Protocol
Ethics Statement: Eighth Edition aus dem Institut für Labortierforschung (ILAR, 2011) und waren: Alle tierischen Verfahren wurden in strikter Übereinstimmung mit der guten Tierpraxis in den Leitlinien im Leitfaden für die Benutzung und Pflege von Labortieren vorgesehen definiert durchgeführt von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee der University of Michigan (PRO0001553) zugelassen.
1. Maus Chirurgische Verfahren
HINWEIS: Verwenden Sie 8-10 Wochen alte C57BL / 6 Mäusen. Andere Altersgruppen, Hintergründe und Stämme von Mäusen können auch verwendet werden, um verschiedene Bedingungen oder Erbgut zu testen. Für die Tenotomie Teil des Verfahrens zu erhalten sterilen Bedingungen unter Verwendung von Gesichtsmaske, Haarhaube und sterile Kittel, Handschuhe und Instrumente. Operationsstellen sollten steril mit PVP-Jod und sterilen Abdeckung hergestellt werden. Hypothermie zu vermeiden, indem ein veterinär Heizkissen und Aufwärmen Reanimation Lösungen bis 37 ° C vor dem Verwaltungstion.
- Betäuben die Maus mit 2,5% inhalativen Isofluran. Verwenden Sie einen Nasenkegel, um den Rücken und hinteren Extremitäten leicht zugänglich zu verlassen. Passen Sie die Geschwindigkeit von Isofluran Verwaltung, geeignete Atemfrequenz und Färbung der Schleimhaut zu erhalten und Anästhesie, indem Muskeltonus, toe Prise, und Kornealreflex gewährleisten. Bewerben fad Augensalbe die Augen der Maus die zu trockene Augenverletzung während des Verfahrens zu verhindern. Es ist für ausreichende Körpertemperatur mit Hilfe eines Veterinär Heizkissen oder warmem Wasser Zirkulator unter dem OP-Feld.
- Verabreichen Buprenorphin, 0,1 mg / kg, subkutan unmittelbar vor der Operation zur Analgesie.
- Eng rasieren die Operationsstelle auf der linken Hinterpfote mit Schermaschinen von der Ferse bis zum Knie.
- Eng rasieren den Rücken der Maus, beginnend über die Wirbelsäule und die Verlängerung der rasierten Bereich auf der linken Seite der Rückenmittellinie, Clearing über eine Fläche von mindestens 2 cm x 3 cm, um die Brandverletzung unterzubringen.
- Bereiten Sie die Operationsstelle, einschließlich der Hinterpfote bis zum Knie mit 3 Wechsel Povidonjod Peelings.
- Führen einen Längsschnitt entlang der medialen Seite des linken Achillessehne. Verlängern Sie den Schnitt, so dass die Achillessehne leicht sichtbar gemacht werden; ca. 0,5 cm.
- Führen Sie eine Achilles-Tenotomie mit scharfen Dissektion der Sehne in der Mitte mit scharfen Gewebe Schere. Einfügen einer Klinge der Schere Gewebe in der Gewebeebene unterhalb der Sehne und sezieren entlang der Ebene, bis das Blatt an der Sehnenmittelpunkts. Schließen Sie die Scherenblätter um die Sehne scharf zu trennen.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, Einbeziehung aller hinteren Sehnen einschließlich Gastrocnemius, Soleus und Plantaris Sehnen. - Blutstillung zu erreichen, indem Druck mit steriler Gaze (es sollte minimal Blutungen) und schließen Sie die Hautschnitt mit einem 5-0 Vicryl Stich.
- Führen Sie die Rückenteildicke brennen mit einem Aluminiumblock mit einem Gewicht von 35 g mit ungefähren Messung!ts 2 cm x 2 cm x 3 cm bis 60 ° C erhitzt in einem Wasserbad auf den rasierten Rücken der Maus für 17 sec aufgebracht.
HINWEIS: Erreichen Sie die entsprechende Brenntiefe um den Block ruht auf der Oberseite des narkotisierten Maus, um sicherzustellen, dass die gesamte Oberfläche des Blocks in Kontakt mit der Maus, aber vermeiden, dass keine zusätzlichen Druck auf den Block, das heißt, die Schwerkraft zu sein die einzige Kraft, die den Block an Ort und Stelle. Eine dünne Kunststoffgriff zu einer Seite des Blocks angebracht ist für Manipulation, Stabilisierung und Wiedergewinnung aus dem heißen Wasserbad. Diese schaffen eine etwa 30% Körperoberfläche zu verbrennen in einer 8-10 Wochen alte C57BL / 6-Maus. Dieser Kontakt burn wurde gegenüber anderen Methoden (Flamme oder verbrühen burn) aufgrund der Gleichmäßigkeit der Verbrennung Tiefe über die Wunde und die Reproduzierbarkeit zwischen Tieren ausgewählt. - Trocknen Sie die Verbrennungsstelle mit Gaze und tragen Sie eine Tegaderm Verband.
- Verwalten erwärmt Reanimation Flüssigkeiten: Ringer-Lactat-Lösung 1 mlintraperitoneale Injektion und 0,5 ml subkutane Injektion. Diese einmalige Verabreichung von Lungen-Wiederbelebung ist ausreichend für die Wiederherstellung von der Brandverletzung und Tenotomie.
HINWEIS: narkotisierten Mäusen mit anderen Mäusen einzeln in saubere Käfige zurück Sie nicht, Gehäuse Käfigen, Haus unter Kontrolle, bis die Mäuse vollständig erholt. Typische Erholung tritt innerhalb von 1-6 Std. Burn-Sites in der Regel innerhalb von 2-4 Wochen heilen und werden nur selten von Wundinfektion kompliziert, wenn in sauberen Umgebungen Gehäuse gehalten. - Verwalten Buprenorphin 0,1 mg / kg subkutan alle 12 Stunden für 3 Tage nach dem Eingriff. Überwachen HO Wachstum mit Serien μCT-Scans in angemessenen Zeitabständen. Ektope Knochenwachstum ist zunächst klar, rund 3 Wochen postoperativ durch μCT.
HINWEIS: Die Mehrheit der HO Entwicklung komplett von 9 Wochen nach der Operation ist. Wir haben beobachtet, einen Unterschied in der Lautstärke oder HO gelegene wiederholt μCT scannt zweimal wöchentlich für 15 Wochen im Vergleich zu einer einzelnen Endpunkt μCT bei 15 Schwangerschaftswochen.Am Ende der Versuche, einschläfern Alle Mäuse mit CO 2 Inhalation gemäß gültiger Richtlinien und überprüfen Sie den Tod mit Genickbruch nach 10 min.
2. μCT-Akquisition und Analyse
- Sichern Sie den narkotisierten Maus auf das Scanner-Bett in der Bauchlage. Kleben Sie die Hinterbeine sicher an dem Bett Atembewegungsartefakte zu vermeiden. Fügen Sie die Luft, das Wasser und Hydroxylapatit enthält Phantom unter der Maus für die Bildkalibrierung.
- Öffnen Sie die Knochenanalyse-Software und eine Region of Interest (ROI), die beide Hinterbeine aus dem Hüftgelenk proximal zu der Spitze der Hinterpfote distal umfasst definieren. Erhalten Sie Bild mit den folgenden Parametern:. 80 kV, 500 & mgr; A und 1,300 msec Exposition, 48 & mgr; m Voxelgröße 14,15
- Kalibrierung des Bildes auf Hounsfield-Einheiten (HU), die durch Ziehen eines ROI in jeder der drei Kammern Phantom und Eingeben der mittleren Dichte in die entsprechenden Felder indie Software.
- Mit dem "Grabber" Werkzeug in der Software, neu orientieren das Bild so das Schienbein des linken Hinterbein parallel entlang der Z-Achse, um das klarste Ansicht anatomische für die Abgrenzung der orthotopen kortikalen Knochen Strukturen und HO ermöglichen.
- Beginnend am Knie, distal blättern Sie durch die Bildschnitte bis HO angetroffen wird. Verwendung des manuellen Spline-Werkzeug, machen Sie eine ROI um die ektopische Knochen auf jedem 5. Scheibe distal weiter durch die Pfote oder bis HO wurde übertroffen. Verwenden Sie das extrapolieren-Tool zu erweitern und zu nähen die ROIs zusammen in einem ROI, die den ganzen HO enthält.
- Einen 3D-ROI und wählen Sie das Analyse-Menü. Berechnen Sie die Knochenvolumen, indem Sie die untere und obere Grenzwerte, die das Knochenfenster am besten zeigen. Verwenden Sie die gleichen festen Schwellenwerten für alle Scans.
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Representative Results
In der vorliegenden Studie wird das Protokoll für die zuvor veröffentlichten Maus-Modell der Trauma beschrieben / brennen induzierte HO. 14-17 Dieses beinhaltet die Schaffung von gleichzeitigen lokalisierten Muskel-Skelett-Verletzungen mit einer Achilles-Tenotomie und globale entzündliche Beleidigung mit einer Teildicke Verletzungen verbrennen. Dies führt bei der zuverlässigen Bildung reaktiver Knochen an der Stelle, die mit tenotomy seriellen Bildgebung verfolgt werden kann. Bisher wurden alle Mäuse (mehr als 50), die sowohl Achilles Tenotomie erlitten haben und Verletzungen brennen Sie eine messbare Menge an HO an der Tenotomie Website entwickelt. Um die Bildung von ektopischen Knochen zu quantifizieren, wird eine kalibrierte Bild μCT-Protokoll an jedem gewünschten Zeitpunkt verwendet. Die Zugabe einer Brandverletzung in Kombination mit dem Achillessehnentenotomie hat erwiesenermaßen bei der Induktion von signifikanten HO sein. Wobei beide Verletzungen geschieht gleichzeitig gibt es eine signifikante Zunahme in der Menge von ektopischen Knochen, am tenotomy Stelle gebildet wird, verglichen mit Achilles tenotomy allein (Abbildung 1). 17
Abbildung 1. HO Entwicklung folgenden Achilles Tenotomie mit oder ohne gleichzeitigen Brandverletzungen. Alle Mäuse erhielten eine Achilles-Tenotomie des linken Hinterbein, die Hälfte der Mäuse erhielten auch eine 30% TBSA Teildicke Brandverletzungen auf dem Rücken. μCT Scans wurden bei 5 Tagen und 3, 5, 7, 9 abgeschlossen, und 15 Wochen nach der Verletzung. (EIN). Repräsentative 3D-Rekonstruktionen sind mit orthotopen Knochen weiß und HO blau gefärbt gezeigt. Rote Kreise zeigen niduses von HO. Ektopischen Knochen entsteht im Bereich des tenotomy sowie Standorte distal und proximal der verletzten Stelle in der unteren Extremität. Ähnlich wie HO clnically gesehen kann diese reaktiven Knochen zusammenhängenden mit Skelett-Knochen oder aus der Ferne zu entwickeln in Weichgewebe. (B). Com Quantifizierung der HO warabgeschlossen mit einem kalibrierten Bild Protokoll und in der Grafik dargestellt. HO hat sich über 15 Wochen blieb jedoch Entwicklung Plateaus zwischen 9-15 Wochen mit dem größten Wachstumsgeschwindigkeit in der Regel zwischen 5-9 Wochen. Daten sind Mittelwerte +/- SD, n = 4 pro Gruppe, Student-t -Test, * P <0.05 (Bitte beachten Sie, dass dies zuvor veröffentlichten Daten, von 17 modifiziert). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | 664 | 8-10 weeks old |
| Isoflurane – Fluriso | VET one, Boise, ID | V1 501017 | |
| Buprenorphine – Buprenex | Reckitt Benckiser Healthcare | NDC 12496-0757-1 | 0.3 mg/ml solution |
| Betadine | Owens and Minor, Mechanicsville, VA | 2047PVP202 | |
| 5-0 Vicryl sutures | Ethicon, Summerville, NJ | J493 | |
| Tegaderm Film, 6 cm x 7 cm | 3M | 1624W | Cut in half to properly cover burn site |
| µCT - GE eXplore Locus SP | GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada | ||
| Microview 2.2 Advanced Bone Analysis Application | GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada |
References
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