Protocol
Заявление по этике: Все процедуры на животных были проведены в строгом соответствии с надлежащей практикой животных, как определено в руководящих принципах, предусмотренных в Руководстве по использованию и уходу за лабораторными животными: восьмой редакции от Института лабораторных животных исследований (ILAR, 2011 г.) и были утвержден уходу и использованию комитета Институциональная животных университета штата Мичиган (PRO0001553) по.
1. Хирургические процедуры мыши
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 8-10 неделя C57BL / 6 мышей. Другие возраст, фоны, и штаммы мышей также может быть использован для тестирования различных условий или генетический состав. Для тенотомии части процедуры, поддерживать стерильные условия, используя маску, волосы капота и стерильные халат, перчатки и инструменты. Хирургические сайты должны быть стерильно подготовлен с повидон-йодом и стерильной драпировки. Избегайте переохлаждения с помощью ветеринарного грелку и нагревания реанимации решения до 37 ° С до администрания.
- Обезболить мыши, используя 2,5% вдыхаемого изофлурана. Используйте носовой конус, чтобы оставить тыльную и задние конечности-легко доступны. Отрегулируйте скорость введения ИФ поддерживать соответствующую скорость дыхания и окраску слизистых оболочек и обеспечить анестезию путем проверки мышечный тонус, ног щепотку, и роговицы рефлекс. Применить мягкий глазной мази для глаз мыши, чтобы предотвратить сухость глаз травмы во время процедуры. Поддержание адекватной температуры тела с помощью ветеринарного грелку или теплую воду циркуляционного под операционного поля.
- Администрирование бупренорфин, 0,1 мг / кг, подкожно непосредственно перед операцией для обезболивания.
- Внимательно брить хирургического сайта на левой задней лапы, используя ножницы от пятки до колена.
- Внимательно брить спинку мыши, начиная над позвоночника и расширение бритая область слева от средней линии спины, очищая площадь по крайней мере, 2 см х 3 см, чтобы приспособить ожогов.
- Подготовка операционного поля, в том числе задней лапы до колена с использованием 3 чередующихся повидон-йод скрабы.
- Выполните продольный разрез вдоль медиальной части левой ахиллова сухожилия. Расширьте разрез, так ахиллово сухожилие может быть легко визуализировать; примерно 0,5 см.
- Выполните тенотомию ахиллова острым рассечение сухожилия в середине с острыми ножницами ткани. Вставьте одно лезвие ножниц ткани в ткани плоскости под сухожилия и анализировать вдоль плоскости, пока лезвие не находится в середине сухожилия. Закрыть лезвия ножниц, чтобы разъединить сухожилия резко.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, включение всех задних сухожилий в том числе икроножных, камбаловидной и подошвенный сухожилий. - Достижения гемостаза путем применения давления стерильной марли (не должно быть минимальное кровотечение) и закрыть разрез кожи с 5-0 викрил стежка.
- Выполните спинной частичное ожог толщина с алюминиевым блоком весом 35 г с приближенными проводились измеренияTS 2 см х 2 см х 3 см нагревают до 60 ° С на водяной бане, приложенного к бритой спины мыши в течение 17 сек.
Примечание: достижения соответствующего глубину ожога должен поместить блок в верхней части наркозом мыши, гарантируя, что вся площадь поверхности блока находится в контакте с мышью, однако избегать применения какого-либо дополнительного давления к блоку, то есть, позволяют тяжести будет только сила, удерживающая блок на месте. Тонкая пластиковая ручка прикреплена к одной стороне блока удобен для манипулирования, стабилизации и извлечения из горячей водяной бане. Это создаст поверхность всего тела примерно 30% гореть в 8-10-недельных C57BL / 6 мыши. Этот контакт ожог был выбран по сравнению с другими методами (пламя или ошпаривают Burn) из-за однородности глубины выгорания на рану и воспроизводимости между животными. - Высушите ожога сайт марлей и применять Tegaderm повязку.
- Администрирование согретые реанимации жидкости: раствор 1 мл лактата Рингеравнутрибрюшинной инъекции 0,5 мл подкожно. Это один раз администрация реанимации является достаточным для восстановления от ожогов и тенотомии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не вернуться наркотизированных мышей жилищных клетках с другими мышами, дом индивидуально в клетках чистых под контролем до тех пор, мышей не полностью выздоровел. Типичный восстановление происходит в течение 1-6 часов. Прожига сайты, как правило заживают в течение 2-4 недель, и редко осложняется раневой инфекции, если хранится в чистых жилищных условий. - Администрирование бупренорфина 0,1 мг / кг подкожной инъекции каждые 12 ч в течение 3 дней после процедуры. Монитор рост HO с серийными μCT сканирования в определенные промежутки времени. Внематочная рост костей является первым очевидным около 3 недель после операции по μCT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство развития HO завершения на 9 недель послеоперационных. Мы не наблюдали различие в объеме HO или местоположения с повторным μCT сканирует два раза в неделю в течение 15 недель по сравнению с одной конечной точки μCT сканирования в 15 недель.В конце экспериментов, усыпить все мышей СО 2 ингаляции в соответствии с ведомственным руководящим принципам и проверить смерть с шейных позвонков после 10 мин.
2. μCT сбора и анализа
- Закрепите наркозом мыши на планшете сканера в положении лежа. Лента задние конечности надежно к кровати, чтобы предотвратить дыхание артефакт движения. Включите воздух, воду и гидроксиапатит, содержащий фантом под мышкой для калибровки изображения.
- Откройте программное обеспечение анализа костей и определить области интереса (ROI), который охватывает обе задние конечности от тазобедренного сустава проксимальнее кончика задней лапы дистально. Получить изображение, используя следующие параметры:. 80 кВ, 500 мкА и 1300 мс экспозиции, размер воксела 48 мкм 14,15
- Калибровка изображения на Хаунсфилда единиц (HU), опираясь на ROI в каждой из трех камер, и фантомных ввода среднюю плотность в соответствующие поля впрограммного обеспечения.
- Использование "граббер" инструмент в программном обеспечении, переориентировать изображение так, голени левой задней конечности параллельно вдоль оси Z, чтобы позволить ясное представление анатомические для разграничения ортотопических корковых костных структур и HO.
- Начиная с колена, выделите дистально через ломтиками изображения до HO не встречается. Использование ручного инструмента сплайна, сделать ROI вокруг внематочной кости на каждом 5-м срезе продолжающейся в дистальном направлении лапы или до HO был превзойден. Используйте инструмент экстраполировать расширить и сшейте трансформирования в одну ROI, который содержит все HO.
- Сделайте 3D ROI и выберите в меню анализа. Рассчитать объем костной ткани, установив нижний и верхний порог значения, которые лучше всего открыть окно кости. Используйте те же фиксированные пороговые значения для всех сканов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом настоящем исследовании, протокол описан ранее опубликованной модели мыши травмы / ожог индуцированной HO. 14-17 Это предполагает создание одновременно локализованной травмы опорно-двигательного аппарата с тенотомии ахиллова и глобальной воспалительного оскорбление с частичным толщиной ожог. Это приводит к образованию надежного реактивной кости в месте тенотомии, которые могут быть далее с последовательным изображений. На сегодняшний день, все мыши (более 50), которые понесли как Ахиллес тенотомию и ожогов разработали измеримое количество HO в тенотомии сайта. Для количественной оценки формирование эктопической кости, калиброванный протокол изображения μCT используется в каждой желаемой временной точке. Добавление ожоговой травмы в сочетании с тенотомии ахиллова оказалась ключевой в индукции значительного HO. В обоих травмы происходит одновременно есть значительное увеличение количества внематочной кости, которая формируется на тенотомии сайта по сравнению с Acодна Hilles тенотомия (Рисунок 1). 17
Рисунок 1. Развитие HO следующие ахиллова тенотомию с или без одновременного ожога. Все мыши получали ахиллова тенотомию левой задней конечности, половина мышей также получил 30% TBSA частичное толщина ожогов на тыльной. μCT сканирует были завершены в 5 дней и 3, 5, 7, 9 и 15 недель после травмы. (А). Представительства 3D реконструкции показаны ортотопическая кости белый и HO синего цвета. Красные круги указывают очагов HO. Внематочная кости развивается в области тенотомии а также местах дистальным и проксимальным к участку повреждения в нижней конечности. Подобно HO видел clnically, это реактивная кость может быть смежными с костей скелета или разработать дистанционно в мягких тканях. (Б). Количественное Хо комзавершена с протоколом калиброванного изображения и показаны на графике. НО сохраняется за 15 недель, однако плато развития между 9-15 недель с наибольшей скоростью роста, как правило, видели между 5-9 недель. Данные средства +/- SD, п = 4 в группе, Студенческая т -test * Р <0,05 (Пожалуйста, обратите внимание, что это ранее опубликованы данные, модифицированные с 17). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | 664 | 8-10 weeks old |
| Isoflurane – Fluriso | VET one, Boise, ID | V1 501017 | |
| Buprenorphine – Buprenex | Reckitt Benckiser Healthcare | NDC 12496-0757-1 | 0.3 mg/ml solution |
| Betadine | Owens and Minor, Mechanicsville, VA | 2047PVP202 | |
| 5-0 Vicryl sutures | Ethicon, Summerville, NJ | J493 | |
| Tegaderm Film, 6 cm x 7 cm | 3M | 1624W | Cut in half to properly cover burn site |
| µCT - GE eXplore Locus SP | GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada | ||
| Microview 2.2 Advanced Bone Analysis Application | GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada |
References
- Leblanc, E., et al. BMP-9-induced muscle heterotopic ossification requires changes to the skeletal muscle microenvironment. J Bone Miner Res. 26 (6), 1166-1177 (2011).
- Shore, E. M. Osteoinductive signals and heterotopic ossification. J Bone Miner Res. 26 (6), 1163-1165 (2011).
- Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. J Bone Miner Res. 27 (5), 1004-1017 (2012).
- Potter, B. K., et al. Heterotopic ossification following combat-related trauma. J Bone Joint Surg Am. 92, Suppl 2. 74-89 (2010).
- Van den Bossche, L., Vanderstraeten, G. Heterotopic ossification: a review. J Rehabil Med. 37 (3), 129-136 (2005).
- Chakkalakal, S. A., et al. An Acvr1 R206H knock-in mouse has fibrodysplasia ossificans progressiva. J Bone Miner Res. 27 (8), 1746-1756 (2012).
- Yu, P. B., et al. BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic [corrected] ossification. Nat Med. 14 (12), 1363-1369 (2008).
- Culbert, A. L., et al. Alk2 regulates early chondrogenic fate in fibrodysplasia ossificans progressiva heterotopic endochondral ossification. Stem Cells. 32 (5), 1289-1300 (2014).
- Dinther, M., et al. ALK2 R206H mutation linked to fibrodysplasia ossificans progressiva confers constitutive activity to the BMP type I receptor and sensitizes mesenchymal cells to BMP-induced osteoblast differentiation and bone formation. J Bone Miner Res. 25 (6), 1208-1215 (1359).
- Peterson, J. R., et al. Burn injury enhances bone formation in heterotopic ossification model. Ann Surg. 259 (5), 993-998 (2014).
- Scott, M. A., et al. Brief review of models of ectopic bone formation. Stem Cells Dev. 21 (5), 655-667 (2012).
- Tannous, O., Griffith, C., O'Toole, R. V., Pellegrini, V. D. Heterotopic ossification after extremity blast amputation in a Sprague-Dawley rat animal model. J Orthop Trauma. 25 (8), 506-510 (2011).
- Tannous, O., et al. Heterotopic bone formation about the hip undergoes endochondral ossification: a rabbit model. Clin Orthop Relat Res. 471 (5), 1584-1592 (2013).
- Peterson, J. R., et al. Treatment of heterotopic ossification through remote ATP hydrolysis. Sci Transl Med. 6 (255), 255ra132 (2014).
- Peterson, J. R., et al. Early detection of burn induced heterotopic ossification using transcutaneous Raman spectroscopy. Bone. 54 (1), 28-34 (2013).
- Perosky, J. E., et al. Early detection of heterotopic ossification using near-infrared optical imaging reveals dynamic turnover and progression of mineralization following Achilles tenotomy and burn injury. J Orthop Res. 32 (11), 1416-1423 (2014).
- Peterson, J. R., et al. Effects of Aging on Osteogenic Response and Heterotopic Ossification Following Burn Injury in Mice. Stem Cells Dev. , (2014).
- Alfieri, K. A., Forsberg, J. A., Potter, B. K. Blast injuries and heterotopic ossification. Bone and Joint Research. 1 (8), 174-179 (2012).
- Hunt, J. L., Arnoldo, B. D., Kowalske, K., Helm, P., Purdue, G. F. Heterotopic ossification revisited: a 21-year surgical experience. J Burn Care Res. 27 (4), 535-540 (2006).
- Ring, D., Jupiter, J. B. Operative release of ankylosis of the elbow due to heterotopic ossification. Surgical technique. J Bone Joint Surg Am. 86-A, Suppl 1. 2-10 (2004).
- Crane, N. J., Polfer, E., Elster, E. A., Potter, B. K., Forsberg, J. A. Raman spectroscopic analysis of combat-related heterotopic ossification. Bone. 57 (2), 335-342 (2013).
