Protocol
הצהרת אתיקה: נהלי כל החיה בוצעו בהתאם קפדן עם תרגול חיה טוב כפי שהוגדר בהנחיות המופיעות במדריך לשימוש וטיפול בחי מעבדה: המהדורה השמינית של המכון לחקר בעלי החיים מעבדה (ILAR, 2011) והיו אושר על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת מישיגן (PRO0001553).
1. ניתוחי עכבר
הערה: C57BL הישן 8-10 השבוע השתמש / 6 עכברים. גם בגילים אחרים, רקעים, וזנים של עכברים יכולים לשמש כדי לבדוק תנאים שונים או איפור גנטי. עבור חלק tenotomy של ההליך, לשמור על תנאים סטריליים באמצעות מסיכת פנים, כובע שיער, ושמלת סטרילי, כפפות, ומכשירים. אתרי כירורגי צריכים להיות מוכנים סטרילי עם povidone- יוד וכורך סטרילי. הימנע היפותרמיה באמצעות כרית חימום וטרינרים והתחממות פתרונות החייאה עד 37 מעלות צלזיוס לפני ניהול כלליtion.
- להרדים את העכבר באמצעות 2.5% isoflurane בשאיפה. השתמש חרטום לעזוב את dorsum ואחורי-גפיים נגישים בקלות. התאם את שיעור ממשל isoflurane לשמור על קצב מתאים נשימה וצבע של קרומים ריריים ולהבטיח הרדמה על ידי בדיקת טונוס שרירים, קמצוץ הבוהן, ורפלקס מצמוץ. החל משחת עיניים תפל לעיניו של העכבר כדי למנוע פגיעה בעין יבשה במהלך ההליך. לשמור על טמפרטורת גוף מתאימה באמצעות כרית חימום וטרינרים או circulator מים חם מתחת לשדה הניתוח.
- לנהל עצירות, 0.1 מ"ג / קילוגרם, תת עורי מייד לפני הניתוח לשיכוך כאבים.
- מקרוב לגלח את האתר כירורגית על הכף האחורית השמאלית באמצעות קוצץ מהעקב עד הברך.
- מקרוב לגלח dorsum של העכבר, מתחיל מעל עמוד השדרה והארכת האזור המגולח בצד השמאל של קו האמצע הגב, ניקוי שטח לפחות 2 סנטימטרים X 3 סנטימטר כדי להתאים את פציעת הכווייה.
- הכן את האתר כירורגית, כולל הכף האחורית בברך באמצעות סקראבס povidone- יוד 3 לסירוגין.
- לבצע חתך אורכי לאורך ההיבט המדיאלי של גיד אכילס עזב. להאריך את החתך כך ניתן דמיין בקלות גיד אכילס; כ 0.5 סנטימטר.
- בצע tenotomy אכילס עם נתיחה חדה של הגיד באמצע עם מספריים חדים רקמה. הכנס להב אחד המספריים הרקמה במטוס הרקמה מתחת לגיד ולנתח יחד את המטוס עד שהלהב הוא באמצע הגיד. סגור את להבי המספריים לנתק את הגיד בצורה חדה.
הערה: ודא הכללה של כל הגידים האחוריים כוללים הגסטרוקנמיוס, soleus, וגידי Plantaris. - להשיג עצירת דימום על ידי הפעלת לחץ עם גזה סטרילית (לא אמור להיות דימום מינימאלי) ולסגור את החתך בעור עם תפר 5-0 vicryl.
- לבצע צריבת העובי החלקית הגב עם בלוק אלומיניום במשקל גרם 35 עם measuremen המשוערTS 2 סנטימטרים X 2 ס"מ על 3 סנטימטר מחומם ל -60 מעלות צלזיוס באמבט מים להחיל את dorsum המגולח של העכבר במשך 17 שניות.
הערה: השג את עומק הכווייה המתאים על ידי מנוחה הבלוק על גבי העכבר הרדים, להבטיח כי את כל פני השטח של הבלוק הוא במגע עם העכבר, לעומת זאת להימנע מהחלה כל לחץ נוסף לבלוק, כלומר, לאפשר את כוח משיכה כדי להיות הכוח היחיד שהחזיק את הגוש במקום. ידית פלסטיק דקיקה שצמודה אל צד אחד של הבלוק היא נוחה למניפולציה, ייצוב, ואחזור מאמבט המים החם. זו תיצור שטח גוף הכולל של כ -30% לשרוף בC57BL / 6 עכבר 8-10 בן שבוע. כווייה קשר זה נבחרה על פני שיטות אחרות (צריבת להבה או לחלוט) בשל האחידות של עומק כווייה על הפצע והשחזור בין בעלי החיים. - ייבש את אתר הכווייה בגזה ולהחיל הלבשה Tegaderm.
- לנהל נוזלי החייאה חיממו: פתרון מיליליטר 1 של Lactated רינגרזריקת intraperitoneal ו -0.5 הזרקה תת עורית מיליליטר. ממשל חד פעמי זה של החייאה הוא נאות להתאוששות מהפציעה הכווייה וtenotomy.
הערה: אל תחזור עכברים מורדמים לכלובי דיור עם עכברים אחרים, בית בנפרד בכלובים נקיים תחת ניטור עד עכברים הם התאוששו באופן מלא. התאוששות אופיינית מתרחשת בתוך 1-6 שעות. אתרי צריבה בדרך כלל לרפא בתוך 2-4 שבועות ומסובכים לעתים רחוקות על ידי זיהום פצע אם המשיכו בסביבות דיור נקיות. - לנהל 0.1 מ"ג / קילוגרם עצירות הזרקה תת עורית בכל 12 שעות במשך 3 ימים לאחר ההליך. צג צמיחת HO עם סריקות μCT סידוריים במרווחים מתאימים. צמיחת עצם מחוץ לרחם היא ראשונה שלאחר ניתוח בסביבות 3 שבועות ניכרו על ידי μCT.
הערה: רוב פיתוח HO הושלם על ידי 9 שבועות לאחר ניתוח. אנחנו לא נצפו הבדל בנפח HO או מיקום עם μCT חזר סריקות דו שבועי במשך 15 שבועות בהשוואה לנקודת סיום אחת μCT לסרוק בגיל 15 שבועות.בסופו של הניסויים, להרדים את כל העכברים עם CO 2 משאיפת פי הנחיות מוסדיות ולאמת מוות עם נקע בצוואר הרחם לאחר 10 דקות.
2. μCT רכישה וניתוח
- אבטח את העכבר מורדם על מיטת הסורק במצב שכיבה. הדבק את הגפיים האחוריות היטב למיטה כדי למנוע נשימת חפץ תנועה. כלול את האוויר, מים, וhydroxyapatite מכיל פנטום מתחת לעכבר לכיול תמונה.
- פתח את תוכנת עצם ניתוח ולהגדיר אזור של העניין (ROI) המקיף את שני גפיים אחוריות ממפרק ירך proximally לקצה הכף האחורית distally. להשיג תמונה באמצעות הפרמטרים הבאים:. 80 קילו וולט, 500 מיקרו-אמפר ו1,300 חשיפה msec, גודל voxel 48 מיקרומטר 14,15
- לכייל את התמונה ליחידות Hounsfield (האוניברסיטה העברית) על ידי ציור את ההחזר על ההשקעה בכל אחת משלושת תאי הפנטום ומזין את הצפיפות הממוצעת בשדות המתאימים בהתוכנה.
- שימוש באפשרות "חוטף" בתוכנה, רי-אוריינט את התמונה כך השוקה של הגפיים האחורי השמאלי מקבילה לאורך ציר Z כדי לאפשר את התצוגה אנטומיים הברורה לתיחום של מבני orthotopic קליפת המוח עצם וHO.
- החל בברך, לגלול distally דרך פרוסות התמונה עד HO הוא נתקל. שימוש בכלי שגם במדריך, לעשות את ההחזר על ההשקעה סביב עצם חוץ רחמי על כל פרוסה -5 ממשיכה distally דרך הכפה או עד HO כבר עלה. השתמש בכלי להסיק להאריך ולתפור ROIs יחד להחזר על השקעה אחד שמכיל את כל HO.
- הפוך את ההחזר על השקעת 3D ולבחור את תפריט הניתוח. חשב את נפח העצם על ידי הגדרת ערכי הסף התחתונים ועליונים בצורה הטובה ביותר להציג את חלון העצם. השתמש באותם ערכי סף שנקבעו לכל הסריקות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במחקר הנוכחי, את הפרוטוקול מתואר למודל העכבר שפורסם בעבר של טראומה / לשרוף מושרה HO. 14-17 זה כרוך ביצירה של פציעת שריר-שלד מקומי במקביל לtenotomy אכילס ועלבון דלקתי העולמי בעובי חלקי לשרוף פציעה. התוצאה היא היווצרות אמינה של עצם תגובה באתר tenotomy שניתן אחריו עם הדמיה סידורי. עד כה, כל העכברים (יותר מ -50) שספגו שתי tenotomy אכילס ולשרוף פציעה פיתחו סכום מדיד של HO באתר tenotomy. כדי לכמת את היווצרות העצם מחוץ לרחם, פרוטוקול μCT תמונה מכויל משמש בכל נקודת זמן רצויה. התוספת של פציעת כווייה בשילוב עם tenotomy אכילס הוכיחה להיות מפתח באינדוקציה של HO המשמעותי. עם שני הפציעות קורים במקביל יש גידול משמעותי בכמות העצם מחוץ לרחם שנוצרה באתר tenotomy לעומת Actenotomy חילס לבד (איור 1). 17
איור 1. פיתוח HO הבא tenotomy אכילס עם או בלי פציעת כווייה במקביל. כל העכברים קיבלו tenotomy אכילס של הגפיים האחורי השמאלי, מחצית מהעכברים קיבלה גם 30% עובי חלקי TBSA לשרוף פגיעה בdorsum. סריקות μCT הושלמו בשעה 5 ימים ו 3, 5, 7, 9, ו -15 שבועות לאחר פציעה. (). שחזורי 3D נציג מוצגים עם עצם orthotopic לבן וHO בצבע כחול. עיגולים אדומים מצביעים niduses של HO. עצם מחוץ לרחם מתפתח באזור של tenotomy כמו גם מקומות דיסטלי ופרוקסימלי לאתר פגיעה בגפיים התחתונים. בדומה לHO ראה clnically, עצם תגובה זו יכול להיות רציף עם עצם שלד או לפתח מרחוק ברקמות רכות. (ב). כימות של HO הייתה completed עם פרוטוקול תמונה מכוילת ומוצג בגרף. HO נמשך מעבר ל -15 שבועות, אולם רמות פיתוח בין 9-15 שבועות עם מהירות הצמיחה הגדולה ביותר לראות בדרך כלל בין 5-9 שבועות. הנתונים הם אמצעי +/- SD, n = 4 לכל קבוצה, -test t של הסטודנט, * P <0.05 (שים לב שזה פורסם בעבר נתונים, שינוי מ -17). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | 664 | 8-10 weeks old |
| Isoflurane – Fluriso | VET one, Boise, ID | V1 501017 | |
| Buprenorphine – Buprenex | Reckitt Benckiser Healthcare | NDC 12496-0757-1 | 0.3 mg/ml solution |
| Betadine | Owens and Minor, Mechanicsville, VA | 2047PVP202 | |
| 5-0 Vicryl sutures | Ethicon, Summerville, NJ | J493 | |
| Tegaderm Film, 6 cm x 7 cm | 3M | 1624W | Cut in half to properly cover burn site |
| µCT - GE eXplore Locus SP | GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada | ||
| Microview 2.2 Advanced Bone Analysis Application | GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada |
References
- Leblanc, E., et al. BMP-9-induced muscle heterotopic ossification requires changes to the skeletal muscle microenvironment. J Bone Miner Res. 26 (6), 1166-1177 (2011).
- Shore, E. M. Osteoinductive signals and heterotopic ossification. J Bone Miner Res. 26 (6), 1163-1165 (2011).
- Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. J Bone Miner Res. 27 (5), 1004-1017 (2012).
- Potter, B. K., et al. Heterotopic ossification following combat-related trauma. J Bone Joint Surg Am. 92, Suppl 2. 74-89 (2010).
- Van den Bossche, L., Vanderstraeten, G. Heterotopic ossification: a review. J Rehabil Med. 37 (3), 129-136 (2005).
- Chakkalakal, S. A., et al. An Acvr1 R206H knock-in mouse has fibrodysplasia ossificans progressiva. J Bone Miner Res. 27 (8), 1746-1756 (2012).
- Yu, P. B., et al. BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic [corrected] ossification. Nat Med. 14 (12), 1363-1369 (2008).
- Culbert, A. L., et al. Alk2 regulates early chondrogenic fate in fibrodysplasia ossificans progressiva heterotopic endochondral ossification. Stem Cells. 32 (5), 1289-1300 (2014).
- Dinther, M., et al. ALK2 R206H mutation linked to fibrodysplasia ossificans progressiva confers constitutive activity to the BMP type I receptor and sensitizes mesenchymal cells to BMP-induced osteoblast differentiation and bone formation. J Bone Miner Res. 25 (6), 1208-1215 (1359).
- Peterson, J. R., et al. Burn injury enhances bone formation in heterotopic ossification model. Ann Surg. 259 (5), 993-998 (2014).
- Scott, M. A., et al. Brief review of models of ectopic bone formation. Stem Cells Dev. 21 (5), 655-667 (2012).
- Tannous, O., Griffith, C., O'Toole, R. V., Pellegrini, V. D. Heterotopic ossification after extremity blast amputation in a Sprague-Dawley rat animal model. J Orthop Trauma. 25 (8), 506-510 (2011).
- Tannous, O., et al. Heterotopic bone formation about the hip undergoes endochondral ossification: a rabbit model. Clin Orthop Relat Res. 471 (5), 1584-1592 (2013).
- Peterson, J. R., et al. Treatment of heterotopic ossification through remote ATP hydrolysis. Sci Transl Med. 6 (255), 255ra132 (2014).
- Peterson, J. R., et al. Early detection of burn induced heterotopic ossification using transcutaneous Raman spectroscopy. Bone. 54 (1), 28-34 (2013).
- Perosky, J. E., et al. Early detection of heterotopic ossification using near-infrared optical imaging reveals dynamic turnover and progression of mineralization following Achilles tenotomy and burn injury. J Orthop Res. 32 (11), 1416-1423 (2014).
- Peterson, J. R., et al. Effects of Aging on Osteogenic Response and Heterotopic Ossification Following Burn Injury in Mice. Stem Cells Dev. , (2014).
- Alfieri, K. A., Forsberg, J. A., Potter, B. K. Blast injuries and heterotopic ossification. Bone and Joint Research. 1 (8), 174-179 (2012).
- Hunt, J. L., Arnoldo, B. D., Kowalske, K., Helm, P., Purdue, G. F. Heterotopic ossification revisited: a 21-year surgical experience. J Burn Care Res. 27 (4), 535-540 (2006).
- Ring, D., Jupiter, J. B. Operative release of ankylosis of the elbow due to heterotopic ossification. Surgical technique. J Bone Joint Surg Am. 86-A, Suppl 1. 2-10 (2004).
- Crane, N. J., Polfer, E., Elster, E. A., Potter, B. K., Forsberg, J. A. Raman spectroscopic analysis of combat-related heterotopic ossification. Bone. 57 (2), 335-342 (2013).
