Protocol
بيان الأخلاق: تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا صارم مع ممارسة الحيوان جيدة كما هو محدد في المبادئ التوجيهية الواردة في دليل لاستخدام ورعاية الحيوانات المختبرية: الطبعة الثامنة من معهد مختبر أبحاث الحيوان (ILAR، 2011)، وكانت التي وافقت عليها اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام جامعة ميشيغان (PRO0001553).
1. ماوس العمليات الجراحية
ملاحظة: استخدام 8-10 أسبوع C57BL القديمة / 6 الفئران. ويمكن أيضا أن الأعمار الأخرى، والخلفيات، وسلالات من الفئران يمكن استخدامها لاختبار ظروف مختلفة أو وراثية الماكياج. للجزء بضع الوتر الإجراء، والحفاظ على ظروف معقمة باستخدام قناع الوجه، غطاء محرك السيارة الشعر، وثوب معقمة، والقفازات، والصكوك. مواقع الجراحية وينبغي إعداد sterilely مع بوفيدون اليود واللف العقيمة. تجنب انخفاض حرارة الجسم عن طريق استخدام وسادة التدفئة البيطرية وارتفاع درجة حرارة حلول الإنعاش إلى 37 درجة مئوية قبل administraنشوئها.
- تخدير الماوس باستخدام 2.5٪ الأيزوفلورين استنشاقه. استخدام مخروط الأنف لمغادرة ظهر وهند-أطرافه يمكن الوصول إليها بسهولة. ضبط معدل الإدارة الأيزوفلورين للحفاظ على معدل التنفس المناسب والتلون من الأغشية المخاطية وضمان التخدير عن طريق فحص العضلات، قرصة أخمص قدميه، ومنعكس القرنية. تطبيق مرهم للعين للعيون لطيف الماوس، لمنع الإصابة جفاف العين أثناء العملية. الحفاظ على درجة حرارة الجسم الكافية استخدام وسادة التدفئة البيطرية أو دائري ماء دافئ تحت الجراحي الميداني.
- إدارة البوبرينورفين، 0.1 ملغم / كغم، تحت الجلد مباشرة قبل عملية جراحية لتسكين الألم.
- حلق بشكل وثيق موقع الجراحية على مخلب هند اليسار باستخدام كليبرز من كعب إلى الركبة.
- عن كثب حلق ظهر من الفأرة، بدأت على العمود الفقري وتمتد منطقة حلق إلى الجهة اليسرى من خط الوسط الظهرية، وتطهير مساحة لا تقل عن 2 سم × 3 سم لاستيعاب حروق.
- إعداد موقع الجراحية، بما في ذلك مخلب هند إلى الركبة باستخدام 3 بالتناوب بوفيدون اليود الدعك.
- إجراء شق طولي على طول الجانب الأنسي في وتر العرقوب نقاط. تمديد شق ذلك على وتر أخيل يمكن تصور بسهولة. حوالي 0.5 سم.
- إجراء بضع الوتر أخيل مع تشريح حاد في وتر في منتصف مع مقص حاد الأنسجة. إدراج شفرة واحدة من مقص الأنسجة في الطائرة الأنسجة تحت وتر وتشريح على طول الطائرة حتى النصل في منتصف وتر. إغلاق شفرات مقص لقطع وتر بشكل حاد.
ملاحظة: تأكد من إدراج كل الأوتار الخلفية بما في ذلك الساق، النعلية، والأوتار الأخمصية. - تحقيق الإرقاء عن طريق الضغط مع شاش معقم (يجب أن يكون هناك الحد الأدنى من النزيف) وإغلاق شق الجلد مع غرزة 5-0 VICRYL.
- أداء ظهري حرق سمك جزئي مع كتلة الألومنيوم وزنها 35 غ مع measuremen التقريبيةTS 2 سم × 2 سم × 3 سم تسخينها إلى 60 درجة مئوية في حمام مائي تطبيقها على ظهر حليق من الفأرة لمدة 17 ثانية.
ملاحظة: تحقيق عمق الحرق المناسب من قبل يستريح كتلة على رأس الماوس تخدير، وضمان أن مساحة كاملة من كتلة على اتصال مع الماوس، ولكن تجنب تطبيق أي ضغط إضافي للكتلة، أي تسمح خطورة لتكون القوة الوحيدة عقد الكتلة في المكان. مقبض من البلاستيك رقيقة تعلق على جانب واحد من كتلة مريحة للتلاعب، وتحقيق الاستقرار، واسترجاع من حمام الماء الساخن. هذا سيخلق حرق مساحة سطح الجسم الكلي حوالي 30٪ في 8-10 أسبوع من العمر C57BL / 6 الماوس. وقد تم اختيار هذا الحرق الاتصال عبر وسائل أخرى (لهب تحرق أو حرق) نتيجة لتوحيد عمق الحرق على الجرح والتكاثر بين الحيوانات. - تجفيف موقع الحرق بشاش وتطبيق الملابس tegaderm.
- إدارة سوائل الانعاش درجة حرارة: أفرز اللبن قارع الأجراس في حل 1 ملالحقن داخل الصفاق و 0.5 مل الحقن تحت الجلد. هذه الإدارة لمرة واحدة الإنعاش كافية للتعافي من إصابة الحروق وبضع الوتر.
ملاحظة: لا عودة الفئران تخدير لأقفاص السكن مع الفئران الأخرى، منزل على حدة في أقفاص نظيفة تحت المراقبة حتى تعافى تماما الفئران. يحدث الانتعاش نموذجية ضمن 1-6 ساعة. مواقع الحروق تشفى عادة خلال 2-4 أسابيع ونادرا ما تتعقد بسبب عدوى الجرح إذا كان يحتفظ بها في بيئات السكن نظيفة. - إدارة البوبرينورفين 0.1 ملغ / كغ من الحقن تحت الجلد كل 12 ساعة لمدة 3 أيام بعد العملية. مراقبة نمو HO مع بالاشعة μCT التسلسلية على فترات مناسبة. نمو العظام خارج الرحم هو أول حوالي 3 أسابيع واضحا بعد العملية التي μCT.
ملاحظة: غالبية تطوير HO كاملة بنسبة 9 أسابيع بعد العملية. لم نلحظ تغييرا في حجم HO أو الموقع مع تكرار μCT بمسح مرتين أسبوعيا لمدة 15 أسبوعا مقارنة مع نهاية نقطة واحدة μCT مسح في 15 أسبوعا.في نهاية التجارب، الموت ببطء كل الفئران مع CO 2 الاستنشاق وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والتحقق من الموت مع خلع عنق الرحم بعد 10 دقيقة.
2. μCT اقتناء وتحليل
- تأمين الماوس تخدير على السرير الماسح الضوئي في وضعية الانبطاح. الشريط أطرافه الخلفية بشكل آمن إلى السرير لمنع التنفس الحركة قطعة أثرية. تشمل الهواء والماء وتحتوي على هيدروكسيباتيت الوهمية تحت الماوس لصورة المعايرة.
- فتح برنامج تحليل العظام وتحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) الذي يضم كلا من الأطراف الخلفية من مفصل الورك بشكل قريب إلى غيض من مخلب الخلفيتين بشكل أقصى. الحصول على صورة باستخدام المعلمات التالية: 80 كيلو فولت، 500 أمبير والتعرض 1300 مللي ثانية، 48 ميكرون حجم فوكسل 14،15
- معايرة الصورة لوحدات هاونسفيلد (HU) عن طريق رسم ROI في كل دائرة من الدوائر الوهمية الثلاثة وإدخال متوسط الكثافة في الحقول المناسبة فيالبرنامج.
- باستخدام أداة "المختطف" في البرنامج، وإعادة توجيه الصورة بحيث الساق من أطرافه هند الأيسر هو مواز على طول محور Z للسماح أوضح رأي التشريحية لترسيم الهياكل العظمية القشرية مثلي وHO.
- ابتداء من الركبة، انتقل بشكل أقصى من خلال شرائح الصورة حتى مصادفة HO. باستخدام أداة شريحة اليدوية، وجعل العائد على الاستثمار في جميع أنحاء العظم خارج الرحم على كل شريحة ال 5 المستمرة بشكل أقصى من خلال مخلب أو حتى يتم تجاوز HO. استخدام أداة استقراء لتوسيع وغرزة رويس معا في ROI واحد يحتوي على جميع HO.
- جعل ROI 3D واختيار القائمة التحليل. حساب حجم العظام من خلال تحديد قيم العتبة الدنيا والعليا التي تظهر أفضل نافذة العظام. استخدام نفس القيم الحدية ثابتة لجميع بالاشعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذه الدراسة، يوصف بروتوكول لنموذج الفأر التي تم نشرها مسبقا من الصدمة / حرق الناجم HO 14-17 وهذا ينطوي على إنشاء المتزامنة الإصابة العضلية الموضعية مع بضع الوتر أخيل وإهانة التهابات العالمية مع سمك الجزئي حرق الاصابة. وهذا يؤدي إلى تشكيل موثوق العظام التفاعلي في موقع بضع الوتر التي يمكن اتباعها مع التصوير المسلسل. حتى الآن، وقد وضعت جميع الفئران (أكثر من 50) التي تعرضت لكلا أخيل بضع الوتر وحرق إصابة كمية قابلة للقياس من HO في موقع بضع الوتر. لتحديد تكوين العظام خارج الرحم، يتم استخدام البروتوكول صورة μCT معايرة في كل المطلوب الوقت نقطة. وقد ثبت إضافة حروق في تركيبة مع بضع الوتر أخيل أن يكون المفتاح في تحريض HO كبير. مع كل الإصابات يحدث بشكل متزامن هناك زيادة كبيرة في كمية العظم خارج الرحم التي يتم تشكيلها في موقع بضع الوتر مقارنة مع ميلانحلس بضع الوتر وحدها (الشكل 1). 17
الشكل 1. تطوير HO التالية أخيل بضع الوتر مع أو دون وقوع إصابات الحروق المتزامنة، وتلقى جميع الفئران لبضع الوتر الضعف في الطرف الأيسر هند، نصف الفئران كما تلقى 30٪ TBSA سمك الجزئي حرق الإصابة على ظهر. تم الانتهاء من مسح μCT في 5 أيام و 3 و 5 و 7 و 9 و 15 أسبوعا بعد الإصابة. (A). وتظهر عمليات إعادة البناء 3D تمثيلية مع العظم مثلي الأبيض والأزرق HO الملونة. الدوائر الحمراء تشير niduses من HO. تطور العظام خارج الرحم في منطقة بضع الوتر فضلا عن مواقع القاصي والداني في موقع الإصابة في الطرف السفلي. على غرار HO ينظر clnically، وهذا يمكن أن يكون رد الفعل العظام متجاورة مع العظام والهيكل العظمي أو تطوير عن بعد في الأنسجة اللينة. (B). كان القياس الكمي للHO كومpleted مع بروتوكول صورة معايرة ويظهر في الرسم البياني. استمر HO ما بعد 15 أسابيع، ولكن الهضاب التنمية بين 9-15 أسابيع مع أعظم سرعة نمو ينظر عادة بين 5-9 أسابيع. البيانات هي وسائل +/- SD، ن = 4 لكل مجموعة، طالبة تي -test، * P <0.05 (يرجى ملاحظة أن هذا هو البيانات أو تعديلها من 17 نشرت سابقا). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | 664 | 8-10 weeks old |
| Isoflurane – Fluriso | VET one, Boise, ID | V1 501017 | |
| Buprenorphine – Buprenex | Reckitt Benckiser Healthcare | NDC 12496-0757-1 | 0.3 mg/ml solution |
| Betadine | Owens and Minor, Mechanicsville, VA | 2047PVP202 | |
| 5-0 Vicryl sutures | Ethicon, Summerville, NJ | J493 | |
| Tegaderm Film, 6 cm x 7 cm | 3M | 1624W | Cut in half to properly cover burn site |
| µCT - GE eXplore Locus SP | GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada | ||
| Microview 2.2 Advanced Bone Analysis Application | GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada |
References
- Leblanc, E., et al. BMP-9-induced muscle heterotopic ossification requires changes to the skeletal muscle microenvironment. J Bone Miner Res. 26 (6), 1166-1177 (2011).
- Shore, E. M. Osteoinductive signals and heterotopic ossification. J Bone Miner Res. 26 (6), 1163-1165 (2011).
- Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. J Bone Miner Res. 27 (5), 1004-1017 (2012).
- Potter, B. K., et al. Heterotopic ossification following combat-related trauma. J Bone Joint Surg Am. 92, Suppl 2. 74-89 (2010).
- Van den Bossche, L., Vanderstraeten, G. Heterotopic ossification: a review. J Rehabil Med. 37 (3), 129-136 (2005).
- Chakkalakal, S. A., et al. An Acvr1 R206H knock-in mouse has fibrodysplasia ossificans progressiva. J Bone Miner Res. 27 (8), 1746-1756 (2012).
- Yu, P. B., et al. BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic [corrected] ossification. Nat Med. 14 (12), 1363-1369 (2008).
- Culbert, A. L., et al. Alk2 regulates early chondrogenic fate in fibrodysplasia ossificans progressiva heterotopic endochondral ossification. Stem Cells. 32 (5), 1289-1300 (2014).
- Dinther, M., et al. ALK2 R206H mutation linked to fibrodysplasia ossificans progressiva confers constitutive activity to the BMP type I receptor and sensitizes mesenchymal cells to BMP-induced osteoblast differentiation and bone formation. J Bone Miner Res. 25 (6), 1208-1215 (1359).
- Peterson, J. R., et al. Burn injury enhances bone formation in heterotopic ossification model. Ann Surg. 259 (5), 993-998 (2014).
- Scott, M. A., et al. Brief review of models of ectopic bone formation. Stem Cells Dev. 21 (5), 655-667 (2012).
- Tannous, O., Griffith, C., O'Toole, R. V., Pellegrini, V. D. Heterotopic ossification after extremity blast amputation in a Sprague-Dawley rat animal model. J Orthop Trauma. 25 (8), 506-510 (2011).
- Tannous, O., et al. Heterotopic bone formation about the hip undergoes endochondral ossification: a rabbit model. Clin Orthop Relat Res. 471 (5), 1584-1592 (2013).
- Peterson, J. R., et al. Treatment of heterotopic ossification through remote ATP hydrolysis. Sci Transl Med. 6 (255), 255ra132 (2014).
- Peterson, J. R., et al. Early detection of burn induced heterotopic ossification using transcutaneous Raman spectroscopy. Bone. 54 (1), 28-34 (2013).
- Perosky, J. E., et al. Early detection of heterotopic ossification using near-infrared optical imaging reveals dynamic turnover and progression of mineralization following Achilles tenotomy and burn injury. J Orthop Res. 32 (11), 1416-1423 (2014).
- Peterson, J. R., et al. Effects of Aging on Osteogenic Response and Heterotopic Ossification Following Burn Injury in Mice. Stem Cells Dev. , (2014).
- Alfieri, K. A., Forsberg, J. A., Potter, B. K. Blast injuries and heterotopic ossification. Bone and Joint Research. 1 (8), 174-179 (2012).
- Hunt, J. L., Arnoldo, B. D., Kowalske, K., Helm, P., Purdue, G. F. Heterotopic ossification revisited: a 21-year surgical experience. J Burn Care Res. 27 (4), 535-540 (2006).
- Ring, D., Jupiter, J. B. Operative release of ankylosis of the elbow due to heterotopic ossification. Surgical technique. J Bone Joint Surg Am. 86-A, Suppl 1. 2-10 (2004).
- Crane, N. J., Polfer, E., Elster, E. A., Potter, B. K., Forsberg, J. A. Raman spectroscopic analysis of combat-related heterotopic ossification. Bone. 57 (2), 335-342 (2013).
