Protocol
Déclaration éthique: Toutes les procédures d'animaux ont été effectuées en stricte conformité avec les bonnes pratiques de l'animal tel que défini dans les directives fournies dans le Guide pour l'utilisation et l'entretien des animaux de laboratoire: huitième édition de l'Institute for Laboratory Animal Research (ILAR, 2011) et ont été approuvé par le soin et l'utilisation Commission institutionnelle animale de l'Université du Michigan (PRO0001553).
1. Souris Interventions chirurgicales
REMARQUE: Utilisez 8-10 semaine vieille souris C57BL / 6. Autres âges, des origines et souches de souris peuvent également être utilisés pour tester des conditions différentes ou génétique. Pour la partie de ténotomie de la procédure, de maintenir des conditions stériles en utilisant un masque, bonnet de cheveux, et blouse stérile, des gants et des instruments. Sites chirurgicaux doivent être préparés avec stérilement povidone-iode et drapage stérile. Éviter l'hypothermie en utilisant un coussin chauffant vétérinaire et le réchauffement des solutions de réanimation à 37 ° C avant d'administration.
- Anesthésier la souris en utilisant 2,5% d'isoflurane inhalé. Utilisez un cône de nez de quitter le dos et membres postérieurs facilement accessible. Réglez la vitesse d'administration de l'isoflurane pour maintenir le taux respiratoire appropriée et la coloration des muqueuses et de veiller à l'anesthésie en vérifiant le tonus musculaire, pincement de l'orteil, et réflexe cornéen. Appliquer une pommade ophtalmique fade aux yeux de la souris pour éviter les blessures de l'oeil sec lors de la procédure. Maintenir la température corporelle adéquate en utilisant un coussin chauffant vétérinaire ou circulateur d'eau chaude sous le champ chirurgical.
- Administrer la buprénorphine, 0,1 mg / kg, voie sous-cutanée immédiatement avant l'intervention chirurgicale pour l'analgésie.
- Raser de près le site chirurgical sur la patte arrière gauche l'aide de tondeuses du talon au genou.
- Étroitement raser le dos de la souris, en commençant sur la colonne vertébrale et l'extension de la zone rasée à la gauche de la ligne médiane dorsale, nettoyer une zone d'au moins 2 cm x 3 cm pour accueillir la brûlure.
- Préparer le site chirurgical, y compris la patte postérieure du genou en utilisant 3 alternance gommages povidone-iode.
- Effectuer une incision longitudinale le long de la face médiale du tendon d'Achille gauche. Elargir l'incision de sorte que le tendon d'Achille peut être visualisé facilement; environ 0,5 cm.
- Effectuer une ténotomie d'Achille avec dissection du tendon au milieu avec des ciseaux pointus de tissus. Insérer une lame de ciseaux de tissu dans le plan du tissu au-dessous du tendon et disséquer le long du plan jusqu'à ce que la lame est au point médian du tendon. Fermez les lames de ciseaux pour sectionner le tendon fortement.
REMARQUE: Veiller à l'inclusion de tous les tendons postérieurs y compris Gastrocnemius, soléaire et tendons plantaire. - Hémostase en appliquant une pression avec de la gaze stérile (il devrait y avoir un saignement minime) et fermer l'incision de la peau avec un point 5-0 de vicryl.
- Effectuez la dorsale partielle brûlure d'épaisseur avec un bloc d'aluminium pesant 35 g avec approximatives DE MESUREts 2 cm x 2 cm x 3 cm chauffé à 60 ° C dans un bain d'eau appliquée sur la face dorsale rasée de la souris pendant 17 sec.
Remarque: obtenir la profondeur de gravure approprié en plaçant le bloc au-dessus de la souris anesthésiée, veiller à ce que toute la zone de surface du bloc est au contact de la souris, cependant éviter d'appliquer une pression supplémentaire sur le bloc, à savoir, permettre à la gravité pour être la seule force de maintien le bloc en place. Une poignée en matière plastique mince fixée à un côté du bloc est commode pour la manipulation, la stabilisation et la récupération à partir du bain d'eau chaude. Cela va créer un organisme surface totale d'environ 30% à brûler dans une ancienne 8-10 semaine souris C57BL / 6. Cette brûlure de contact a été choisi sur les autres méthodes (flamme ou brûlure brûlures) en raison de l'uniformité de la profondeur de la brûlure sur la plaie et la reproductibilité entre les animaux. - Sécher le site de la brûlure avec de la gaze et appliquer un pansement Tegaderm.
- Administrer des fluides de réanimation réchauffés: solution 1 ml de Ringer lactateinjection intraperitoneale et injection sous-cutanée de 0,5 ml. Cette administration unique de la réanimation est adéquate pour la récupération de la blessure de brûlure et ténotomie.
REMARQUE: Ne pas revenir souris anesthésiées dans des cages de logement avec d'autres souris, maison individuellement dans des cages propres sous surveillance jusqu'à ce que les souris sont complètement rétablis. Récupération type se produit dans 1-6 hr. les sites de gravure guérissent généralement dans les 2-4 semaines et sont rarement compliqués par infection de la plaie si elles sont conservées dans des environnements de logement propres. - Administrer buprénorphine 0,1 mg / kg injection sous-cutanée toutes les 12 heures pendant 3 jours suivants la procédure. Surveillez la croissance HO avec des scans de μCT série à des intervalles appropriés. La croissance osseuse ectopique est la première évident environ 3 semaines post-op par μCT.
NOTE: La majorité du développement HO est terminée par neuf semaines post-op. Nous avons pas observé de différence de volume HO ou l'emplacement avec répétée μCT scans bi-hebdomadaire pendant 15 semaines comparativement à un seul point final μCT numériser à 15 semaines.A la fin des expériences, toutes les souris euthanasie avec CO 2 inhalation selon les directives institutionnelles et vérifier mort à la dislocation cervicale après 10 min.
2. μCT acquisition et d'analyse
- Fixez la souris anesthésiés sur la vitre du scanner dans la position couchée. Collez les membres postérieurs en toute sécurité vers le lit pour éviter de respirer un artefact de mouvement. Inclure l'air, l'eau, et d'hydroxyapatite contenant fantôme sous la souris pour l'étalonnage de l'image.
- Ouvrez le logiciel d'analyse d'os et de définir une région d'intérêt (ROI) qui englobe les deux membres postérieurs de l'articulation de la hanche proximale à l'extrémité de la patte arrière distale. Obtenir une image en utilisant les paramètres suivants:. 80 kV, 500 pA et 1300 msec exposition, 48 um taille de voxel 14,15
- Calibrer l'image pour unités Hounsfield (HU) en dessinant un retour sur investissement dans chacune des trois chambres de fantômes et de la saisie de la densité moyenne dans les champs appropriés dansle logiciel.
- Utilisation de la "grabber" outil dans le logiciel, réorienter l'image de sorte que le tibia de la patte arrière gauche est parallèle le long de l'axe Z pour permettre à la vue anatomique la plus claire pour la délimitation des structures osseuses corticales orthotopiques et HO.
- Commençant au niveau du genou, faites défiler distale à travers les tranches d'image jusqu'à HO est rencontré. Utilisation de l'outil manuel de spline, faire un retour sur investissement autour de l'os ectopique sur chaque 5 ème tranche continue distale à travers la patte ou jusqu'à ce que HO a été dépassé. Utilisez l'outil de extrapoler à étendre et à assembler les ROI ensemble dans un ROI qui contient toutes les HO.
- Faire un ROI 3D et choisissez le menu d'analyse. Calculer le volume osseux par le réglage des valeurs seuils inférieure et supérieure qui montrent le mieux la fenêtre osseuse. Utilisez les mêmes valeurs seuils fixés pour toutes les analyses.
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Representative Results
Dans la présente étude, le protocole est décrit par le modèle de souris précédemment publié des traumatismes / brûler induite HO. 14-17 Cela implique la création d'une blessure musculo-squelettique localisée concurrente avec une ténotomie Achille et agression inflammatoire mondial avec une épaisseur partielle brûlures. Il en résulte la formation fiable de l'os au niveau du site réactif de ténotomie qui peut être suivie à l'imagerie en série. À ce jour, toutes les souris (plus de 50) qui ont soutenu à la fois d'Achille ténotomie et de brûlures ont développé une quantité mesurable de HO sur le site de la ténotomie. Pour quantifier la formation d'os ectopique, un protocole image μCT calibré est utilisé à chaque point de temps désiré. L'addition d'une brûlure en combinaison avec la ténotomie Achille est avérée clé dans l'induction de HO significatif. Avec les deux lésions qui se passe simultanément il existe une augmentation significative de la quantité d'os ectopique qui se forme sur le site par rapport à Ac ténotomieHilles ténotomie seul (Figure 1). 17
Figure 1. Développement HO suivante Achille ténotomie avec ou sans brûlure concurrente. Toutes les souris ont reçu une ténotomie d'Achille de la patte arrière gauche, la moitié des souris ont également reçu un TBSA épaisseur partielle de 30% de brûlures sur le dos. scans μCT ont été achevés à 5 jours et 3, 5, 7, 9, et 15 semaines après la lésion. (UN). Reconstructions 3D représentatifs sont présentés avec du blanc os orthotopique et HO couleur bleue. Les cercles rouges indiquent niduses de HO. Os ectopique se développe dans le domaine de la ténotomie ainsi que des emplacements distale et proximale à l'endroit de la blessure dans le membre inférieur. Similaire à HO vu clnically, cet os réactif peut être contigu à l'os du squelette ou développer à distance dans les tissus mous. (B). Quantification des HO était comterminé avec un protocole de l'image calibrée et représenté sur le graphique. HO a persisté au-delà de 15 semaines, cependant plateaux de développement entre 9-15 semaines avec la vitesse de croissance le plus généralement observée entre 5-9 semaines. Les données sont des moyens +/- SD, n = 4 par groupe, t -test de l'étudiant, * P <0,05 (S'il vous plaît noter que ceci est issu des données, modifiés à partir de 17). S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | 664 | 8-10 weeks old |
| Isoflurane – Fluriso | VET one, Boise, ID | V1 501017 | |
| Buprenorphine – Buprenex | Reckitt Benckiser Healthcare | NDC 12496-0757-1 | 0.3 mg/ml solution |
| Betadine | Owens and Minor, Mechanicsville, VA | 2047PVP202 | |
| 5-0 Vicryl sutures | Ethicon, Summerville, NJ | J493 | |
| Tegaderm Film, 6 cm x 7 cm | 3M | 1624W | Cut in half to properly cover burn site |
| µCT - GE eXplore Locus SP | GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada | ||
| Microview 2.2 Advanced Bone Analysis Application | GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada |
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