Protocol
Declaração de ética: Todos os procedimentos com animais foram realizados em estrita conformidade com as boas práticas de animais, tal como definido nas orientações fornecidas no Guia para uso e cuidado de Animais de Laboratório: Oitava Edição do Instituto de Laboratório de Pesquisa Animal (ILAR de 2011) e foram aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animal Institucional da Universidade de Michigan (PRO0001553).
1. mouse Procedimentos Cirúrgicos
NOTA: Use 8-10 semanas de idade C57BL / 6 ratos. Outras idades, origens e linhagens de camundongos também pode ser usado para testar diferentes condições ou composição genética. Para a parte tenotomia do procedimento, manter condições estéreis, utilizando máscara facial, bonnet cabelo, e avental estéril, luvas e instrumentos. Locais cirúrgicos devem ser esterilizada preparada com iodopovidona e drapeados estéril. Evitar a hipotermia usando uma almofada de aquecimento e veterinária para o aquecimento de soluções de ressuscitação 37 ° C antes da adminis-ção.
- Anestesiar o rato usando 2,5% de isoflurano inalado. Use um cone do nariz para deixar o dorso e traseiras-membros de fácil acesso. Ajustar a taxa de administração de isoflurano para manter a taxa respiratória apropriada e coloração das mucosas e para garantir anestesia, verificando o tônus muscular, toe pitada, e reflexo da córnea. Aplicar pomada oftálmica sem graça para os olhos do rato para evitar lesões do olho seco durante o procedimento. Manter a temperatura corporal adequada usando uma almofada de aquecimento veterinária ou circulador de água quente sob o campo cirúrgico.
- Administrar buprenorfina, 0,1 mg / kg, por via subcutânea imediatamente antes da cirurgia para analgesia.
- Intimamente raspar o local da cirurgia na pata traseira esquerda usando cortadores desde o calcanhar até o joelho.
- Estreitamente raspar o dorso do rato, começando ao longo da coluna vertebral e que se estende a área rapada à esquerda da linha média dorsal, limpar uma área de pelo menos 2 cm x 3 cm para acomodar o ferimento de queimadura.
- Prepara-se o local de cirurgia, incluindo a pata traseira ao joelho utilizando 3 alternadas esfrega povidona-iodo.
- Realize uma incisão longitudinal ao longo do aspecto medial do tendão de Aquiles esquerdo. Estender a incisão para que o tendão de Aquiles pode ser facilmente visualizado; aproximadamente 0,5 cm.
- Executar uma tenotomia de Aquiles com dissecção aguda de tendão no ponto médio com uma tesoura de tecido afiadas. Inserir uma lâmina da tesoura de tecido no plano do tecido abaixo do tendão e dissecar ao longo do plano até que a lâmina está no ponto central do tendão. Feche as lâminas da tesoura para cortar o tendão acentuadamente.
NOTA: Certifique-se de inclusão de todos os tendões posteriores incluindo gastrocnêmio, sóleo, e tendões plantar. - Hemostasia, aplicando pressão com gaze estéril (deve haver sangramento mínimo) e fechar a incisão na pele com um ponto vicryl 5-0.
- Realize o dorsal queimadura de espessura parcial com um bloco de alumínio com peso de 35 g com measuremen aproximadosTS 2 cm por 2 cm x 3 cm aquecida a 60 ° C num banho de água aplicada ao dorso rapada do ratinho durante 17 seg.
NOTA: Atingir a profundidade de gravação apropriado colocando o bloco no topo do rato anestesiado, assegurando que toda a superfície do bloco está em contacto com o rato, no entanto, evitar a aplicação de qualquer pressão adicional para o bloco, ou seja, permitir que a gravidade seja a única força que prende o bloco no lugar. Um cabo de plástico fino ligado a um lado do bloco é conveniente para a manipulação, de estabilização, e recuperação a partir do banho de água quente. Isto irá criar uma área de superfície total do corpo queimar cerca de 30% em um 8-10 semanas de idade C57BL / 6 mouse. Este queimadura contato foi escolhido em detrimento de outros métodos (chama ou escaldão queimaduras), devido à uniformidade da profundidade da queimadura sobre a ferida e a reprodutibilidade entre os animais. - Seque o site queimadura com uma gaze e aplicar um curativo Tegaderm.
- Administrar fluidos de ressuscitação aquecidos: solução de Ringer com lactato de 1 mlinjecção intraperitoneal e subcutânea de 0,5 ml. Esta administração única de reanimação é adequada para a recuperação da lesão por queimadura e tenotomia.
NOTA: Não retornar ratos anestesiados para jaulas de habitação com outros ratos, casa individualmente em gaiolas limpas sob monitoramento até que os ratos são totalmente recuperado. A recuperação típica ocorre no prazo de 1-6 horas. Locais queimados geralmente curar dentro de 2-4 semanas e raramente são complicados por infecção da ferida se mantido em ambientes de habitação limpas. - Administrar Buprenorfina 0,1 mg / kg injecção subcutânea a cada 12 horas durante 3 dias após o procedimento. Monitorar o crescimento HO com varreduras μCT de série em intervalos apropriados. Crescimento ósseo ectópica é evidente pela primeira vez em torno de 3 semanas pós-operatório por μCT.
NOTA: A maioria do desenvolvimento HO é completa por nove semanas de pós-operatório. Nós não observamos uma diferença de HO volume ou local com repetidas varreduras μCT bi-semanal, durante 15 semanas, em comparação a um único ponto-final μCT digitalizar em 15 semanas.No final das experiências, todos os ratinhos a eutanásia com CO2 inalação de acordo com as orientações institucionais e verificar a morte com deslocamento cervical depois de 10 min.
2. μCT Aquisição e Análise
- Prenda o rato anestesiado na mesa do scanner na posição prona. Tape os membros posteriores segurança para a cama para evitar respirar movimento artefato. Inclua o ar, a água, e hidroxiapatita contendo fantasma sob o mouse para calibração de imagem.
- Abra o software de análise de osso e definir uma região de interesse (ROI) que engloba ambos os membros posteriores da articulação da anca proximal à ponta da pata traseira distalmente. Obter uma imagem usando os seguintes parâmetros:. 80 kV, 500 mA e 1.300 ms de exposição, 48 mm tamanho voxel 14,15
- Calibre a imagem para unidades Hounsfield (HU) pelo desenho de um ROI em cada uma das três câmaras fantasmas e introduzir a densidade média nos campos apropriados emo software.
- Usando a ferramenta "apanhando" no software, re-orientar a imagem de modo a tíbia do membro posterior esquerdo é paralelo ao longo do eixo Z para permitir a mais clara vista anatômico para a delimitação das estruturas ósseas corticais ortotópicos e HO.
- Começando na altura do joelho, desloque distalmente através das fatias de imagem até HO é encontrado. Usando a ferramenta de spline o manual, faça um ROI em torno do osso ectópico em cada 5 th fatia continua distalmente através da pata ou até HO foi ultrapassado. Use a ferramenta extrapolar para ampliar e costurar as ROIs juntos em um ROI que contém todas as HO.
- Faça um ROI 3D e escolha o menu de análise. Calcule o volume ósseo, definindo os valores de limite inferior e superior que melhor mostram a janela do osso. Use os mesmos valores-limite fixados para todas as digitalizações.
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Representative Results
No presente estudo, o protocolo é descrito para o modelo de rato previamente publicado de trauma / queimadura induzida HO 14-17. Isto envolve a criação de concomitante lesão musculoesquelética localizada com uma tenotomia Aquiles e insulto inflamatório global, com uma espessura parcial queimaduras. Isto resulta na formação fiável do osso no local reactivo Tenotomia que pode ser seguido com imagens em série. Até à data, todos os ratinhos (mais de 50) que sofreram ambos Aquiles Tenotomia e lesão por queimadura desenvolveram uma quantidade mensurável de HO no local Tenotomia. Para quantificar a formação de osso ectópico, um protocolo de imagem μCT calibrado é usado em cada ponto de tempo desejado. A adição de um ferimento de queimadura em combinação com o Tenotomia Aquiles provou ser a chave para a indução de HO significativa. Com ambas as lesões que ocorrem simultaneamente, há um aumento significativo na quantidade de osso ectópico que é formado no local Tenotomia comparação com AcHilles Tenotomia sozinho (Figura 1). 17
Figura 1. desenvolvimento HO seguinte Aquiles tenotomia com ou sem ferimento de queimadura concorrente. Todos os ratinhos receberam uma tenotomia de Aquiles do membro posterior esquerdo, metade dos ratos também receberam uma TBSA espessura parcial de 30% queimar lesão no dorso. scans μCT foram concluídas em 5 dias e 3, 5, 7, 9, e 15 semanas após a lesão. (UMA). Reconstruções 3D representativos são mostrados com osso orthotopic branco e HO cor azul. Os círculos vermelhos indicam niduses de HO. Óssea ectópica desenvolve na área da Tenotomia, bem como locais distais e proximais para o local da lesão no membro inferior. Semelhante a HO visto clnically, este óssea reativa pode ser contígua com osso esquelético ou desenvolver remotamente em tecidos moles. (B). Quantificação de HO foi COMpletou com um protocolo de imagem calibrada e mostrado no gráfico. HO persiste para além das 15 semanas, no entanto planaltos de desenvolvimento entre 9-15 semanas, com a maior velocidade de crescimento tipicamente vistos entre 5-9 semanas. Os dados são médias +/- SD, n = 4 por grupo, teste t de Student, * P <0,05 (Por favor note que este é, dados modificados de 17 publicado anteriormente). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | 664 | 8-10 weeks old |
| Isoflurane – Fluriso | VET one, Boise, ID | V1 501017 | |
| Buprenorphine – Buprenex | Reckitt Benckiser Healthcare | NDC 12496-0757-1 | 0.3 mg/ml solution |
| Betadine | Owens and Minor, Mechanicsville, VA | 2047PVP202 | |
| 5-0 Vicryl sutures | Ethicon, Summerville, NJ | J493 | |
| Tegaderm Film, 6 cm x 7 cm | 3M | 1624W | Cut in half to properly cover burn site |
| µCT - GE eXplore Locus SP | GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada | ||
| Microview 2.2 Advanced Bone Analysis Application | GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada |
References
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