenotomie plaats. Om de vorming van ectopisch bot te kwantificeren, wordt een gekalibreerd beeld μCT protocol gebruikt iedere gewenste tijdpunt. De toevoeging van een brandwond in combinatie met Achilles tenotomie gebleken sleutel bij de inductie van significante HO is. Met beide verwondingen gebeurt gelijktijdig er een aanzienlijke toename van de hoeveelheid van ectopisch bot dat is gevormd bij het tenotomie locatie ten opzichte van AcHilles tenotomie alleen (figuur 1). 17
Figuur 1. HO ontwikkeling na Achilles tenotomie met of zonder gelijktijdig brandwonden. Alle muizen ontvingen Achilles tenotomie van de linker achterste lidmaat, de helft van de muizen ontving ook een 30% TBSA oppervlakkige brandwonden op de dorsum. μCT scans zijn voltooid op 5 dagen en 3, 5, 7, 9 en 15 weken na beschadiging. (EEN). Vertegenwoordiger 3D-reconstructies worden getoond met orthotope bot wit en HO blauw gekleurd. Rode cirkels geven niduses van HO. Ectopisch bot ontstaat in het gebied van de tenotomie en bestemmingen distaal en proximaal van de verwonding in de onderste ledematen. Vergelijkbaar met HO clnically gezien, kan deze reactieve bot aaneengesloten met skelet bot of het ontwikkelen van op afstand in zacht weefsel. (B). Kwantificering van HO was comvoltooid met een gekalibreerde beeld protocol en weergegeven in de grafiek. HO is blijven bestaan na 15 weken, maar de ontwikkeling van plateaus tussen 9-15 weken met de grootste groeisnelheid meestal gezien tussen de 5-9 weken. Gegevens zijn gemiddelden +/- SD, n = 4 per groep, Student's t-test, * p <0,05 (Let op: dit is eerder gepubliceerde gegevens, gewijzigd van 17). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | 664 | 8-10 weeks old |
| Isoflurane – Fluriso | VET one, Boise, ID | V1 501017 | |
| Buprenorphine – Buprenex | Reckitt Benckiser Healthcare | NDC 12496-0757-1 | 0.3 mg/ml solution |
| Betadine | Owens and Minor, Mechanicsville, VA | 2047PVP202 | |
| 5-0 Vicryl sutures | Ethicon, Summerville, NJ | J493 | |
| Tegaderm Film, 6 cm x 7 cm | 3M | 1624W | Cut in half to properly cover burn site |
| µCT - GE eXplore Locus SP | GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada | ||
| Microview 2.2 Advanced Bone Analysis Application | GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada |
References
- Leblanc, E., et al. BMP-9-induced muscle heterotopic ossification requires changes to the skeletal muscle microenvironment. J Bone Miner Res. 26 (6), 1166-1177 (2011).
- Shore, E. M. Osteoinductive signals and heterotopic ossification. J Bone Miner Res. 26 (6), 1163-1165 (2011).
- Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. J Bone Miner Res. 27 (5), 1004-1017 (2012).
- Potter, B. K., et al. Heterotopic ossification following combat-related trauma. J Bone Joint Surg Am. 92, Suppl 2. 74-89 (2010).
- Van den Bossche, L., Vanderstraeten, G. Heterotopic ossification: a review. J Rehabil Med. 37 (3), 129-136 (2005).
- Chakkalakal, S. A., et al. An Acvr1 R206H knock-in mouse has fibrodysplasia ossificans progressiva. J Bone Miner Res. 27 (8), 1746-1756 (2012).
- Yu, P. B., et al. BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic [corrected] ossification. Nat Med. 14 (12), 1363-1369 (2008).
- Culbert, A. L., et al. Alk2 regulates early chondrogenic fate in fibrodysplasia ossificans progressiva heterotopic endochondral ossification. Stem Cells. 32 (5), 1289-1300 (2014).
- Dinther, M., et al. ALK2 R206H mutation linked to fibrodysplasia ossificans progressiva confers constitutive activity to the BMP type I receptor and sensitizes mesenchymal cells to BMP-induced osteoblast differentiation and bone formation. J Bone Miner Res. 25 (6), 1208-1215 (1359).
- Peterson, J. R., et al. Burn injury enhances bone formation in heterotopic ossification model. Ann Surg. 259 (5), 993-998 (2014).
- Scott, M. A., et al. Brief review of models of ectopic bone formation. Stem Cells Dev. 21 (5), 655-667 (2012).
- Tannous, O., Griffith, C., O'Toole, R. V., Pellegrini, V. D. Heterotopic ossification after extremity blast amputation in a Sprague-Dawley rat animal model. J Orthop Trauma. 25 (8), 506-510 (2011).
- Tannous, O., et al. Heterotopic bone formation about the hip undergoes endochondral ossification: a rabbit model. Clin Orthop Relat Res. 471 (5), 1584-1592 (2013).
- Peterson, J. R., et al. Treatment of heterotopic ossification through remote ATP hydrolysis. Sci Transl Med. 6 (255), 255ra132 (2014).
- Peterson, J. R., et al. Early detection of burn induced heterotopic ossification using transcutaneous Raman spectroscopy. Bone. 54 (1), 28-34 (2013).
- Perosky, J. E., et al. Early detection of heterotopic ossification using near-infrared optical imaging reveals dynamic turnover and progression of mineralization following Achilles tenotomy and burn injury. J Orthop Res. 32 (11), 1416-1423 (2014).
- Peterson, J. R., et al. Effects of Aging on Osteogenic Response and Heterotopic Ossification Following Burn Injury in Mice. Stem Cells Dev. , (2014).
- Alfieri, K. A., Forsberg, J. A., Potter, B. K. Blast injuries and heterotopic ossification. Bone and Joint Research. 1 (8), 174-179 (2012).
- Hunt, J. L., Arnoldo, B. D., Kowalske, K., Helm, P., Purdue, G. F. Heterotopic ossification revisited: a 21-year surgical experience. J Burn Care Res. 27 (4), 535-540 (2006).
- Ring, D., Jupiter, J. B. Operative release of ankylosis of the elbow due to heterotopic ossification. Surgical technique. J Bone Joint Surg Am. 86-A, Suppl 1. 2-10 (2004).
- Crane, N. J., Polfer, E., Elster, E. A., Potter, B. K., Forsberg, J. A. Raman spectroscopic analysis of combat-related heterotopic ossification. Bone. 57 (2), 335-342 (2013).
